DH5α感受肽细胞制备

第一篇：DH5α感受肽细胞制备

感受态细胞的制备

一、实验试剂及材料 1.AMP－ LB液体培养基

2.0.1M CaCL2溶液； 3.AMP+固体培养板

4.DH5α大肠杆菌；

5.10ml玻璃试管、牙签、5ml刻度吸管、1.5ml离心管、150ml三角烧瓶均需高压灭菌； 6.20µl枪头、200µl枪头、1000µl枪头及加样器（法国Gilson公司）。

二、实验设备 1.YJ-875医用净化工作台

2.CF16RX低温高速离心机

3.HH.B11-500型电热恒温培养箱

4.BCD-216KF冰箱

5.CHB-100恒温金属浴

三、实验方法

(一)DH5α大肠杆菌活化（注意无菌操作）1.实验前30分钟紫外消毒净化工作台。2.取两只高压过的10ml玻璃试管，向其中各加入3ml AMP-LB液体培养基。3.用无菌牙签挑取少量冻存DH5α大肠杆菌菌液，加入到试管中。4.将试管固定于37℃预热的空气浴振荡器中，200-250转∕分，过夜振荡培养。(二)DH5α大肠杆菌增殖（注意无菌操作）5.实验前30分钟紫外消毒净化工作台。6.取20ml AMP-LB液体培养基（根据所要制备的感受态的量确定AMP-LB液体培养基的体积）加入到150ml三角烧瓶中。7.取200µlDH5α大肠杆菌（与AMP-LB液体培养基的体积比为1:1000）菌液加入到三角烧瓶中。

8.将三角烧瓶固定于37℃预热的空气浴振荡器中，200转∕分，振荡培养至菌液呈现均匀细沙状。（约1-1.5小时）

(三)（大量或小量）制备感受态细胞

100X100µl感受态

15.实验前30分钟紫外消毒净化工作台。制冰

1kg。

16.取1.5ml

（二）中的DH5α大肠杆菌菌液加

入到1.5ml离心管，根据实验具体要求确定管数。

17.4℃ 4000g 离心10分钟。

18.弃上清，向各1.5ml离心管中加入冰预冷的0.1M CaCL2溶液500µl，混匀后置于冰上10分钟。

19.4℃ 4000g 离心10分钟。

20.弃上清，向各1.5ml离心管中加入冰预冷的0.1M CaCL2溶液100µl，混匀后置于4℃冰箱内备用。

第二篇：代谢物及细胞感受代谢物异常与肿瘤发生发展

“代谢物及细胞感受代谢物异常与肿瘤发生发展”重大项目指南

细胞代谢的改变是肿瘤的重要特征之一。大量研究发现肿瘤细胞发生了代谢重编程，并且对肿瘤代谢的认识已经不再局限于糖酵解和三羧酸循环的改变，诸多代谢通路包括脂肪酸代谢、胆固醇代谢、谷氨酰胺代谢、丝氨酸代谢、一碳单位代谢、胆碱代谢等，在肿瘤细胞中均发生了重编程变化。随着肿瘤生物学研究的不断深入，细胞代谢异常在肿瘤发生发展中的作用研究已成为活跃的国际学术前沿，细胞代谢异常先于肿瘤发生的理论也逐步在研究中得到了证实。近年来，研究发现葡萄糖缺乏可促进KRAS野生型的细胞获得KRAS及其信号通路分子的突变，首次证明细胞代谢异常可以导致原癌基因突变。2-HG竞争性抑制多种α-KG依赖的双加氧酶活性（如：介导DNA氧化去甲基化的Tet双加氧酶），以及其他表观遗传调控相关的酶（如：组蛋白去甲基化酶）等，从而影响表观遗传调控，启动肿瘤的发生、影响肿瘤的进展。这些研究发现提供了代谢改变可以促进肿瘤发生的直接证据，而且其调控的关键节点也正在成为肿瘤诊断和治疗中潜在的靶点。基于肿瘤代谢改变的研究成果，将为肿瘤的分子诊断、精确分型、预后分析、靶向治疗和药物反应性等提供重要的理论指导。

肿瘤代谢改变与肿瘤发生发展之间的关系涉及复杂的生物学过程和多种分子机制，而代谢物及细胞感受代谢物异常在其中的作用日益受到关注。例如:代谢产物乳酸可以直接增加某些蛋白的稳定性，从而促进细胞增殖和血管新生；肿瘤细胞能感受环境代谢物变化，增加肿瘤侵袭转移相关蛋白的合成；肿瘤细胞还能调整自身的能量感受通路，增强对代谢压力的适应，提高在低营养状态下的存活率，是肿瘤产生抗药性的因素之一。此外，肿瘤细胞还通过与免疫细胞竞争营养，而抑制抗肿瘤免疫，如：肿瘤细胞糖酵解增高可以引起肿瘤微环境中T细胞营养不良，抑制T细胞肿瘤免疫；调控胆固醇代谢途径可提高肿瘤特异的细胞毒T细胞的活性，增强抗肿瘤细胞免疫。肿瘤代谢研究的领域已进一步扩展到肿瘤微环境，以及对肿瘤免疫的影响。因此，发现代谢物异常、了解细胞如何感受代谢物异常、代谢异常对细胞的恶性转化作用以及对肿瘤免疫微环境的改造等是重要的前沿科学问题，阐明其内在的分子机制将为肿瘤预防、早期诊断和治疗提供新思路。

