HIV不同病程分子生物学检测

第一篇：HIV不同病程分子生物学检测

HIV不同病程分子生物学检测及结果解读

1310115117 刘航齐

一、HIV核酸检测

HIV核酸检测有定性和定量两类,前者用于HIV感染的辅助诊断,后者常用于监测HIV感染者病程进展和抗病毒治疗效果。

1.PCR检测法(多聚酶链反应)PCR就是利用DNA聚合酶复制DNA的特性,把生物体内的 半保留增殖DNA的过程在体外实验条件下完成。传统的PCR技术比较简便、快捷,但是容易导致“污染”,出现假阳性结果.另外,HIV基因多样性,没有一套引物可覆盖所有HIV序列,使检测敏感性受到限制。从而限制了PCR临床诊断HIV。

不同病株存在遗传变异性，进行PCR扩增时应选择病毒基因组中的高度保守序列区设计引物。当核酸检测阳性，应重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判断为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。HIV核酸检测阴性，只报告本次试验结果阴性。2.刷状DNA检测法

刷状DNA检测法是定量检测血浆中HIV-1型RNA的一种方法。该技术基于分支DNA信号扩大系 统,是人工合成的带有侧链DNA片段,在每条链上都可以标记可被激活的标记物。通过发光强度来定量,发光强度与HIV-RNA含量呈比例。

3.核酸序列扩增系统

核酸序列扩增系统又称自主序列复制系列或再生长序列复制技术,是以RT-PCR为基础,但它无需将逆转录和PCR扩增分作两部进行，将靶核酸RT-DNA扩增和信号放大扩增。4.基因芯片技术

基因芯片技术是 20 世纪 90 年代末发展起来的新技术,是在厘米见方的固相载体上,将基因以微点阵的形式排列,应用核酸杂交的原理来检测未知基因,具有操作简单、自动化程度高、检测靶分子种类多、成本低、结果客观性强等特点基因表达、肿瘤诊断、遗传病诊断、基因分型等诸多领域得到广泛应用。对于抗 HIV逆转录酶和蛋白酶药物的耐药性分析、型检测结果较好,但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检。

二、HIIV抗体的确证 目前我国HIV抗体确证实验采用的方法是免疫印迹法，也就是westen blotting实验，简称WB。WB实验结果有3种，阴性，阳性，和不确定。对于不确定结果每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。虽然抗体确证不属于分子生物学检验，但由于它在临床中经常应用，因此列举出来。下面是HIV抗体筛查流程。

三、分型

在HIV-1型内，根据env基因和gag基因序列的同源性差异可分为三个组：M组、O组和N组。M组内又分为A~K11个亚型，各亚型的基因离散率是25％~35％、同一亚型内的基因离散率是7％~20％。不同亚型可发生重组形成很多流行重组型。

目前HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol区的某一段基因片段的分析。常用的方法有：SBT法、异源双链核酸涌动实验(HMA)、DNA酶联免疫技术、基因芯片法、多重PCR法。

1.HMA：在HIV分型检测中，利用PCR扩增evn或者gag一段核酸序列，同时将各亚型的标准质粒进行扩增，将病毒扩增产物和质粒扩增产物进行混合，经过变性和复性形成异源双链产物，然后进行电泳，根据涌动速度确定亚型。

2.DEIA：该方法是将特异性DNA探针固定在酶标板上，用病毒基因的扩增产物与探针进行杂交，产物与探针形成杂交链，结合抗DNA双链单克隆抗体后通过酶标二抗进行显色，从而确定待测样品的亚型。

3.多重PCR：利用多重PCR进行HIV亚型分析可以直接区别多种亚型。近年来，已针对gag、gp41基因区的亚型特异性引物用于多重PCR进行HIV基因分型，尤其是针对不同流行区的优势流行株设计具有针对性的多种PCR引物，直接通过电泳进行亚种鉴别，不失为一种简便易行的方法。

