变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告

第一篇：变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告

变性梯度凝胶电泳DGGE

刘琳 1131428 环境科学

一、实验目的

1． 学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。2． 练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。

3． 分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。

二、实验原理

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此，如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

DNA片段在DGGE胶中的迁移行为（如下图）：

变性剂

Low

High

在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（一般30-50个碱基对），使DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。

DGGE有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。

三、实验器材与药剂

器材：DGGE system(D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml针筒、聚乙烯细管、电泳仪

试剂：16s rDNA V3区PCR扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED、sDNA染料

变性剂Lowhigh

四、实验步骤

1． 首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。其中35%的变性溶液需要加入6ml 90%的变性胶溶液和9.5ml的0%的变性胶溶液；55%的变性溶液需要加入9.5ml 90%的变性胶溶液和6ml的0%的变性胶溶液。

2． 将海绵垫固定在制胶架上，把类似‘三明治’结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。将三根聚乙烯细管中短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30ml的注射器上。在两个注射器上分别标记‘高浓度’与‘低浓度’，并安装上相关的配件； 反时针方向旋转凸轮到起始位置。将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到目标体积设置（15.5）。配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液到两个离心管中，每管加入12 μl TEMED，80 μl 10% APS，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。将两种变性溶液分别吸入相应注射器中。通过推动注射器推动杆小心赶走气泡； 分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连，轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，以使溶液恒速的被灌入到三明治式的凝胶板中，灌完后插上梳子，迅速清洗用完的设备。

3． 待胶干后，在梳孔中加入相应样品，之后在75V的条件下电泳20h。4． 在200ml 1×TAE中加入30ul sDNA 染料(或20ul 1%EB），混匀后小心倒入一容器中；拨开一块玻璃板，将胶（带着一块玻璃板）放入容器中；轻轻晃动玻璃板，使胶与玻璃板脱落，置水平摇床轻轻摇晃染色20min。

5． 利用生物电泳分析系统对染色后的胶进行拍照。

五、实验结果记录并整理

如图所示，在紫外透射仪的观察下，可明显发现跑出很多条条带。上面和底部几乎没有明显条带出现，条带显示居中下，说明变性胶的浓度范围可以适当缩小。这样可以更好地分离中间较为集中的条带。

在同一水平方向上，有些条带亮度呈依次增强的趋势，这表明该微生物在水净化处理系统中依次增加；条带亮度不变的表明，该微生物的数量并没有变化；条带亮度依次减弱，表明该微生物已经不适应系统中的环境，数量在逐渐减少。在胶的下半部分，条带之间的间隔比较小，有些辨别不清楚，这可能与电压较小且电泳时间过长有关。左边的纯菌种跑出了四条条带，表明有些纯菌种可以跑出多条条带的。右边也是纯菌种，理论上应该只有一条条带，但结果有很多条，可能是实验操作时出现了污染。

六、思考

1． 实验过程中需要注意些什么细节？ 1)配制试剂时一定要用去离子水 2)在混合和灌胶时应避免产生气泡。

3)制胶是关键。玻璃板一定要洗干净，在灌胶时，要匀速的转动滑轮，将凝胶液匀速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。

4)灌完胶后要立即清洗注射器，以防胶凝固，堵塞管子.5)点样时，要用小型注射器，伸入点样孔底部点样

6)每次用完仪器后要及时清理，玻璃板一定要清洗干净，放置妥当。

2． 通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助？

变性梯度凝胶电泳（DGGE）让我了解到现在微生物群落的研究方法的先进性，在分子生物学的研究中具有重要的意义。变性梯度凝胶电泳可以区分不同群落中微生物的种类。而且，此次实验对今后的毕业论文课题开展奠定了良好的基础。

3． 如果你在做DGGE实验时得到的指纹图谱的所有条带都在凝胶的上端，可能是什么因素 导致的，你怎么来解决这个问题？实验前做什么样的准备工作可以避免这样的结果出现？

可能导致的原因有：

① 变性剂浓度过大，双链DNA开始电泳后立即部分裂解为单链后，始终保持较小的电泳速 度，因而导致结果偏上。

② 电泳时电压过低，导致电泳速度影响条带位置。③ 电泳时间太短。④ GC浓度不理想。解决措施

① 适当降低变性剂的浓度 ② 增加加电泳电压 ③ 加长电泳时间

4.如果你的DGGE图谱很模糊，只有很少的几个条带，这个结果能用吗？可能是什么原因导致的？

不能用。可能是由于变性胶浓度不合适而导致产物结果无法完全呈现在图谱上。除此外，也可能是因为样品量过低而导致图谱模糊。在实验过程中中，操作过程、胶的均匀程度、玻璃板的洁净程度等都会影响电泳的结果。