本立项拟以发现与肿瘤发生相关的代谢物为切入点，研究重要代谢物异常在细胞恶性转化中的作用及其分子机制；明确细胞感受代谢物失调的机制及其在肿瘤发生发展中的意义；探索代谢异常对肿瘤微环境的改造及其生物学效应和机制。从而阐释代谢异常在肿瘤细胞及其微环境的基因表达与信号转导中的作用和地位，深入理解代谢物（或包括相关代谢酶）和细胞感受代谢物失调在肿瘤发生发展中的功能与机制，为临床转化提供新的诊断靶标与治疗靶点。本项目的实施对促进代谢生物学、化学、免疫学与肿瘤学基础和临床研究的学科交叉，具有重要的意义。

一、科学目标

以我国常见高发的1-2种肿瘤为模型，发现一批在肿瘤发生发展中有明确调控作用的重要代谢物，研究这些代谢物异常在细胞恶性转化中的作用及其机制,确定代谢物和细胞相互作用失调在肿瘤发生中的作用与机制，解析代谢物对肿瘤细胞信号转导与基因表达的调控功能，阐明代谢异常对肿瘤微环境的改造及其生物学效应，建立适于转化研究的代谢物体外及体内研究的实验平台，发现可能用于肿瘤临床诊断的代谢物分子标记物，鉴定可能具有肿瘤临床治疗前景的代谢物分子靶标。

二、研究内容

选择我国常见高发的1-2种肿瘤为模型，开展如下四方面的研究：

（一）肿瘤相关代谢物的发现：采用高通量代谢组学、蛋白组学和生物信息学等检测手段，发现、筛选和鉴定一批与肿瘤表型特征密切相关的代谢物；运用细胞模型、荷瘤小鼠及转基因小鼠等动物模型，证实其体内外对正常细胞的恶性转化作用。

（二）代谢物诱导细胞恶性转化的机制：建立适于转化研究的代谢物体外及体内研究的实验平台，研究前期验证的肿瘤相关异常代谢物诱导细胞恶性转化的机制，包括表观遗传调控、转录调控、翻译后修饰以及信号转导通路等。

（三）肿瘤细胞感受代谢物的调控：综合运用生物化学、细胞生物学及分子生物学等方法，鉴定肿瘤细胞感受特定代谢物的受体，解析肿瘤细胞感受细胞内外代谢物的通路变化及其对代谢活动的影响，以及在不同营养状态下，肿瘤细胞感受代谢物相关通路的调控作用。

（四）代谢异常对肿瘤微环境的改造及其生物学效应：研究代谢异常（代谢物或相关代谢酶变化）对肿瘤微环境的影响，特别是对微环境炎症细胞、肿瘤相关免疫细胞的募集、激活和功能的调控，阐明代谢异常对肿瘤微环境的改造作用、其产生的生物学效应和对肿瘤发生发展的影响。

三、申请注意事项

（一）本重大项目要求针对上述四部分研究内容，分别设置4个课题。

（二）申请书的附注说明选择“代谢物及细胞感受代谢物异常与肿瘤发生发展”（以上选择不准确或未选择的项目申请将不予受理）。

（三）申请人申请的直接费用预算不得超过1530万元/项（含1530万元/项）。

（四）本项目由医学科学部、生命科学部和化学科学部联合提出，由医学科学部负责受理。

第三篇：在细胞苗生产中使用培养基的几点感受

在细胞苗生产中使用培养基的几点感受

山西

宋宝敏

生物制品的生产离不开细胞培养, 细胞培养基是细胞培养的重要因素。目前，国内尚没有关于细胞培养基生产的国家或行业标准，培养基生产企业执行各自的企业标准，细胞培养基生产的质量管理存在较大差别。有一个系统全面的统一标准，可以相对统一培养基质量。

多数细胞的培养采用合成培养基，而且还需要在合成培养基中添加一定量的血清来支持细胞的生长增殖。培养基和血清这两个原辅材料的质量直接关系到产品的质量。

我们企业生产所使用的细胞培养基大多为MEM或DMEM合成培养基，添加一定比例的血清来进行。在生产过程中，毒种和细胞的种类不变，生产的过程是按 GMP的要求进行检查评定的，这两个环节相对于产品的影响相对小，但细胞培养基更换批号或更换厂家，血清批次间的差异经常出现影响细胞生长的情况。这两样原辅料使用将要结束时车间就要求采供部购买同厂家、同批次的培养基及血清（在有效期内），否则必须先提供小样来先试验。这样不仅给采供带来购买难度，而且采购周期会很长，同时一个“换批次会影响质量”的信息潜在操作人员的意识里，即使同厂家的培养基经验证对细胞生长几乎没影响，由于潜意识往往造成细胞培养过程中总感觉不如原来使用的批次，要经过一段时间的使用才能转过来。