四、病毒载量的分子生物学检测

病毒载量测定是对感染者或病人体内游离病毒核酸RNA含量的定量测定。通常使用血浆作为检测样品,根据不同要求改进的RNA提取技术使该试验也可使用多种体液和组织。目前使用的病毒载量测定技术主要有3种:RT-PCR、分支DNA信号扩大系统和核酸序列扩增系统。三种技术均由核酸提取、扩增或信号放大、定量检测四部分组成。

五、基因型耐药性的分子生物学检测

目前，HIV-1耐药性基因型检测主要是鉴定病毒基因组的特定区域是否存在与特定抗反转录病毒药物的易感性降低相关的特定突变。

耐药性基因型检测方法种类很多，各类方法主要集中在耐药性突变位点的检测能力和耐药性突变位点的评价能力上。耐药性突变位点检测即指得到序列信息，目前采用的方法主要是序列测定和杂交法等。

1.序列测定法

序列测定法是直接检测HIV基因中与耐药性相关联的基因突变，方法是从HIV感染者血浆中提取病毒RNA，采用PT-PCR方法扩增和耐药性密切相关的基因片段进行序列测定后，使用相关工具软件，根据已建立的耐药性突变位点数据库进行耐药位点分析。2.POLA分析法

美国凯斯西储大学传染病系ARTS实验室研发了一种针对HIV-1pol基因片段的寡核苷酸链接分析法。该技术原理基于DNA连接酶的酶活性结构域对所覆盖的4个碱基识别的高度敏感性以及结构域对所覆盖的4个碱基识别的高度敏感性记忆液相芯片检测的高通量，能同时对20中最常见的耐药突变进行检测。

图1中,A:野生型和突变型模板各50%混合,进行连接识别反应;B:退火过程中,突变BCO的3’端和野生型模板之间发生一个错配(左)而与含突变位点的模板完全互补(右);C:只有与突变模板完全互补的突变BCO与RCO,才能被DNA连接酶连接,而与突变模板有一个错配的野生型BCO与RCO不能被连接酶作用;D:连接酶识别反应的产物与负载了抗标签序列的微球共育。固定在微球上的RCOs 的生物素结合链霉亲和素-R-藻红蛋白报告分子。通过检测报告分子的荧光强度确定样品中突变模板的比例。该方法针对每个待检突变位点设计2种探针:上游的微球捕获探针（BCO）和下游的报告分子捕获探针（RCO）。BCO的5’末端是24个寡糖核苷酸的标签序列，能与特定微球上的抗体标签序列互补结合,3’末端与待检位点上游模板互补结合。针对每个位点设计一对BCO,一个与突变密码子(如TAC编码逆转录酶215位点处AZT(抗病毒药物齐多夫定)抗性的Tvr)配对,另一个与野生型密码子(如AAC编码逆转录酶215位点处的Tyr)配对;每一对BCO的标签序列不同,可结合不同荧光微球。RCO与待检位点下游模板互补,其3 7端标记了生物素,与链霉亲和素一R.藻红蛋白(SA-PE)结合后,可通过液相芯片工作站进行定量检测。研发人员又特别设计了用丁补偿耐药突变之外的模板多态性的竞争寡核苷酸(CMO)和用于去除降低敏感性的非特异性二级结构的寡核苷酸(DNO)。加入反应体系后,进一步提高了检测的敏感陛,对其中17个 突变的检测其敏感性低于0.1%,能全面揭示患者体内优势及劣势耐药突变情况。

六、HIV的分子生物学治疗

目前艾 滋病的防治研究主要是针对 HIV-1 进行的。自从 20 世纪 90 年代后高效抗反转录病毒治疗(HAART)应用于艾滋病的临床,使 HIV-1 患者的病毒载量下降及 CD4+T 细胞水平升高 ,降低了 HIV 的发病率和病死率,显著地改变了 HIV-1 感染者发展到 AIDS 的进程。