第二篇：变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用

【中图分类号】r919．

2【文献标识码】b

【文章编号】1007—9297(2005)02—0063—0

4随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基

因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多

样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选

或

诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意

义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由fischer

和lerman[，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturing gra—

dient gel electrophoresis，dgge)历经多次改良，已发

展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛

应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态

性分析、微生物种群研究等各个领域。

一、dgge基本原理

dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。

其原理是基于待测dna 片段双螺旋的解链温度

(melting temperature。tm)。tm值由dna片段的碱基

数目和碱基组成共同决定。主要引起低温解链区域解

链。当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线

性梯度增加的凝胶中电泳时。起初双螺旋dna片段

以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性

效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开

始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其

迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。长度相同

但序列不同的dna片段。即使仅存在单个碱基改变。

也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变．

从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna

片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。

上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检

出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全

解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此．可

通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5 端引入

3o 5o个gc碱基组成的寡核苷酸链． 即gc—clamp。

使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高

温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单

链，极大增加dgge的突变检出率。[3]

变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将dgge分

为两类：垂直dgge和平行dgge。垂直dgge的变

性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一dna

片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析

pcr产物的组成；平行dgge的变性剂梯度方向与电

泳方向一致，在所检测的dna解链区域和温度已知的情况下可用于多个样本的同时分析。

二、dgge衍生技术

圈i t 曩

(一)恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel

electrophoresis，cdge)

由hovig等嗍(1991年)在dgge的基础上发展

而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测

dna片段的tm值后即采用相当于该tm值的单一变

性剂浓度的凝胶电泳．使不同的dna片段各自以不

同但恒定的速度迁移。cdge避免了化学变性剂梯度的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的分辨效果。同时克服了dgge电泳时间长的缺点，使

其变得更加简单快速。但对含有多个解链区域的目的片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。因

需事先精确确定待测片段的tm值。故该法主要用于

已知突变的检测。

【基金项目l 国家自然科学基金资助(no．30300399)

【作者简介l 黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。

· 146 ·

(二)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel

electrophoresis，tgge)

tgge凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电

泳过程中．通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形

成一线性增加的温度梯度，以此取代dgge中的化学

变性剂浓度梯度。变性环境由凝胶中恒定浓度的变性

剂和温度梯度共同构成。[5,61由于无需制备变性梯度

胶，tgge较dgge更加简单稳定。但目前大多tgge

仪器所允许的温度范围为15℃～80℃，较大片段的tm值会因接

第三篇：共轭梯度法实验报告

数值代数实验报告 一、实验名称：

用共轭梯度法解线性方程组。

二、实验目的：

进一步熟悉理解掌握共轭梯度法解法思路，提高 matlab 编程能力。

三、实验要求：

已知线性方程矩阵，应用共轭梯度法在相关软件编程求解线性方程 组的解。

四、实验原理：

1．共轭梯度法：

考虑线性方程组 Ax b 的求解问题，其中 A 是给定的 n 阶对称正定矩阵，b 是给定的 n 维向量，x 是待求解 的 n 维向量.为此, 定义二次泛函 T T(x)x Ax 2b x.定理 1 设 A 对称正定 , 求方程组 Ax b 的解，等价于求二次泛函(x)的极小值点.定理 1 表明，求解线性方程组问题就转化为求二次泛函(x)的极小值点问题.求解二次函数极小值问题，通常好像盲人下山那样，先给定一个初始向量 x 0，确定 一个下山方向 p 0，沿着经过点 x 0 而方向为 p 0 的直线 x x 0 p 0 找一个点 x x p，1 0 0 0 使得对所有实数 有 x p x p，0 0 0 0 0 即在这条直线上 x 1 使(x)达到极小.然后从 x 1 出发，再确定一个下山的方向 p 1，沿着 直

线

x x p 再 跨 出 一 步，即 找 到 1 使 得 x 在 x 2 x 1 1 p 1 达 到 极 小 ：1 x p x p.1 1 1 1 1 重复此步骤，得到一串 0 , 1 , 2 ,L 和 p 0 , p 1 , p 2 ,L，称 p k 为 搜索方向，k 为步长.一般情况下，先在 x k 点找下山方向 p k，再在直线 x x p 上确定步长 k 使 k k

x p x p k k k k k,最后求出

x x p.然而对不同的搜索方向和步长，得到各种不同的算法.k 1 k k k 1

由此，先考虑如何确定 k.设从 x k 出发，已经选定下山方向 p k.令 f x p k k T T x p A x p 2b x p k k k k k k 2 T 2 T p Ap r p x，k k k k k 其中 r k b Ap k.由一元函数极值存在的必要条件有 T T f 2 p Ap 2r p 0 k k k k 所确定的 即为所求步长，即

