猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

第一篇：猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

唐先春1, 吴 斌1*, 索绪峰2, 王大林2 ,陈焕春1, 尹争艳1

（1.华中农业大学动物病原微生物实验室, 武汉

430070）

（2.海口市美兰区罗牛山兽医站, 海南

571133）

摘要: 用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurela multocida, Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PCR检测为T+Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定，也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T+Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。关键词: 多杀性巴氏杆菌； 产毒多杀性巴氏杆菌；PCR；分型；药敏试验

中图分类号: S852.61+2

文献标识码: A

文章编号: 0366-6964(2005)0

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）是一种重要的病原，可以导致猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。产毒多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）是猪进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)的主要病原菌。该病是养猪业的一种重要传染病，其主要表现为：慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩或由于经常打喷嚏而造成鼻出血。哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔变形、萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓、饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。育肥猪感染本病后，呼吸道的正常结构和功能遭到损害，致使机体抵抗力降低，极易感染其它病原，诸如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流

～感病毒、猪生殖—呼吸道综合征病毒等，引起猪呼吸道综合征，增加猪的死亡率 [14]。

多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A、B、D、E、F 5个血清型。研究表明，T+Pm主要是D型Pm，而且T+Pm主要分离于具有严重PAR症状的猪，从有肺炎症状猪分离的Pm一般是不产毒素的[5, 6]。

T+Pm与T-Pm在形态特征及生化反应特性上没有区别。与PAR密切相关的T+Pm产生一种约145kDa的皮肤坏死毒素（Dermonecrotic toxin, DNT），该毒素由toxA基因编码。一

～般认为T-Pm不会导致PAR，而提纯的DNT可以导致PAR的发生[79]。所以，DNT是诊断及控制PAR的关键，也是区分T+Pm与T-Pm的关键。

基于DNT的特性，已经建立了一些检测方法，以区分T+Pm与T-Pm，如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验[10]、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验[11]、ELISA[5]。但这些毒素检测方法，无论是动物试验还是细胞培养，操作繁琐，费时费力，在临床上的应用都有很大的局限性[5]。随着T+Pm毒素基因的分子生物学研究，以及近年来PCR检测方法的广泛应用，使T+Pm的检测越来越简便、灵敏和完善。材料与方法

1.1酶及主要试剂

收稿日期：2004-04-05 基金项目：国家自然科学基金项目资助（30471292）

作者简介：唐先春（1978-），男，汉，湖北十堰人，硕士，主要从事产毒素多杀性巴氏杆菌方面研究，E-mail:xianchuntang@tom.com。*通讯作者 Tel:027-87288629 Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa；生化鉴定管及药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌的分离

病料来源于海南、湖北、湖南、广东、广西、上海等十多个省市。对于有明显鼻萎缩症状的猪，鼻盘消毒后采其鼻拭子；部分病料是送检的无鼻萎缩症状的猪以及病肺，无菌采其肺组织。将采集的病料划线接种于胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）平皿，37℃培养18～24h后观察，挑取直径1～2mm、透明、光滑、湿润的菌落进行革兰氏及瑞氏染色。革兰氏染色呈红色的细小球杆菌，瑞氏染色呈两极浓染的细菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化及PCR鉴定。1.3 生化鉴定

对于纯化好的可疑菌落按使用说明做以下生化实验：葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR、VP、硝酸盐还原，并接种于麦康凯培养基。1.4 药敏试验

已纯化好的Pm，挑取单菌落接种与脑心浸液（Brain and Heart Infusion, BHI）培养基，培养14h。比浊法记数后，用BHI稀释菌液至终浓度为3.0亿/mL。用灭菌棉拭子在TSA平皿上均匀涂布，待菌液吸收后，贴药敏纸片，37℃培养16～20h,记录结果。1.5 PCR鉴定

1.5.1 本试验所用PCR引物见表1：

表1 本试验所用PCR引物

Table1 PCR primers used in this experiment 引物用途 鉴定Pm 鉴定A型Pm 鉴定B型Pm 鉴定D型Pm 鉴定E型Pm 鉴定F型Pm 鉴定T+Pm 引物编号 KMT1 KMT2 PmA1 PmA2 PmB1 PmB2 PmD1 PmD2 PmE1 PmE2 PmF1 PmF2 TA1 TA2

引物序列（5'—3'）

ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC GAT GCC AAA ATC GCA GTC AG TGT TGC CAT CAT TGT CAG TG CAT TTA TCC AAG CTC CAC C GCC CGA GAG TTT CAA TCC

TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG TCC GCA GAA AAT TAT TGA CTC GCT TGC TGC TTG ATT TTG TC TCG GAG AAC GCA GAA ATC AG TTC CGC CGT CAA TTA CTC TG CTT AGA TGA GCG ACA AGG GAA TGC CAC ACC TCT ATA G

PCR产物/bp

457 1048 758 647 512 852 864 注：以上引物参照文献[12～15]及NCBI上发布的序列设计，由上海生工合成。

Note: All these primers were designed referred to the references of 12～15 and gene sequences published on NCBI.All primers were synthesized by Shanghai Sangon.1.5.2 PCR模板 用接种环挑取单菌落，悬浮于含50µL无菌水的离心管中，100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷却5min，10 000r/min离心2min，上清即为PCR模板。1.5.3 PCR反应体系（25µL）10×Taq Buffer2.5µL，25mmol/1MgCl2 0.5µL，2µmol/LdNTPs 0.5µL，20µmol/L上、下游引物各0.5µL，TaqDNA聚合酶0.5µL，无菌水10µL，模板10µL。1.5.4 PCR反应条件 94℃变性4min，然后进入30个循环：94℃30s、56℃30s、72℃40s，最后72℃延伸10min，PCR产物8℃短时保存。1.5.5 PCR结果观察 取PCR扩增反应产物10µL和5µL分子量标准，加到含EB的0.8%琼脂糖胶中，在80V电压下电泳30min，然后在紫外线灯下观察。1.6 DNT的动物试验检测

