第一篇：生物技术实验心得
姓名：吴伙福
学号：11120222
班级：11（生）2
实验心得体会
我觉得生物技术实验它的目的在于锻炼我们的实际动手能力，让我们熟悉各种仪器的使用及实验的各种规范操作。我认为要想学好这门实验课，首先，在做实验前，一定要事先对将要做的实验进行预习，记下有疑问或不懂得地方，因为这是做实验的基础，否则，在老师讲解时就会听不懂，这将使你在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间。比如做蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离的实验，你要清楚水解蛋白质的方法和纸层析的基本技术，如果你不清楚，在做实验时才去摸索，这将使你极大地浪费时间,使你事倍功半。做实验时，一定要亲力亲为，务必要将每个步骤，每个细节弄清楚，弄明白实验后，还要复习思考，这样你的印象才深刻，记得才牢固，否则，过后不久你就会忘得一干二净，这还不如不做。做实验时，老师还会根据自己的亲身体会，将一些课本上没有的知识教给我们，拓宽我们的眼界，使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛。
通过那些实验，使我学到了不少实用的知识，更重要的是，做实验的过程，思考问题的方法，这与做其他的实验是通用的，真正使我们受益匪浅。在实验的过程中我培养自己的独立分析问题，和解决问题的能力。不在像以前做实验那样很随便，总是抱着等老师教你怎么做，拿同学的报告去抄。尽管你成绩也许会很高，但对将来是不利的。我觉得实验课还是有必要认真去学的，很多东西也许你现在觉得没用，但是它可能潜移默化的影响着你。
最后我觉得老师的指导也是很有必要的，学生们必然会有问题，老师偶尔的启发就可能让同学豁然开朗。但是更多的还是得靠我们自己，我们也要注意与老师互动，这样才会使我们不仅能学好实验课也能增进与老师的感情。
第二篇：生物技术实验心得体会
生物技术实验心得体会
基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。
可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
一.目的基因的获得
目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选
PCR方法
PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。
化学合成法制备基因片段
采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。
二、重组质粒的构建
DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
三、重组分子的扩增和鉴定
重组DNA分子导入受体细胞
目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化。
重组DNA分子的鉴定
重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增，扩增后的重组DNA分子是否正确，导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段，重组DNA分子能否表达插入的目的基因，一般可以采用X-gal筛选的方法对重组DNA分子进行鉴定。
四、实验中的注意事项
1、大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备：
1)接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。2)培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。
3)在加热过程中应不断搅拌，以防琼脂粉沉淀糊底烧焦，并应控制火力，以免培养基起泡而溢出容器。
4)注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。
5)严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标（温度、压力、时间）对培养基、器皿灭菌，确保灭菌彻底。
2、大肠杆菌工程菌平板培养：
1)划线分离时，挑菌量要小，严格无菌操作，避免环境中的杂菌污染。2)画线时接中环圈内不能有菌膜产生，会造成接种数过多，结果不明显。
3、PCR扩增目的基因片段：
1)PCR体系所加成分的实际用量，应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。2)加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。
3)Taq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。
4、回收目的基因与载体连接：
1)注意调转速 2)敞开管盖放置
3)向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液TE（洗脱缓冲液TE需使用前60℃水浴预热）
4)盖好管盖，静置10min
5、大肠杆菌液体培养:
1)接种环节应严格进行无菌操作。
2)实验中要注意细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。密度过高或不足均会使转化率下降。菌体密度与震荡培养的转速密切相关，根据测定的菌液OD值调整培养时间。
3)接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明菌种、日期、组别、姓名等。
6、大肠杆菌感受态细胞制备及转化: 1)所有操作均应在无菌条件和冰上进行。
2)所使用的器皿必须经过灭菌。并且要防止迹量的去污剂或其它化学物质、杂菌、DNA酶或杂DNA所污染，否则会大大降低细菌的转化效率。
3)注意转化的质粒 DNA 的质量和浓度。当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。
4)实验所用的溶液最好用3次蒸馏水配制。
7、筛选重组转化菌落:
1)在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。不是一开始就4℃，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4℃之后会进一步显色。2)当出现蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑即卫星菌落的时候，可以小心挑取中间的那个菌落，有可能是阳性克隆。
3)要注意培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。4)培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。
8、菌液PCR分析: 注意移液枪正确的使用方法，各种量程的调试，一般以接近最大量程的为准。
9、取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析
1)《质粒小量提取试剂盒》进行质粒的提取的第三步和第四步之间的时间，操作要流畅快速，决定了实验成败
2)禁止吸出沉淀
五、总结
在分子生物学中，基因克隆是一种常用的技术。其中关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。
基因工程是把双刃剑。如果不加节制的使用基因工程，让它去为你包治百病，那样你的整体免疫系统也将发生错乱，让你完全可以抵挡的疾病访问造成你的死亡。如果人们想造什么动物就造什么动物，让这些动物急速的泛滥，动物的天敌关系，人类的生态平衡都将被破坏，动物也将超过人类，霸占我们赖以生存的地球。而且，若是谁都想起死回生，我想终有一天我们将因为人口泛滥而灭亡。
基因工程知识一种让科技发展的手段，而不是我们的目的，我们要遵循自然规律，正确的对待基因工程，正确的对待生活。