k 步长确定后，即可算出

T r p k k k T p Ap k k

.x x p.k 1 k k k T 此时，只要 r p 0，就有 k k 即

x x.k 1 k

x x x p x 2 k 1 k k k k k T r p k k 2 T 2 T 0 p Ap r p k k k k k k T p Ap k k 再考虑如何确定下山方向 p k.易知负梯度方向是(x)减小最快的方向，但简单分 析就会发现负梯度方向只是局部最佳的下山方向，而从整体来看并非最佳.故采用新 的方法寻求更好的下山方向—— 共轭梯度法.下面给出共轭梯度法的具体计算过程 : 给定初始向量 x 0，第一步仍选用负梯度方向为下山方向，即 p 0 r 0，于是有 T r r 0 0 ,x x p ,r b Ax.0 T 1 0 0 0 1 0 p Ap 0 0 对以后各步，例如第 k+1 步（k 1）, 下山方向不再取 r k，而是在过点由向量 r k 和 p k 1

所张成的二维平面 2 { x | x x k r k p k 1 , , R} 内找出使函数 下降最快的方向作为新的下山方向 p k.考虑 在 2 上的限制：,(x k r k p k)1 T(x r p)A(x r p)k k k 1 k k k 1 T 2b(x r p).k k k 1 计算 关于 , 的偏导得：

T T T r Ar r Ap r r , k k k k 1 k k T T 2 r Ap p Ap , T 其中最后一式用到了 r p 1 0，这可由 r k 的定义直接验证.令 k k 1 k 1 k 1 k k 0，即知 在 2 内有唯一的极小值点 x% x r p，k 0 k 0 k 1 2

其中 0 和 0 满足

T T T r Ar r Ap r r 0 k k 0 k k 1 k k,T T r Ap p Ap 0 k k 1 0 k 1 k 1

0.由于 r k 0 必有 0 0，所以可取 1 0 p x% x r p k k k k0 0 作为新的下山方向.显然，这是在平面 2 内可得的最佳下山方向.令 0 k，则可 1 得 T r Ap k k 1.k 1 T p Ap

k 1 k 1 T 注：这样确定的 p k 满足 p Ap 1 0，即 p k 与 p k 1 是相互共轭的.k k

0 总结上面的讨论，可得如下的计算公式：

T r p k k，x k 1 x k k p k，k T p Ap k k r b Ax，k 1 k 1 T r Ap k 1 k，p k 1 r k 1 k p k.k T p Ap k k 在实际计算中，常将上述公式进一步简化，从而得到一个形式上更为简单而且对称 的计算公式.首先来简化 r k 1 的计算公式：

r 1 b Ax 1 b A(x p)r Ap.k k k k k k k k 因为 Ap k 在计算 k 是已经求出，所以计算 r k 1 时可以不必将 x k 1 代入方程计算，而是 从递推关系 r k 1 b k Ap k 得到.再来简化 k 和 k 的计算公式.此处需要用到关系式 T T T r r 1 r p 1 r 1 p 0, k 1,2,K.k k k k k k 从而可导出 1 T T r r r ,，k 1 k 1 k 1 1 1 k T T T p Ap p r r p r k k k k k 1 k k 1 T 1 T k k r r p r r.k k k 1 k 1 k k k k 由此可得

T T r r r r k k 1 1.k k ,.，k T k T p Ap r r k k k k 从而有求解对称正定方程组的共轭梯度法算法如下：

x 初值 0 r b Ax ； k 0 0 0 while r k 0 k k 1 if k 1 p r 0 0 3

else T T k r k r k r k r k1 1 2 2 p r p k 1 k 1 k 2 k 2 end T T k r k r k p k Ap k1 1 1 1 x x p k k 1 k 1 k 1 r r Ap k k 1 k 1 k 1 end x x k 注：该算法每迭代一次仅需要使用系数矩阵 A 做一次矩阵向量积运算.定理 2 由共轭梯度法得到的向量组

r 和 p i 具有如下基本性质：

i T（1）

p r 0，0 i j k;i j T（2）

r r 0，i j，0 i, j k;i j T（3）

p Ap 0，i j，0 i, j k;i j（4）

span{ r ,K , r k } span{ p ,K , p k }(A, r ,k 1)，0 0 0 其中 k(A,r , k 1)span{ r , Ar ,K , A r }，0 0 0 0 通常称之为 Krylov 子空间.下面给出共轭梯度法全局最优性定理：

定理 3 用共轭梯度法计算得到的近似解 x k 满足 x min x : x x(A,r ,k)k 0 0 或 x x x x x x A r k，* min * : 0(, 0 ,)k A A 其中