1.6.1 豚鼠皮肤坏死试验 待检菌株接种于BHI培养18h，然后12 000r/min离心10min，上清用0.2µm的滤膜过滤。滤液0.2mL注射于体重350～400g健康豚鼠的剃毛背部，观察72h。注射部位皮肤坏死区直径≥5mm为DNT阳性；＜5mm疑似，需复试；无反应或仅轻微红肿者为阴性[6, 10]。

1.6.2 小鼠致死试验 待检菌株接种于TSA培养24h，用灭菌PBS洗脱菌苔并稀释至1010cfu/mL，菌液置于冰浴中超声破碎3次，每次10s。裂解物12 000r/min离心30min，上清依次用0.45µm和0.22µm过滤，0.5mL滤液腹腔接种于20g左右的BALB/C小鼠。每株菌接种4只小鼠，72h内全部死亡者为DNT阳性，部分死亡者需复试[10]。结 果

2.1 多杀性巴氏杆菌生化鉴定

凡是麦康凯上不能生长，发酵葡萄糖、果糖、甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸盐还原试验阳性，MR、VP试验阴性者判为多杀性巴氏杆菌。结果共分离出66株多杀性巴氏杆菌，其中24株分离于肺脏，42株分离于鼻拭子。2.2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱

表2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱 Table 2 Medicine sensitivity of 66 isolates to 12 antibiotics 抗

生

素

判 定 标 准 / mm

耐 药

φ<12 φ<12 φ<10 φ<10 φ<12 φ<12 φ<10 φ<12 φ<12 φ<12 φ<12 φ<10

中

敏 12≤φ12≤φ10≤φ10≤φ12≤φ12≤φ10≤φ13≤φ12≤φ12≤φ13≤φ10≤φ

≤16 ≤16 ≤14 ≤17 ≤16 ≤16 ≤12 ≤14 ≤16 ≤16 ≤14 ≤17

高 敏 φφφφφφφφφφφφ>16 >16 >14 >17 >16 >16 >12 >14 >16 >16 >14 >17

高 敏 9(13.7%)52(78.8%)32(48.5%)59(89.4%)30(45.5%)41(62.1%)20(30.3%)35(53.0%)21(31.8%)46(69.7%)27(40.9%)19(28.8%)

试

验

结

果

中 敏 29(43.9%)9(13.6%)12(18.2%)4(6.1%)13(19.7%)13(19.7%)14(21.2%)12(18.2%)27(40.9%)12(18.2%)24(36.4%)32(48.5%)

耐 药 28(42.4%)5(7.6%)22(33.3%)3(4.5%)23(34.8%)12(18.2%)32(48.5%)19(28.8%)18(27.3%)8(12.1%)15(22.7%)15(22.7%)1 强力霉素 2 先锋霉素 3 四 环 素 4 氯 霉 素 5 氨苄青霉素 6 氟 哌 酸 7 青 霉 素 8 庆大霉素 9 痢 特 灵 10环丙沙星 11卡那霉素 12红 霉 素

2.3 多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定

在Pm分离过程中用检测Pm的引物KMT1-KMT2配合生化鉴定，结果表明凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm标准，而阴性者都不完全符合。而且我们对分出的第一株阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的7个Kmt基因序列对比，同源性都在97.6%～99.8%（测序结果略）。2.4 多杀性巴氏杆菌的PCR分型

对分离的66株Pm分别用各型的引物扩增，结果有46株为D型，18株为A型，1株为B型，1株无法定型，没有E、F型。其中46株D型有28株分离于鼻拭子，18株分离于肺脏。18株A型有14株分离于鼻拭子，4株分离于肺脏。B型1株分离于肺脏。1株未定型者分离于肺脏。2.5 产毒多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定

对分离的66株Pm用检测toxA基因的引物TA1-TA2扩增，结果有8株扩增为阳性，这8株都分离于有PAR症状猪的鼻拭子。对其中一阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的4个toxA基因全序列对比，与其中3个序列同源性100%，与另一序列同源性99.7%(658/660)，可见该引物所扩增序列相当保守（测序结果略）。

图1 PCR检测Pm、T+Pm及对A、B、D型Pm分型电泳图谱 Fig 1 The result of testing Pm, T+Pm and typing Pm of serogroup A, B, D by PCR showing on the agarose gel electrophoresis

1:多杀性巴氏杆菌(KMT1-2为引物)；2: A型多杀性巴氏杆菌(PmA1-2为引物)；3: B型多杀性巴氏杆菌(PmB1-2为引物)；4: D型多杀性巴氏杆菌(PmD1-2为引物)；5: 产毒素多杀性巴氏杆菌(TA1-2为引物)；M: DL2000

1: Pm(KMT1-2 was primers);2: Pm of serogrope A(PmA1-2);3: Pm of serogrope B(PmB1-2);4: Pm of serogrope D(PmD1-2);5: T+Pm(TA1-2);M: DL2 000

2.6 多杀性巴氏杆菌毒素的检测

对8株PCR检测为阳性的T+Pm做了豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验。豚鼠皮肤坏死试验8株全为阳性，大多数菌株坏死区直径为7～12mm，其中两株坏死区直径达到16mm，坏死区呈红紫色至黑色。小鼠致死试验有6组（6株菌）小鼠72h内全部死亡，2组在初试时4只小鼠各有1只没死，但复试时4只全死。小鼠死亡时间大多在20～48h内。讨 论