第三篇：《园艺植物生物技术》实验教案
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的
实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？实验二 质粒DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。
二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
三、主要仪器及试材
含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。
液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制:
1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。
2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。
3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。
4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。
5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。
7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。
8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。
10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。
12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml
13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。
（二）实验步骤
1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。
2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。
3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。
4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。
5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。
6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。
7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。
8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。
9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。
10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。
五、实验注意事项
1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。
2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。
3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。
六、思考题
简述质粒DAN提取的步骤。
实验三 PCR技术
一、实验目的
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。
二、实验原理
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
三、主要仪器及试材
含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。
四、实验方法与步骤
1、调整模板浓度至5ng/ul。
2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。
Template DNA
2ul（20ng）10×buffer
2.0ul MgCl2（25mM）
1.5ul Primer F（10uM）
0.2ul Primer R（10uM）
0.2ul dNTPs（2mM）
2.0ul Taq（5U/ul）
0.2ul Add ddH2O to
20ul
3、PCR反应循环条件设置：
95℃
3min
1cycle 94℃
1min
55℃
1min 72℃
90s
35cycles 72℃
10min
1cycle 4℃
forever
4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳
5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
五、实验注意事项
1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；
2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；
3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件；
4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。
六、思考题
简述PCR技术的原理和步骤。
第四篇：《园艺植物生物技术》实验教案
《园艺植物生物技术》实验教案
实验一 现代生物技术实验室与实验仪器
一、实验目的
实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代分子生物学实验室的规划与布局及常用仪器设备的主要功能的认识，掌握高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等关键仪器的使用方法。
二、实验场所选择及实验内容
园艺学院植物分子生物技术实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要相关仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭菌锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、实验方法与步骤
1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。
2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问。
四、实验注意事项
实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。
五、思考题
1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。
2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？
实验二 植物组织培养
一、实验目的
植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。
二、实验原理
基于1902年德国科学家哈勃兰特（Haberlandt）提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。
三、主要仪器及试材
仪器：pH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等