1.反义 RNA 反义 RNA(antisense RNA)是指与 mRNA 或DNA 互补的小单链 RNA 分子,通过碱基配对形成 mRNA/ RNA 或 DNA/ RNA 的杂交双链,从而抑制基 因表达并加速其降解。天然的反义 RNA 广泛存在于 各类生物中,是细胞基因表达调控的一种方式。近几年来很多研究通过人工合成的反义 RNA 靶向 HIV-1 蛋白及靶细胞受体等的基因,与靶基因配对形成无功能的双链从而封闭或调节靶基因功能及产物表达,有效地阻断 HIV 在细胞中的复制。

2.RNA 干扰

RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是指小双链RNA 在细胞内特异性地诱导与之同源互补的 mRNA 降解,抑制相应基因的表达,从而引起转录后基因沉默的现象。目前研究的有微小 RNA(microRNA, miRNA)、小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)、短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)均能够介导 RNA 干扰作用。miRNA 是一类广泛存在于真核生物中的单链非编码小分子 RNA,通过与细胞内靶 mR-NA 3’端-UTR 区不完全互补配对或与靶mRNA 完全 互补配对来发挥抑制mRNA翻译或降解靶mRNA的作用。

参考文献：[1] 邢玉兰.艾滋病病原学诊断进展[J].中华检验医学杂志,2001,24(3)[2]刘红英.实验诊断HIV方法的应用与进展[J].职业与健康,2005,21(12)[3]韩卫宁,高勇.HIV耐药性及检测方法最新进展[J].国际生物医学工程杂志,2012,35(4)[4]田雅茹,焦艳梅,张彤等.抗HIV-1基因治疗新进展[J].首都医科大学学报,2014,35(1)

第二篇：HIV、梅毒检测工作要点

黔东南州预防艾滋病、梅毒及乙肝母婴传播项目

工作方法要点

一，乙肝

乙肝表面抗原阳性母亲所生的新生儿，须对新生儿免费注射“乙肝免疫球蛋白”1针（100单位）。并按计免程序注射“乙肝疫苗”。相关工作数据在月报表中反应出来，不需填个案表。

二、梅毒

必须明确一点：不论是哪一级医院，只要用两种不同的检测方法（两种方法：梅毒螺旋体抗原血清学试验、非梅毒螺旋体抗原血清学试验），就可以确诊患者是不是梅毒，不必要到上级医院确诊。

1、若孕期“确诊”为梅毒的孕妇，按国家方案中的“梅毒治疗方案”正规治疗两个疗程。其所生的新生儿在出生时检测新生儿血清中的梅毒抗体（用非梅毒螺旋体抗原血清学试验检测）。可能出现以下三种情况：

（1)新生儿检测阴性：可用国家方案“梅毒治疗方案”中的预防性治疗方法进行治疗。(梅毒治疗参看国家方案中的梅毒治疗方案）

（2）新生儿检测阳性：必须对母亲及新生儿做滴度试验，并比较新生儿及母亲的滴度：若小儿的滴度小于母亲分娩前滴度的4倍的，采用预防治疗方法进行治疗。若小儿的滴度大于母亲分娩前滴度的4倍的，诊为先天梅毒，按先天梅毒治疗方案治疗。（滴度试验法见附件一）

2、对孕期没有接受两个疗程正规治疗的母所生的新生儿，不论检测是否是阴性，都要进行预防性治疗。

3、没有进行滴度检测的，不能诊新生儿为先天梅毒，也就不存在进行先天梅毒的治疗。目前诊断先天梅毒的唯一方法也就是进行滴度试验及对比，因此请各县一定要把这项工作开展起来。

4、因做滴度所消耗的试剂多一些，请各县在做经费使用方案时，对作滴度试验的给预提高报销费用，才有利于工作的开展。

5、对当月的阳性个案须在当月的月报中反应出来，同时填报个案表上报我州保健院。

三、HIV

1、孕期HIV快速检测阳性的孕妇，须做“确认试验”（州级以上疾控中心方可做确认试验）。待确认试验结果出来后，证实为阳性的孕妇才进行管理（具体用药“国家方案”中的治疗法）。