T x x Ax，x * 是方程组 Ax b 的解，(A, r 0 ,k)是由所定义的 Krylov 子空间.A 定理 2 表明，向量组 r 0 ,K ,r k 和 p 0 ,K , p k 分别是 Krylov 子空间(A, r 0 ,k 1)的正 交基和共轭正交基.由此可知，共轭梯度法最多 n 步便可得到方程组的解 x *.因此，理论上来讲，共轭梯度法是直接法.然而实际使用时，由于误差的出现，使 r k 之间的正交性很快损失，以致于其有 限步终止性已不再成立.此外，在实际应用共轭梯度法时，由于一般 n 很大，以至于 迭代 O n 次所耗费的计算时间就已经使用户无法接受了.因此，实际上将共轭梯度 法作为一种迭代法使用，而且通常是

r 是否已经很小及迭代次数是否已经达到最大

k 允许的迭代次数 k max 来终止迭代.从而得到解对称正定线性方程组的实用共轭梯度 法，其算法如下：

x 初值 4

k 0;r b Ax;

T r r

while

b and k k max 2 k k 1 if k 1 p r else %;p r p end T;;Ap p x x p T r r;%;r r end 算法中，系数矩阵 A 的作用仅仅是用来由已知向量 p 产生向量 Ap，这不仅可以 充分利用 A 的稀疏性，而且对某些提供矩阵 A 较为困难而由已知向量 p 产生向量 Ap 又十分方便的应用问题是十分有益的。

2．算例 10 13 4

x 1运用共轭梯度法求解下述方程，并解释你所观察到的结果 1 9-1 2-3 x 27 2-1 7 3-5

x 33 2 3 12-1 x 17 解：已知共轭梯度法的 MATLAB 程序代码如下所示：4-3-5-1 15 x 12 function[x,n]=conjgrad(A,b,x0)5 %采用共轭梯度法求线性方程组 Ax=b 的解 %线性方程组的系数矩阵：

A %线性方程组中的常数向量：

b %迭代初始向量：

x0 %线性方程组的解：

x %求出所需精度的解实际的迭代步数：

n r1=b-A*x0;p=r1;n=0;for i=1:rank(A)if(dot(p,A*p)<1.0e-50)break;end

alpha=dot(r1,r1)/dot(p,A*p);5

x=x0+alpha*p;r2=r1-alpha*A*p;if(r2<1.0e-50)break;end belta=dot(r2,r2)/dot(r1,r1);p=r2+belta*p;n=n+1;end 用共轭梯度法求解，在 MATLAB 命令窗口中输入求解程序：

>> A=[10 1 2 3 4 2 4 2 1 1;1 9-1 2-3 3-3-1 9 2;2-1 7 3-5 4-5 7-1 3;3 2 3 12-1 5-1 3 2 4;4-3-5-1 15 1 3 2 3 2;2 3 4 5 1 10 4 5 3 4;4-3-5-1 3 4 9 1-3 2;2-1 7 3 2 5 1 7-1 1;1 9-1 2-3 3-3-1 12 10;1 2 3 4 2 4 2 1 10 15];>> b=[12;-27;14;-17;12;12;-27;14;-17;12];>> x0=[0;0;0;0;0;0;0;0;0;0];>> [x,n]=conjgrad(A,b,x0)输出的计算结果为：

x = 8.5669-7.1981-7.3479-13.9388 1.1303 11.5188-26.8966-2.2388 0.0829 13.2786 输出的迭代次数为 n = 10 共轭梯度法理论上只要迭代 n 步，就能得出方程组的解，但是由于存在计算误差，即分数向小数转化时存在舍入误差，很难保证在第 n 步时得到准确解。

3． 总结 本文首先给出最小二乘问题的定义，随后从盲人下山法开始讨论了共轭梯度法 的具体推导过程及其相关性质与算法.继而重点给出正则化方法的实用共轭梯度算 法并举例进行检验.最后，需要说明虽然正则化方法是求一般线性方程组 Ax b，m n A R m n 且 A 列满秩的最小二乘解的一种方法且简单易行，但是也有许多不

足之处，如 m n 时一般无解；

T A A 形成时运算量大，A 中某些信息会丢失；当 A病

态时其收敛性速度由于

T 2 2(A A)2(A)很大变得非常之慢等，故为了避免正则化方 法的缺点，还可运用残量极小化方法或残量正交化方法等更好的方法来解决此类问 题.在实际的科学与工程问题中，常常将问题归结为一个线性方程组的求解问题，而求解线性方程组的数值解法大体上可分为直接法和迭代法两大类.直接法是指在 没有舍入误差的情况下经过有限次运算可求得方程组的精确解的方法.因此，直接法 又称为精确法.迭代法则是采取逐次逼近的方法，亦即从一个初始向量出发，按照一 定的计算格式，构造一个向量的无穷序列 , 其极限才是方程组的精确解，只经过有限 次运算得不到精确解.当线性方程组的系数矩阵为对称正定矩阵时，我们常用共轭梯 度法（或简称 CG 法）求解，目前有关的方法与理论已经相当成熟，并且已成为求解 大型稀疏线性方程组最受欢迎的一类方法.7