试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂
四、实验方法与步骤
（一）培养基母液的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：
1、大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。
KNO
395 g NH4NO3
82.5 g KH2PO
48.5 g MgSO4•7H2O
18.5 g CaCl2•2H2O
22.0 g 注意事项：
（1）配置母液前要仔细清洗存储容器
（2）应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；（3）溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；
（4）夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；
（5）沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的浑浊型沉淀，所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。
2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：
KI
0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O
0.86 g NaMoO4*2H2O
0.025 g CuSO4*5H2O
0.0025 g CoCl2*6H2O
0.0025 g
MnSO4*4H2O
2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。
3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：
甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L
4、铁盐的配制（100倍液）：
称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。
5、维生素B的配制（100倍液）：
VB组分 VB1(盐酸硫氨素)VB6(盐酸吡哆素)VB5(烟
酸)
改良MT 1g 1g 0.5g
MS 10 mg 50 mg 50 mg 分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1L。
注: 需要溶解完一个再加另一个；VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。
6、Vc的配制（100倍液）：
称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1L即可。
7、其它溶液配制：
BA，NAA，IBA，GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH彻底溶解，再加水定容。配好后室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。
注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在制作培养基时使用。这样不容易产生沉淀。
（二）培养基配制
母液配好后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1L,调节pH至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。
大量元素(10倍液)
ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)
ml 铁盐（100倍）
ml 维生素B（100倍）ml Vc（100倍）
ml 蔗糖
g 琼脂
7.5 g
（三）接种与培养
在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。
五、实验注意事项
1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。
2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。
六、实验结果处理
一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。
七、思考题
影响植物组织培养的因素有哪些？
主要参考文献
1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的建立。植物学通报,2005，22:37-42。
2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验三 植物DNA的提取、纯化及检测
一、实验目的
DNA 提取是开展分子生物学的重要前提之一，高质量的DNA直接关系到分子标记、基因克隆、图谱构建及功能基因组研究等工作的成败。通过本实验应了解常用DNA提取方法的原理和技术，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA检测技术，为将来从事园艺植物生物技术研究奠定基础。
二、实验原理
植物的遗传物质是DNA，植物细胞内含有丰富的遗传物质。在机械研磨、高温和去污剂的共同作用下，植物细胞破裂，DNA从细胞核释放到提取缓冲液中。经蛋白质强变性剂处理结合离心，除去蛋白质和色素等杂质，再用乙醇沉淀便可获得高纯度的DNA。
DNA电泳是依据DNA带负电荷，而不同浓度的琼脂糖凝胶孔径大小不同，在外加电场的作用下DNA由负极向正极移动，分子量小的移动快而分子量大的移动慢，最终达到不同分子量大小的DNA分离的目的。
三、主要仪器及试材
水浴锅、离心机、移液枪、研钵、离心管、核酸电泳系统等；新鲜健康植物叶片，液氮、及DNA提取有关试剂。
四、实验方法与步骤 1.药品的配制: CTAB提取液：
(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇，混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）：
重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4℃冰箱中储存备用。2.DNA的粗提
在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用尖头玻棒将材料研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000 rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰冻无水乙醇1 ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000 rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000 rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。3.DNA的纯化：
向风干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小时，然后加入700 µl苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700 µl氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 –12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 µl 5M NaCl，再加入1 ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小时后换一次，后浸泡过夜，8000 rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100 µl TE充分溶解备用。