2、产时用“快速检测方法”检测产妇为阳性的，对所生的新生儿要在24小时内服用抗病毒药，并对其母亲其做“确认试验”（州疾控中心），将会出现以下两种情况：

（1）母亲确认试验为阴性的，新生儿停止服药。

（2）母亲确认试验阳性的，新生儿继续服药6周。并指导其要进行人工喂养。每三个月对婴儿进行体检，并网络直报个案表及随访表。

附件一

非梅毒螺旋体抗原血清学试验（实验室滴度检测）方法 采用倍数稀释法对血清进行稀释（新生儿须用静脉血）a、吸50ul血清+TRUST或RPR试剂液悬液1滴＝1：1液 b、吸50ul血清到试管+50ul生理盐水＝1：2液 c、取1：2液50ul+50ul生理盐水＝1：4液 d、取1：4液50ul+50ul生理盐水＝1：8液 e、取1：8液50ul+50ul生理盐水＝1：16液 f、取1：16液50ul+50ul生理盐水＝1：32液 g、取1：32液50ul+50ul生理盐水＝1：64液.......................以此类稀释进行

在各比例倍数液中加入TRUST或RPR试剂，则可以知道其滴度结果。请各县将此法与县里各医疗单位的化验人员进行操作培训，务必会作才行。

黔东南州妇幼保健院 2012.4.12

第三篇：HIV抗体快速检测程序

HIV抗体快速检测程序

目的：用于人对血清HIV抗体检测，用于HIV感染的辅助诊断。监测血液筛查。同时规范本检测点抗体快速检测的方法。保证检测质量和工作有序进行。

适用范围

适用于本艾滋病检测点筛查实验室、检测方法

8.1撕开HIV1+2检测板包装袋，取出检测板水平放置于实验台。8.2在S加样孔中滴2——3滴血清或血浆，不再加稀释液。8.3在15——30分钟内观察结果，超时需重新检测。

9、检测结果判断

9.1阳性：出现质控线和任意一条或两反应线均为阳性。9.2阴性：仅在质控区出现一条红线，则实验结果为阴性。9.3无效：无质控红线，或只有反应线，检测无效。须重新检测。样品同时标记编号及姓名保存，准确记录信息。质量控制

13.3检测样品不得溶血、混浊、污染。不符合优良标本应重新采样。13.4试剂如带质控品，起用前按要求做阳性、阴性质控对照，并做质控记录。

13.5每批试剂盒的购进、厂家、批号、效期及使用、保存数据均应有详细原始记录。

第四篇：2009HIV抗体检测工作总结

2009HIV抗体检测工作总结

一年来，我们一如既往的认真贯彻和落实《中国预防和控制艾滋病中长期规划（1998-2010）》。HIV抗体检测工作严格遵照《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版）和《江苏省艾滋病检测工作管理办法》认真执行。3月份对临床医生进行了医疗安全教育和个人防护培训，对护理人员进行标本采集和个人防护讲座，保证了分析前质量控制，确保了HIV筛查实验室的检验质量，防范了医疗纠纷。应临床需要，HIV抗体检测工作从每周1次增加为每周2次，为患者和临床提供了更及时的服务。

今年，我院共检测HIV抗体标本1381份，比去年增加了50%。门诊免费检测168人，检出1例HIV抗体待复查标本，均按程序上报市疾控中心。参加了省临检中心传染病质控，成绩合格。着重强调个人防护，全年无职业暴露事件发生。

艾滋病问题是全世界面临的重大公共卫生问题和社会问题，在下一个工作阶断，我们要继续做好HIV抗体的质量控制，防止漏检漏报；加强宣传教育，提高检测覆盖面，防止艾滋的漫延。