在Pm分离过程中我们采用了PCR方法，由于引物KMT1-KMT2具有很强的灵敏度及特异性，大大降低了分菌工作的难度。敏感性试验表明该引物可以检测低到103个cfu的模板量，而且用呼吸系统常见菌如：胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、链球菌及大肠杆菌做模板都不能扩出特异带型。一般在第一代平皿上挑菌做PCR，若为阳性，都能分出Pm，若为阴性很难分出Pm。而且PCR结果与生化结果完全吻合，即凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm标准，而阴性者都不完全符合，可见该引物具有很强的特异性。

药敏试验结果表明，所分离的66株Pm对氯霉素、先锋霉素、环丙沙星表现较高的敏感性。但氯霉素已禁用，临床上可首选其他两种药物。

各方面报道表明T+Pm主要是D型Pm，极少数A型Pm也产毒素，而且T+Pm主要分离于具有严重PAR的猪，从肺炎症状猪的肺脏分离的Pm一般是不产毒素的，而且多为A型[5, 6, 15]。我们对分离的66株Pm进行PCR分型，结果有69.7%(46/66)为D型，27.3%(18/66)为A型，仅1.5%(1/66)为B型，没有分出E和F型。单从来源于肺脏的Pm来看，16.7%（4/24）为A型，75%（18/24）为D型，4.2%（1/24）为B型。然而，C Pijoan报道从肺脏分离的Pm有87.5%为A型，12.5%为D型[6]。L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm75%为A型，13%为D型；从有PAR症状猪分离的Pm有29.4%为A型，70.6%为D型[15]。我们所用的分型方法与L Robert的方法相同，但结果差异较大，这可能是因为我国血清型流行与国外不同；也可能是因为我国血清流行的区域性，这还需进一步广泛分菌调查。不过单从有PAR症状的猪来看，有66.7%(28/42)为D型，这与L Robert报道的70.6%为D型接近。在PCR定型过程中，有1株Pm用引物KMT1-KMT2扩增为阳性，生化结果也完全符合Pm标准，但用5对分型引物都没有扩出特异性的带，无法定型，这可能是因为该菌株变异较大。L Robert所分离的158株Pm也有2株无法用该PCR方法定型。

据报道，目前国内畜禽流行的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型主要是A、B和D型，没有E型。猪肺疫由A、B型Pm引起，D型菌株引起AR，禽霍乱由A型Pm引起[16, 17]。苑士祥等自患AR猪分离93株Pm经间接血凝试验鉴定86株为D型（92.5%），6株为A型（6.5%），1株未定型（1%）[18]。彭发泉等报道1985-1988共分离74株Pm，有7株A型，67株D型。均为不产毒素菌株[19]。杨留战等报道从临床有萎缩性鼻炎的猪场分离到A型Pm 20株（5株T+Pm），D型85株（76株T+Pm）。产毒素菌株占总分离株的77.1%（81/105）。从临床无萎缩性鼻炎的猪场分离到A型Pm1株，D型5株（1株T+Pm）[20]。本研究与国内有关报道基本一致。

我们所分离的66株Pm只有8株为产毒素菌株，所占比例仅为12.1%(8/66)，而且这8株T+Pm均分离于有PAR症状猪的鼻拭子，均为D型。这与国外报道的T+Pm分离比例有所差异，C Pijoan报道仅从肺脏分离的Pm就有22.8%产毒素（12.8%为A型，10%为D型）[6]，L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm仅有1.8%产毒素（0.9%为A型，0.9%为D型），从有PAR症状猪分离的Pm也有52.9%为T+Pm（11.7%为A型，41.2%为D型）[13]。而我们从肺脏分离的24株Pm均不产毒素，从有PAR症状的猪所分离的T+Pm也只占19%(8/42)。看来在我国，PAR的发生更主要的也许还是环境方面因素影响。不过，杨留战等报道所分离的111株Pm有82株T+Pm（占73.9%）。他们用的是豚鼠皮肤坏死试验检测毒素，我们用的是PCR方法，综合国内外研究表明，动物试验检测毒素所得T+Pm比例都偏高，可见 PCR方法特异性更强，相信也更可靠。

豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验检测DNT结果与PCR检测toxA基因结果一致，即PCR检测为阳性的菌株，豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验也为阳性。虽然有2株T+Pm在第一次小鼠致死试验时4只小鼠各有1只没死，但在复试时攻毒小鼠全被致死。这可能与小鼠个体差异有关，也可能是这2株菌本身产毒素能力较弱。我想，PCR从基因水平检测T+Pm比动物试验更简便、灵敏，也更有说服力。而且对PCR产物测序结果表明引物TA1-TA2所扩增序列相当保守，这进一步确立了该PCR检测方法的可靠性。结 论

PAR是规模化猪场的一种重要传染病，严重影响猪群健康状况及饲料利用率。当前对该病的控制主要还是靠免疫接种和药物治疗。然而，虽然几乎所有猪场都在用萎鼻疫苗及抗生素防治，但各猪场仍时有PAR的发生，药物治疗效果也不明显。对T+Pm的分离鉴定，为该病的快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定了基础。同时，对各血清型的多杀性巴氏杆菌在我国猪场流行情况以及对药物敏感情况做了初步探讨，有利于对猪巴氏杆菌病的防治。

参考文献：

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TANG Xian-chun1, WU Bin1, SUO Xu-feng2, WANG Da-lin2, CHEN Huan-chun1, YIN Zheng-yan1(1.Animal Pathogenic Microorganism Lab, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)(2.Luoniushan Veterinary Station, Meilan District, Haikou 571133)