4、DNA检测
（1）取DNA原液15 µl稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7 （3）向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5 U/µg DNA，37℃消化过夜，用0.5×TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。 五、实验注意事项 1、实验中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危险或有毒物质，操作时要戴手套，并在专门区域操作。 2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。 六、思考题 简述DAN提取的步骤及主要试剂的作用。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。实验四 质粒DNA的提取、纯化及检测 一、实验目的 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取时最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例介绍质粒的抽提过程，应掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 二、实验原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三、主要仪器及试材 含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液及离心机、移液枪、离心管及质粒DNA提取有关试剂。 液氮、及DNA提取有关试剂。 四、实验方法与步骤 （一）试剂配制: 1、LB培养基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，琼脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分装至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高压灭菌15min，室温贮存。 2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。 3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水中，定容至5ml，过滤灭菌后-20℃保存。 4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去离子灭菌双蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。 5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配制。 7、溶液III:醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（视冰醋酸情况，也可按6:3:1配制），贮存于4℃。 8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 9、苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。 10、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。 12、溴化乙锭（EB）：10mg/ml 13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装贮存于-20℃。14、6×loading buffer（上样缓冲液）:0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖与三角烧瓶中，加100ml 1×TBE，微波炉加热至完全熔化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TBE），即可上样。 （二）实验步骤 1、取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LB固体培养基上划线37℃过夜培养。 2、用无菌牙签或枪头挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20ml含有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床-250r/min过夜培养。 3、吸取1.5ml菌液，12000g离心1min，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净。 4、加入200ul预冷的溶液I，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底混匀沉淀或碎块）。 5、加入400ul新配置的溶液II，轻柔颠倒混匀（不可剧烈震荡），并将离心管置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液II为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 6、加入300ul预冷的溶液III，温和颠倒混匀，见白色絮状沉淀，置于冰上3-5min，使杂质充分沉淀（溶液III为中和液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀）。 7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇或2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，室温放置5min，4℃离心12000g ×15min。 8、倒尽上清，加75%乙醇浸洗沉淀除盐1-2次，4℃离心 10000g×10min，弃上清，将沉淀在室温或超净工作台上风干。 9、将沉淀溶于40ul 灭菌超纯水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存备用。 10、取制备的质粒DNA 1-2ul，加适当loading buffer混匀上样，1%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳1h进行检测。 五、实验注意事项 1、实验中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物质，操作时应注意防护，尽量减少台面污染。 2、DAN电泳时只能由负极到正极，电泳时要注意电极是否正确。 3、质粒电泳检测一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 六、思考题 简述质粒DAN提取的步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料）。 实验五 PCR技术 一、实验目的 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中常用技术之一。PCR具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。通过本实验应掌握PCR原理，学习PCR操作过程。 二、实验原理 PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在环境下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。 