在实际生产时，因培养基相对容易购买，所以基本在开产前根据生产计划把一个周期的量基本备足。而血清则不同，每批可能适合某些细胞系，一旦准备更换批号，更不用说更换厂家了，必须做连续三到五批的生长试验，通过细胞的生长情况和细胞数选定血清批次。此处有一更换批号后细胞数对比数据(恕不写明厂家）。两个批号A和B

4三次试验的细胞数，A批号血清对应细胞数为（1）207×10（2)189×104（3）203×104

B批号血清对应细胞数为（1）197×104（2)181×104（3）192×104。

血清因为价格贵等原因总得在一个周期内至少换两个批号。另一个因素是在加血清的培养基采用微孔滤膜过滤除菌时经常出现滤器被杂质堵塞的情况，这时就需要有备用滤器，同时容易污染。不仅如此好多资料表明血清的添加有好多缺点：

1、血清都是批量生产，各批之间差异很大；

2、血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶、补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；

3、血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成；

4、血清质量问题还会对接种病毒以及毒价产生影响，例产毒少，毒价低；

5、血清内含有杂质等等说法不一。

鉴于上述使用情况，看来培养基的生产有必要有一个统一的质量标准和控制方法。尤其是细胞培养基的生产，不仅要有统一的质量标准和控制方法，更要不断有新的培养基产品的推出，好多厂家日益重视对无血清培养基的研发，这是一个有重大意义的工作，在原有培养基的基础上添加成分明确或部分明确的血清替成分。疫苗生产企业期待新型无血清培养基的上市，无血清培养基可以避免血清的批间质量变动对细胞生长的影响，可以降低企业的实验成本、储存成本损耗及采供难度；还可以提高产品的表达水品易于细胞纯化，在操作过程中易于灭菌。但同时企业更关注这种产品的质量，这样就又提到对培养基的生产企业有一国家的统一质量标准和控制方法，并附带培养基使用的统一的SOP。使用这样的原辅料的企业，企业的产品才更容易均

一、稳定、质量可控。

第四篇：DF-1鸡胚成纤维传代细胞的染色体制备及核型分析、致瘤性试验研究方案

DF-1鸡胚成纤维传代细胞的染色体制备及核型分析、致瘤性试验研究方案

材料与方法 细胞 DF-1细胞、CEF细胞、Hela细胞。裸鼠 2月龄（或体重18～22g）、或乳鼠（3~5日龄）、或小鼠（8~10g）。细胞营养液 细胞生长液为无血清培养基。细胞染色体制备和核型分析

4.1 染色体标本制备 按常规方法分别将DF1细胞进行秋水仙素处理、细胞消化与低渗处理、细胞固定与在固定、滴片与染色。

4.2 染色体特征及数目、细胞核型分析 取有丝分裂中期的细胞进行姬母萨染色检查，（总共需要150个视野的图片）。细胞致瘤性试验

5.1 细胞样品的制备 按常规方法制备好DF-1细胞。

5.2 阳性对照细胞 将Hela细胞经胰酶消化分散，离心收集细胞。制成含活细胞数约106cells/0.2ml的细胞悬液。

5.3 阴性对照细胞 按常规方法制备的鸡胚成纤维细胞（CEF），制成含活细胞数约107cells/0.2ml的细胞悬液。

5.4 致瘤性试验

5.4.1和5.4.2任选其一。

5.4.1 将细胞样品分别皮下注射裸鼠30只，每只107 cells /0.2ml细胞。

5.4.2 取3~5日龄乳鼠或8~10g小鼠，用抗胸腺血清处理后，将细胞样品分别皮下接种18只，每只107 cells /0.2ml细胞。

5.4.3 阳性对照 每只裸鼠皮下或肌肉注射106 cells /0.2ml，共注射5只裸鼠，为阳性对照。（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。

5.4.4 阴性对照：每只裸鼠皮下注射107 cells /0.2ml，共注5只裸鼠，为阴性对照。（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。

5.5 实验动物检查及处理

5.5.1 逐日观察至14日，检查有无结节或肿瘤形成。如有结节或可疑病灶，应在观察至少7～14日后剖检，进行病理组织学检查。

5.5.2 未发现结节的动物，对其中的一半动物观察21日后剖检，另外一半动物观察12周后剖检，观察各个淋巴结核器官中是否形成结节，如有怀疑，应进行病理组织学检查。不应有移植瘤形成。

5.5.3 阳性对照组观察21日后，应出现明显的肿瘤。

5.5.4 阴性对照组观察21日，应为阴性。

试验要求提供以上的图片