Abstract: With PCR and biochemical reaction test, sixty-six strains of Pasteurella multocida(Pm)was isolated from the lung tissues of pneumonic swine or nasal swabs of swine suffering progressive atrophic rhinitis(PAR)swine.Their medicine sensitivity was then studied.PCR assay was used to type these Pm isolates, as well as test the toxA gene.Guinea pig skin test and mouse lethal test were used to study the toxigenic pasteurella muttocida(T+Pm).The results showed that all PCR positive strains were coincident with the biochemical reaction criteria of Pm.PCR typing assay indicated that forty-six strains were serogroup D, eighteen strains were serogroup A, one strain was serogroup B and one strain was untypable.And eight strains were identified as T+Pm by PCR method.Guinea pig skin test and mouse lethal test also confirm the eight isolates were T+Pm.All the eight T+Pm strains were serogroup D, and were isolated from the swine suffering severe PAR.Key words: Pm, T+Pm, PCR, typing, medicine sensitivity

第二篇：水葫芦论文：水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物学特性

水葫芦论文：水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物学特性

【中文摘要】水葫芦(Eichhornia crassipes)的蔓延在几十个国家和地区造成了严重的环境问题,如何有效治理水葫芦受到全球范围内的广泛关注。其中,利用水葫芦致病真菌进行治理,是一种备受重视的途径。本文从福建省福州市郊区采集到被致病真菌强烈感染的水葫芦植株,从叶片上分离得到了具有强致病性的真菌菌株FJ24。在对其致病性能进行试验的基础上,对其生物学特性进行了研究。通过形态学鉴定,初步认为FJ24属于尾孢属。进一步地在分子生物学水平上,对其ITS区、EF-1区、β-Tub区、His-H3区序列进行PCR扩增,通过测序,对比Genebank中已经登录的尾孢属相应序列,构建系统发育树,分析其分类地位。结果如下:证实其在7天内能够使试验水葫芦植株达到100%的发病率,3天、7天、14天、21天、28天病情指数分别达到了23.33%、44.17%、78.33%、92.50%、100%。FJ24菌株在PDA培养基上菌落呈灰白色、边缘呈淡红色,簇状分布。菌丝大部分侵入培养基,边缘清晰。分生孢子梗单生或2~12根簇生,不分枝,浅褐色,宽度较规则、直立或略有弯曲,63.4~247.6×2.5~5.5μm。分生孢子单生,无色至浅褐色,有多个横隔,略有弯曲或无弯曲,线形、鞭型或蠕虫型,56.0~312.2×2.0~7.8μm。初步鉴定其为尾孢属。在PDA培养基上,FJ24菌株在全黑暗和光暗交替条件下生长速度较快,该菌在30°C下表现出最快生长速度,而且能长期保持,最适宜的PH条件为

中性偏碱性,在不同培养基上菌落形态存在一定差别,最适宜的培养基为MMA、MSDA、PDAY,该菌最适合利用的碳源和氮源分别为淀粉和乙酸铵。根据ITS区、EF-1区、β-Tub区、His-H3区序列的测序结果,构建系统发育树,结果表明Cercospora sp.FJ24菌株与Cercospora piaropi的多个水葫芦致病菌株存在着极高的同源性,序列相似度均达到了99%以上。生物学特性实验和分子生物学分析均表明,基本可以认为Cercospora sp.FJ24是属于Cercospora piaropi的。综上所述,本文分离得到的Cercospora sp.FJ24具有开发成为水葫芦生防制剂的潜力,同时由于该菌分离自我国本土,具有较高的安全性,因此对于水葫芦的生物防治具有一定的参考价值。

【英文摘要】Spread of Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)caused serious environmental problems in lots of countries and regions.The importance of controlling it was recognized throughout the world.Currently, controlling Water Hyacinth with pathogens gained more and more attention.A strain FJ24, with high pathogenicity against Water Hyacinth was isolated from heavily diseased Water Hyacinth collected from Fujian province.On the basis of determining the pathogenicity of FJ24 against Water Hyacinth, biological characteristics of the strain were studied.Using morphological identification , the strain was preliminarily considered as Cercospora.The strain was further analysed at the molecular level.Four

representative sequences of Cercospora sp.FJ24 including the ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region were sequenced and blasted with other signed Cercospora species on Genbank.Phylogenetic dendrogram were constructed to analyse the taxonomic position of Cercospora sp.FJ24.The results were as follows: The diseaed ratings of Cercospora sp.FJ24 reached 100% in 7 days;the diseased indexes were 23.33%,44.17%,78.33%,92.50% and 100% after 3 days ,7 days, 14 days, 21 days and 28 days respectively.Colony of Cercospora sp.FJ24 on PDA culture was hoar and its edge was light red, growing in cluster.Hypha almost invaded into the culture with clear edge.Conidiophores of Cercospora sp.FJ24 borne singly or in fascicles of 2 to 12, were light brown, septate, width regular, straight or lightly curved and no branched , measuring 63.4 to 247.6μm long and 2.5 to 5.5μm wide.Conidia developed singly , colourless or light brown with many transverse, measured 56.0 to 312.2μm long and 2.0 to 7.8μm wide.Preliminarily identify it as Cercospora.The colony of Cercospora sp.FJ24 grew best on PDA under the dark treatment of alternation illumination and darkness while the colony growed better on PDA under all darkness.The optimum temperature for colony longtime growth was found to be 30℃.The best colony growth was obtained at the condition of neutral pH or alkalescence.The fitting carbon and nitrogen source were amylum and ammonium acetate respectively.Cercospora sp.FJ24 presented varying morphological characteristics on different media tested, and the colonies grew best on MMA, PDAY and MSDA.Four phylogenetic trees were generated from the aligned ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region sequences.The treeing analyses showed that Cercospora sp.FJ24 presented highly homologous with many kinds of pathogenic strain in Cercospora piaropi.And the sequence similarities were above 99%.Biological characteristics of Cercospora sp.FJ24 and phylogenetic tree analyses indicated that Cercospora sp.FJ24 could be basically identified as Cercospora piaropi.The results listed above indicated that Cercospora sp.FJ24, isolated from this study, possessed the great potential to be developed into the fungal herbicide against Water Hyacinth.This research had positive significances for the biological control of exotic plants.【关键词】水葫芦 生防菌 Cercospora piaropi FJ24 鉴定 【英文关键词】Water Hyacinth Pathogenic strain Cercospora piaropi FJ24 Identification 【目录】水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物