泗洪县人民医院HIV筛查实验室

2009-9-25

第五篇：HIV快速检测实验室

HIV初筛实验室操作规范

（一）一、抽 血 标 准 操 作 规 程

1、适 用 范 围

需做血液检测的对象。

2、试 剂 与 材 料

碘酒、酒精棉、棉签、橡皮止血带、注射器（一次性采血器）、试管、止血棉。

3、操 作 步 骤

3.1 核对被检者姓名并标价试管；

3.2 请被检者入座，伸出手臂放在采血垫上；

3.3 用橡皮止血带扎紧并请被检者握紧拳头；

3.4 选择静脉，用碘酒棉在采血部位由里向外擦拭（直径约6cm左右）消毒；

3.5 用酒精棉脱碘；

3.6 把一次性注射器（一次性采血器）打开，在采血部位穿刺静脉，抽取血液；

3.7 放松橡皮止血带，拔出针头，同时请被检者用止血棉压迫止血。

二、酒 精 棉 球 的 制 备 1.试剂与材料

无水乙醇（分析纯）、消毒蒸馏水若干、消毒量筒（1000ml）、消毒盛器 2.操作步骤

2.1 把消毒棉放入消毒盛器中待用。

2.2 取165ml消毒蒸馏水到入消毒好的量筒中，再加入一瓶500ml无水乙醇充分 混匀。2.3 把配好的75％酒精到入放有消毒棉的盛器中

三、样品的采集和处理.范围

本章规定了用于艾滋病病毒（HIV）检测的血清、浆和全血样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、CD4+/CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。.操作步骤.1 样品的采集和处理

艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用的血液样品的采集和处理方法如下： 2.1.1血清样品采集和处理

2.1.1.1 用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置1~2小时，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血请备用。

2.1.1.2如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。

2.1.2 抗凝血样品采集和处理

2.1.2.1用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽去静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。

2.1.2.2应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或柠檬酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。

2.1.2.3用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在4~8h内分离PBMC和血浆，否则应在24~48h内分离血浆和血细胞。(病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章4.1中表2；CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品采集要求见第五章4.1。)2.1.3 采集样品注意事项

2.1.3.1采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒有特殊要求）。

2.1.3.2采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作，应带双层手套。2.2 样品的保存

2.2.1 用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20度以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8度。

2.2.2用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80度。

2.2.3 用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。2.3 样品的运送

2.3.1 实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。2.3.2应采用WHO提出的三级包装系统

2.3.2.1 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。

2.3.2.2 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。

2.3.2.3 第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。

2.3.3 血清和血浆样品应在2~8度条件下由专人运送。用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下18~23度运送。每一包装的体积以不超过50ml为宜。2.3.4 运送感染性材料必须有记录。

2.3.5 如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20度以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。

2.3.6 特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。2.4 样品的接收

2.4.1 含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。

2.4.2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告有关领导和专家。

2.4.3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。

2.4.4 打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。2.4.5 因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。2.4.6 接受样品时应填写样品接受单。

四、电 热 恒 温 水 浴 箱 操 作 规 程 1.概 述：

本电热恒温水浴箱主要用于科研单位、医疗单位及化验所检查化验病理血清等用。2.技术性能：

工作环境：常温常压条件下正常工作。

技术指标：温度调节范围：37℃~65℃

温度波动： ±

1℃

温度均匀性： ± 1℃ 3.使用方法：

3.1使用是必须加入温水，可缩短加热时间和节约用电。3.2打开电源开关，电源指示灯亮表示电源接通。

3.3旋转恒温控制器旋钮，加热指示灯亮表示电源接通，当温度表上的温度达到所需使用的温度时，将恒温控制器的旋钮调整在恒温指示灯忽亮忽熄点，待数分钟后即能自动恒温控制。

3.4恒温控制器的刻度，仅可作温度对照指示，并非温度指示刻度。4.点检程序：

4.1 为保证水浴箱温度的 准确性必须每日使用温度计测量水浴箱内水温，并做好日温度记录。

4.2每半年由设备科检测校正一次，且附有原始记录。5.注意事项：

5.1箱外壳必须有效接地。

5.2在未加水前，切勿开电源，以防止电热管内的电热丝烧坏。5.3非必要时，请勿拆开右册盖板，以利安全。

文县妇幼保健站