三、主要仪器及试材 含有外源cDNA片段的质粒或转基因苹果、番茄叶片总DNA；外源基因的特异引物及PCR仪与相关试剂。 四、实验方法与步骤 1、调整模板浓度至5ng/ul。 2、按下列体系配制反应混合液，混匀，离心5秒（注意加1滴矿物油覆盖PCR管）。 Template DNA 2ul（20ng）10×buffer 2.0ul MgCl2（25mM） 1.5ul Primer F（10uM） 0.2ul Primer R（10uM） 0.2ul dNTPs（2mM） 2.0ul Taq（5U/ul） 0.2ul Add ddH2O to 20ul 3、PCR反应循环条件设置： 95℃ 3min 1cycle 94℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 90s 35cycles 72℃ 10min 1cycle 4℃ forever 4、检测：加2ul溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15ul反应产物点样电泳 5、在1%琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。 五、实验注意事项 1、引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次； 2、PCR反应的各种成分不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作； 3、根据引物的Tm值和扩增片段长度以及PCR仪的特性来设定PCR循环条件； 4、注意分析电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。 六、思考题 简述PCR技术的原理和步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料 实验六 PCR产物的TA克隆 一、实验目的 采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果树上常用的分子克隆方法。相对于粘性末端来说，克隆具有平末端的双链PCR产物效率较低。目前，有两种方法可以采用，一种是在特异引物设计时引入酶切位点，另一种是TA克隆。通过本实验应掌握PCR产物TA克隆的原理，学习PCR产物纯化及回收，以及PCR产物与TA克隆载体的连接。 二、实验原理 TA克隆是利用耐热聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校准活性，即在PCR产物的两个3’末端加上未配对的单一A凸出尾，质粒载体提供线性3’末端单一的T凸出尾，使该载体能够直接与PCR产物高效连接。TA克隆技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。 三、主要仪器及试材 PCR扩增产物、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Promega公司）、pMD18-T载体（TaKaRa公司）以及感受态大肠杆菌、高速冷冻离心机、移液枪、琼脂糖凝胶电泳等相关仪器及试剂。 四、实验方法与步骤 1、PCR扩增片段纯化回收 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒收集PCR扩增产物，具体操作步骤参考试剂盒说明书进行。 2、连接反应 反应体系组成 pMD18-T 0.5-1.0 ul PCR fragment 1.0-4.5 ul ddH2O 0-3.0 ul Ligation Solution I 5.0 ul 混合后，置于室温下放置数小时或过夜连接。 3、重组子转化（热激法） 1）在含适当浓度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上； 2）冰上冷冻新灭菌的1.5 ml 离心管； 3）取出感受态大肠杆菌，冰上放置冻融； 4）取新灭菌的1.5 ml 离心管，加入50 ul感受态细胞和10 ul连接反应液，用移液枪轻轻吸打均匀，在冰上放置30 min； 5）热激：将离心管在42 ℃下水浴90秒钟。请勿摇动离心管； 6）冰镇：快速将离心管转移至冰浴，1-2分钟； 7）复苏：每管加400 ul液体LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均匀涂布于“1）”已制备好的LB平板上； 9）培养：在37 ℃下倒置培养12-16 h，即可观察到蓝白相间的菌落。白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色是载体自连的转化子。转化子可以在4 ℃下保持1个月； 10）单菌落培养：用灭菌的牙签，挑选白色的单菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液体LB培养基的50 ml离心管中，在37 ℃摇床上培养过夜（12-16 h）。 4、质粒DNA的分离 参考有关文献。 5、检测 采用相同的引物对进行PCR再扩增，或质粒上根据插入片段两端的酶切位点而进行限制性酶切，通过电泳可以检测出片段是否克隆成功。 五、实验注意事项 1、连接温度不宜太高，连接温度过高（>28℃）可使背景增加，使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率； 2、热激过程注意勿摇动离心管。 六、思考题 简述PCR产物TA克隆的原理和步骤。 主要参考文献 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课题组内部资料。 20XX年3月1日我们怀着欣喜的心情来到了裕通生物技术有限公司并进行为期3个月的实习生活，这次实习让我们感受到了集团的企业文化。工作中有苦也有乐，但更多的是收获，这次实习我们受益匪浅。古人云：“纸上得来终觉浅，要知此事必躬行”。这是一次理论与实践相结合的实习，把理论应用到实践当中并在实践中积累更加丰富的理论知识。在公司领导和指导老师的帮助下我们圆满的结束了实习。就3个月的实习我总结了如下几点： 1、心态转变。学校的生活养尊处忧，无需我们担忧某些问题，学校三点一线的生活，学习跟得上就可以，而在工作当中就不然，工作中，我们要考虑如何提高工作效率，怎样处理与上级领导、同事的关系，还有在工作当中的不尽人意等事情，这些都要我们以一颗平常心去对待，及时的转变心态会让我们工作更加顺利。 2、计划做事。有了明确的计划，目标才清晰，以至于在工作中不会茫然。在合成部实习的三个多月中，我每天都写工作日志，记录下我要做的事情，然后再总结一下完成状况，日志看似平常，但在无形中提高你做事的效率和工的有序程度。 3、不以事小而不为。做大事小事有不同的阶段，要想做大事，小事情必须做好。我们正是实习的阶段，做一些繁琐的小事情，很有必要。工作中我们每个人干的最多的就是打水、拖地和擦桌子，但我并没有感到烦，而是把它当作我素质培养的大讲堂，正因为这些小事情改变了办公室的环境。这些小事情值得我去做。事情虽小，可过程至关重要。 4、以上是我在实习中的一些体会，同时在实习的过程中我也发现自己还存在一些缺点，如：性子急、愿意推托等毛病，正确的对待自己的缺点和错误，才会使自己的能力提升的更快。 5、三个月的实习生活就要结束了，在理论与实践的磨合中我们显得比来时更加成熟和稳重，我们又多了一些实践经验。在一个竞争激烈，就业困难的环境中，我们先行的这一步已经为我们奠定了一定的基础，在以后的职业实战中，我们会打的更响、更漂亮! 6、一个多月的实习期很快就过去了，美好的东西总是稍纵即失。在此，我要感谢所有为我的实习提供帮助和指导的领导老师们，感谢你们这么多天的照顾和帮助。相信这次珍贵的实习经历会一直伴随着我以后的工作生活。千里之行，始于足下，我会通过这次实习，更加懂得知识和实践的积累，不断充实自己。第五篇：生物技术有限公司实习心得
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