学特性12-2312-15摘要5-7ABSTRACT7-9第一章 前言1.1 水葫芦的生态学特性、分布和危害1.1.1 水葫芦的生态学特性12-1

31.1.3 我国水葫芦的危害情况

1.2.1 水葫芦的物理

1.3 1.1.2 水葫芦的分布13-1414-151.2 水葫芦的防治15-21化学防治15-161.2.2 水葫芦的生物防治16-21水葫芦的综合防治2121-23材料23准备2323-2

41.4 本研究的选题依据、目的和意义

2.1 实验第二章 实验仪器、材料与方法23-342.1.1 水葫芦病样采集232.1.3 菌株来源2

32.1.2 供试植株的2.2 主要仪器设备

2.3.1 基

2.3.3 2.3 固体培养基及其制备方法24-27

2.3.2 不同pH 值固体培养基24-25础培养基24不同C、N 源固体培养基2525-27272.4 方法27-342.4.2 接种试验27

2.3.4 其它种类固体培养基2.4.1 病原真菌的分离2.4.3 柯赫氏法则（Koch’s

2.4.5 Rule）验证27-28致病性测定2828-2929

2.4.4 植物病害统计方法282.4.6 影响菌落生长的因素2.4.7 DNA 提取292.4.8 ITS 区序列扩增

2.4.10 系统发育3.1 水葫芦病原

3.1.2 2.4.9 参考基因序列扩增29-30

第三章 结果与分析34-57分析30-34真菌FJ24 的分离34-36致病症状34-35

3.1.1 病原菌的分离34

3.1.3 柯赫氏法则验证353.1.4 致病

性测定35-3636-37征36-3737-47

3.2 水葫芦病原真菌FJ24 的形态学特征

3.2.2 分生孢子形态特3.2.1 菌落形态特征363.3 影响FJ24 菌落生长的因素研究3.3.1 光照对FJ24 菌落生长的影响37

3.3.2 不同光照条件下FJ24 生长曲线的测定37-38FJ24 菌落生长的影响38-39线的测定39-4040-4141-42

3.3.3 温度对

3.3.4 不同温度下FJ24 生长曲

3.3.5 PH 对FJ24 菌落生长的影响3.3.6 不同初始PH 下FJ24 生长曲线的测定3.3.7 碳源对FJ24 菌落生长的影响42

3.3.8 不同碳源下FJ24 生长曲线的测定42-43菌落生长的影响43-44测定4444-4545-4747-5750-52列54-57

3.3.9 氮源对FJ24

3.3.10 不同氮源下FJ24 生长曲线的3.3.11 不同培养基对FJ24 菌落生长的影响3.3.12 不同培养基中FJ24 生长曲线的测定3.4 Cercospora sp.FJ24 的分子生物学鉴定3.4.1 ITS 序列47-503.4.3 β-Tub 序列52-54第四章 讨论57-62

3.4.2 EF-1 序列3.4.4 His-H3 区序4.1 关于Cercospora sp.FJ24 的鉴定574.2 关于Cercospora sp.FJ24 的生物学

4.3 Cercospora

4.4 关于特性及其对实际应用的指导意义57-59sp.FJ24 菌株作为真菌除草剂的开发前景59-60Cercospora sp.FJ24 菌株的安全性60-61草剂的开发前景61-62

4.5 水葫芦真菌除

参考文献

第五章 结论62-63

63-68附录68-70致谢70-71攻读硕士学位期间发表的论文71

第三篇：宁夏地区常见园林绿化植物生物学特性及栽培技术初步研究

宁夏地区城镇园林绿化

常见植物生物学特性及栽培技术初步研究 陈卫宁

（宁夏国有林场和林木种苗工作总站宁夏银川 750001）

摘要：园林绿化植物是植物造景的基础物质。据统计，截至2015年，宁夏地区城镇园林绿化常见植物有58科、108属、206种，其中：裸子植物有3科、7属、17种；被子植物有55科、101属、189种。笔者通过参与宁夏地区城镇园林绿化工作及对部分园林绿化植物的连续观察，对园林绿化常见植物生物学特性及栽培技术进行了初步研究，旨在进一步提高对常用园林绿化植物的认识和应用水平，并起到借鉴作用。

关键词：宁夏城镇；园林绿化植物；生物学特性；栽培技术；初步研究 1目的与意义 1.1重要性

植物栽培、植物造型、植物搭配是我区城镇园林绿化的重要组成部分，研究宁夏地区城镇园林绿化常见植物生物学特性及栽培技术，为城镇园林规划、园林设计提供详实的基础资料，在园林施工中更好地进行树种选择和新技术的应用，力促植物造景、组团配置、色块搭配更具地方区域特色。据统计，截至2015年，宁夏地区城镇园林绿化常见植物有58科、108属、206种，其中：裸子植物有3科、7属、17种；被子植物有55科、101属、189种。1.2目的性

园林绿化苗木培育水平的高低是衡量生产绿地繁育技术水平和一个城市植物栽培水平的重要指标。坚持“因地制宜，适地适树”的原则，准确掌握宁夏地区城镇园林绿化常见植物生物学特性及栽培技术，使用乡土树种，点缀部分“名特优新”树种，推广良种壮苗，充分利用现代灌溉设施，综合防治病虫害，达到植物生长自然，树姿优美，树势健壮，叶色正常，病虫害“可控不成灾”的栽培效果。1.3现实性

体现宁夏地区城镇“塞上江南、回乡风情”的地方特色。通过测试树种的抗逆性、耐盐碱性、抗寒抗旱能力、生长势、成枝力等指标，结合考察树种的叶色、叶形、花色、花型、果色、果型、树干、株型等综合因素，选育出对宁夏地区土壤、水分、肥力、抚育等条件适应性强的树种，进行定向培养，利用播种、扦插、分株、压条、嫁接、组织培养等扩繁方式进行繁育，通过多点位、连续性的区域试验，确定出我区的适生条件及适宜种植区域，真正呈现出“春花、夏荫、秋实、冬青”的北方四季景观效果。2生物学特性简介及栽培技术 2.1植物分类

2.1.1阔叶落叶乔木

刺槐，香花槐，红花洋槐，白腊，水曲柳，臭椿，香椿，国槐，龙爪槐，金枝槐，蝴蝶槐，河北杨，毛白杨，新疆杨，垂柳（金枝垂柳），旱柳，樟河柳，馒头柳，珊瑚柳，沙枣，白榆，垂榆，圆冠榆，金叶榆，皂荚，梓树，楸树，杜仲，白桦，丝绵木，火炬树，五角枫，复叶槭，紫叶李（太阳李），美人梅，金银木，桑树（龙桑），桃树，山桃，碧桃（红叶碧桃），杏树，山杏，山楂，枣树，苹果树，槟子，沙果，梨树，杜梨，李子树，核桃树等； 2.1.2常青针叶树 桧柏（桧柏球），青海云杉，油松，樟子松，侧柏（洒金柏），杜松，华山松，华北落叶松，白皮松，爬地柏（沙地柏）等； 2.1.3花灌木 榆叶梅，贴梗海棠，丁香（暴马丁香、俄罗斯丁香），香荚蒾，忍冬，金银木，红刺玫，四季玫瑰，黄刺玫，卫矛，连翘，珍珠梅，木绣球，紫叶矮樱，红瑞木，天目琼花，茶藨子，水栒子，接骨木，文冠果，枸杞，沙棘，水蜡，女贞，月季，迎春，绣线菊，金叶莸，醉鱼草，红叶小檗，绿叶小檗，金叶小檗，大叶黄杨，小叶黄杨，紫穗槐，红花多枝柽柳，锦鸡儿等；

2.1.4攀缘植物

爬山虎，紫藤，山荞麦，啤酒花等； 2.1.5地被植物

三叶草，百脉根，紫花苜蓿，千屈菜，马蔺，鸢尾兰，百合，萱草，地被菊，荷兰菊，天人菊，悬崖菊，黑心菊，薰衣草，马鞭草，红豆草，香石竹，景天，聚合草，射干，蜀葵，草地早熟禾，紫羊茅，黑麦草等； 2.1.6露地花卉

矮牵牛，万寿菊，鸡冠，一串红，金鱼草，耧斗菜，福禄考，美人蕉，紫茉莉，凤仙花，大丽花，百日草，千日红，三色堇，彩叶草，唐菖蒲，羽衣甘蓝，银叶菊，八仙花，太阳花，虞美人，醉蝶，旱金莲，月见草等； 2.1.7水生植物

荷花，睡莲，菖蒲，芦苇等； 2.1.8保护地栽培植物

泡桐，银杏，江南槐，雪松，法国梧桐，樱花，合欢，栾树，黄栌，红栌，玉兰，海棠，柿树，木槿，锦带花，紫荆，紫薇，牡丹，冬青，毛竹，凌霄，葡萄，芍药，美国蓝衫，花楸，高杆北海道黄杨球，高杆紫薇，高杆碧桃，高杆栓翅卫矛等植物。2.2常用园林绿化树种生物学特性及栽培技术

例举榆叶梅、紫叶矮樱、红叶碧桃、丁香、贴梗海棠、金银木、连翘、黄刺梅、香荚蒾、红瑞木、紫叶李、珍珠梅、红叶小檗、水腊等14个具有代表性的常用园林绿化树种。2.2.1榆叶梅

蔷薇科，桃属。喜光，耐寒、耐旱，对轻度碱土也能适应，不耐水涝。株高2m左右，因叶似榆叶而得名，是我国北方地区的早春观花树种。花期4月，花径2～3.5cm，花有单瓣、重瓣和半重辩之分。初开多为深红，渐变为粉红色，后变为粉白色。果熟期8月。采用嫁接方法繁殖为多。砧木用1年生山杏、山桃或毛桃实生苗。2.2.2紫叶矮樱

蔷薇科，李属。落叶灌木或小乔木，株高1.8～2.5m，枝条幼时紫褐色，老枝有皮孔。花单生，中等偏小，淡粉红色，花瓣5片，微香，花期4～5月。观赏效果好，生长快、繁殖简便、耐修剪，适应性强，是城市园林绿化优良的彩叶配置树种。一般采用嫁接和扦插繁殖，嫁接砧木采用山杏，山桃，以杏砧为好。2.2.3红叶碧桃

蔷薇科，桃属。落叶小乔木，株高3～5m，树皮灰褐色，小枝红褐色，幼叶鲜红色。花重瓣、桃红色。花期4～5月。不但花朵美丽，而且叶呈紫红色，是很好的观赏树种。喜温暖向阳环境，适生温度15～30℃。宜于深厚，喜肥沃而排水良好的土壤，不耐水湿，碱性土及粘重土均不适宜。常采用嫁接繁殖,砧木为毛桃。2.2.4丁香

木犀科，丁香属。落叶灌木或小乔木，因花筒细长如钉且香故名。植株高2～8m，叶对生。花呈顶生或侧生的圆锥花序。花色紫、淡紫或蓝紫，也有白色及紫红色，以白色和紫色为居多。喜生长在阳光充足的地方。可采用分株、压条、嫁接、扦插和播种等多种方法进行繁殖，一般多用播种和分株法繁殖。2.2.5贴梗海棠

蔷薇科，木瓜属。喜阳光，较耐寒，不耐水淹，喜肥沃、深厚、排水良好的土壤。落叶灌木，高达2m，小枝无毛，有刺。叶片卵形至椭圆形。花簇生，红色、粉红色、淡红色或白色。花期3～4月，果期10月，果实卵圆形或长圆形。繁殖主要用分株、扦插和压条。2.2.6金银木

忍冬科，忍冬属。落叶灌木，高达6m。喜强光，喜温暖环境，稍耐旱，亦较耐寒。花冠先白色后变黄色，长2cm左右，外被短伏毛或无毛。花期5～6月，雄蕊5枚，多为聚伞花序。果实暗红色，圆形，直径5～6mm；种子具蜂窝状微小浅凹点,果熟期8～10月。播种、扦插繁殖。2.2.7连翘

木犀科，连翘属。先叶开花，花开满枝金黄，是早春优良观花植物。萌生力强，平茬后的根桩或干枝都能萌生，增加分株的数量。枝条更替快，萌生枝长出新枝后，逐渐向外侧弯斜。根系发达，可作花篱或护堤树栽植。扦插、播种、分株繁殖。2.2.8黄刺玫

蔷薇科，蔷薇属。落叶灌木，喜光，稍耐阴，耐寒力强，不耐水涝。对土壤要求不严，耐干旱和瘠薄，在盐碱土中也能生长。小枝褐色或褐红色，有硬刺。奇数羽状复叶。花黄色，单瓣或重瓣，花期5～6月。果球形，红黄色，果期7～8月。繁殖主要用分株法。2.2.9 香荚蒾

忍冬科，荚蒾属。落叶灌木，耐半阴，高达5m。早春开放，花白色而浓香，为北方地区早春观花灌木。植株枝叶稠密，叶形优美。小枝红褐色，后变灰褐色或灰白色。叶椭圆形或菱状倒卵形，长4～8cm，顶端锐尖，基部楔形至宽楔形，边缘具三角形锯齿，侧脉5～7对，直达齿端。叶柄长1.5～3cm，幼时上面边缘被纤毛。种子采集时间8月上中旬，播种繁殖。2.2.10 红叶小檗（金叶小檗、绿叶小檗）

小檗科，小檗属。落叶灌木，喜阳，耐半阴，耐干旱，耐寒，不畏炎热高温。萌蘖性强，耐修剪，适应性强。适生于肥沃、排水良好的土壤。紫红到鲜红。4月开花，花黄色。略有香味。果期9～11月，果实椭圆形，鲜红色。挂果期长，落叶后仍可缀满枝头。播种，压条繁殖培育。2.2.11红瑞木

山茱萸科，梾木属。落叶灌木，极耐寒、耐旱、耐修剪，喜光，喜深厚湿润且肥沃疏松的土壤。老干暗红色，枝丫血红色。叶对生，椭圆形。聚伞花序顶生，花乳白色。花期5～6月。果实乳白或蓝白色，成熟期8～10月。用播种、扦插和压条法繁殖。2.2.12紫叶李（太阳李）

蔷薇科，李属。小乔木，树冠圆形或扁圆形，小枝红褐色。叶紫红色。花单生或2～3朵聚生，粉红色。果实近球形，黄绿色有紫色晕。花期4～5月，果熟期6～7月。喜阳光，喜温暖湿润气候，有一定的抗旱能力。对土壤适应性强，不耐干旱，较耐水湿，但不耐水淹。在肥沃、深厚、排水良好的黏质中性、酸性土壤中生长良好，不耐碱。根系较浅，萌生力较强。通常用嫁接法，也可用压条繁殖。嫁接砧木为山杏或山桃。2.2.13珍珠梅

蔷薇科，珍珠梅属。灌木，高达2m。喜光又耐荫，耐寒性强，不择土壤。萌蘖性强、耐修剪。生长迅速。花期6～8月。花、叶清丽，花期长又值夏季少花季节，可孤植、列植、丛植。春夏干旱时节要保持土壤湿润。繁殖以分株法为主，也可播种。2.2.14水腊

木犀科，女贞属。落叶或半常绿灌木，是萌芽力、成枝力强、耐修剪的树种，作绿篱栽植。小枝具短柔毛，开张成拱形。果椭圆形，紫黑色。花期7～8月，果熟期10～11月。喜光，耐寒，耐旱，对土壤要求不严。播种繁殖为主，也可嫩枝扦插或硬枝扦插。2.3保护地栽培园林绿化植物生物学特性及技术

例举紫荆、紫薇、锦带花、木槿、玉兰、樱花、合欢、泡桐等8个具有代表性，需在我区公园、庭院等具有保护设施条件下栽培的树种。2.3.1紫荆

豆科，紫荆属。早春先叶开放，枝干满布紫色花朵，艳丽可爱。喜光照，喜肥沃、排水良好的土壤，有一定的耐寒性，不耐淹。叶片心形，圆整而有光泽。萌蘖性强，耐修剪。播种、分株、扦插、压条等方法繁殖，主要以播种为主。2.3.2紫薇

千屈菜科，紫薇属。落叶灌木或小乔木，高达7m。喜暖湿气候，喜光，略耐阴，喜肥，尤喜深厚肥沃的砂质壤土，亦耐干旱，忌涝。树姿优美，树干光滑洁净，花色艳丽，开花时正当夏秋少花季节，花期长。枝干多扭曲，小枝纤细，叶互生或有时对生，椭圆形或倒卵形。花期6～9月，果期9～12月。繁殖方法为播种和扦插，其中扦插方法更好。2.3.3锦带花

忍冬科，锦带花属。喜光，耐荫，耐寒。对土壤要求不严，能耐瘠薄土壤，以深厚、湿润而腐殖质丰富的土壤生长为好，怕水涝。萌芽力强，生长迅速。花期4～6月。灌木，高3m，枝条开展。花冠漏斗状钟形，玫瑰红色，裂片5。常用扦插、分株、压条方法繁殖。2.3.4木槿

锦葵科，木槿属。落叶灌木或小乔木，高2～3m，喜温凉、湿润、阳光充足的气候条件，喜肥沃的中性至微酸性土壤，较耐干旱，耐瘠薄，耐半荫，忌涝，耐寒冷，生长适温15～28℃。多分枝，花期6～9月，花期满树花朵，娇艳夺目。常单植或列植。可用播种、扦插和嫁接繁殖。2.3.5玉兰

木兰科，木兰属。落叶乔木，树高可达15m。喜温暖、向阳、湿润而排水良好的地方，要求土壤肥沃、不积水。有较强的耐寒能力，在－20℃的条件下可安全越冬。花白色到淡紫红色，大型、芳香，花冠杯状，花先开放，叶子后长，花期10天左右。中国著名的花木，北方早春重要的观花树木。常用嫁接和压条方法繁殖。2.3.6樱花

蔷薇科，樱桃属。喜阳光，喜温暖湿润的气候环境，对土壤的要求不严，以深厚肥沃的砂质壤土生长最好，对烟尘、有害气体及风的抵抗力均较弱。不耐盐碱土。根系较浅，忌积水低洼地。有一定的耐寒和耐旱力。花朵美丽，盛开时节，满树烂漫，如云似霞，是早春开花的著名观赏花木。以播种、扦插和嫁接繁育为主。2.3.7合欢

豆科，合欢属。落叶乔木，高4～15 m。夏季开花，头状花序，合瓣花冠，雄蕊多条，淡红色。性喜光，喜温暖，耐寒、耐旱、耐土壤瘠薄及轻度盐碱，不耐水涝。树皮灰褐色，小枝带棱角。花期6～7月，果期9～11月。播种繁殖。2.3.8泡桐

玄参科，泡桐属。落叶乔木，喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强。树皮灰色、褐色或黑色。叶大而长柄，随树龄增大叶面积逐渐变小，花序为聚伞圆锥形，花冠大，紫色或白色。种子椭圆状，很小，数量多。属深根性树种，树姿优美，花色绚丽。育苗方法有插根、播种等，以插根育苗最普遍。3 园林绿化高杆嫁接树种简介

例举高杆北海道黄杨球、高杆紫薇、高杆碧桃、金叶榆球、金枝槐、龙爪槐、高杆栓翅卫矛等7个具有代表性的园林绿化“名特优新”树种，以高杆嫁接繁殖为主。3.1高杆北海道黄杨球

卫矛科，卫矛属。喜光，亦较耐荫。喜温暖湿润气候亦较耐寒。要求肥沃疏松的土壤，极耐修剪整形。砧木为丝绵木，截干高1.5～2.5m。接穗为灌木北海道黄杨。3.2高杆紫薇

千屈菜科，紫薇属。结合修剪可培养成球型、伞型、塔型、垂枝型等花冠。砧木为高杆式紫薇，选用干高1.5～2.5m、粗度2.5～4 cm的高杆紫薇作砧木。接穗为矮化紫薇。3.3高杆碧桃

蔷薇科，桃属。碧桃是桃树的一个变种，属于观赏桃花类的半重瓣及重瓣品种。花期3月下旬～4月中旬，花朵丰腴，色彩鲜艳丰富，花型多。常见的品种有红花绿叶碧桃、红花红叶碧桃，白红双色洒金碧桃等多个变种。砧木为毛桃、山桃、山杏等，干高1～2m、粗度2.5～3 cm。接穗为木质化充分的1年生碧桃枝条，粗度0.7～1.1cm。3.4高杆金叶榆球

榆科，榆属。金叶榆系白榆变种，生长迅速，枝条密集，耐强度修剪，造型丰富，对寒冷、干旱气候有极强的适应性，有很强的抗盐碱性，根系发达，耐贫瘠，除用于城镇绿化外，还可大量应用于山体景观生态绿化中，营造景观生态林和水土保持林。叶片金黄色，有自然光泽，色泽艳丽；叶脉清晰，质感好，观赏性佳。砧木为白榆苗或山榆苗，截干高1.5～2m、粗度2～3 cm。接穗为中华金叶榆木质化充分的1年生枝条，粗度0.7～1cm。3.5金枝槐

豆科，槐属。落叶小乔木，耐旱能力和耐寒力强，耐盐碱，耐瘠薄，湿涝立地条件下生长较差。金枝槐寿命长。砧木为国槐苗，接穗为金枝槐。3.6龙爪槐

豆科，槐属。喜光，稍耐阴。能适应干冷气候。喜生于土层深厚，湿润肥沃、排水良好的沙质壤土。深根性，根系发达，抗风力强，萌芽力亦强，寿命长。小枝柔软下垂，树冠如伞，状态优美，枝条构成盘状，冠层可达50～70cm厚，层内小枝易干枯。砧木为国槐苗，接穗为龙爪槐木质化充分的1年生枝条。3.7高杆栓翅卫矛

卫矛科，卫矛属。高杆栓翅卫矛是“观叶、观花、观果、观枝”的景观树种，采用丝棉木做砧木，接穗为灌木栓翅卫矛，嫁接繁育苗木。主要用于城镇绿化、美化。参考文献：

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职称：正高职高级工程师

单位：宁夏国有林场和林木种苗工作总站 成稿时间：2016.07