细胞骨架组分的荧光染色观察

第一篇：细胞骨架组分的荧光染色观察

细胞生物学实验报告

细胞骨架组分的荧光染色观察

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一、实验原理

鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用。因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。

二、实验目的

1．掌握细胞骨架的显示方法 2.掌握荧光显微镜的使用方法

3.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

三、实验器材 1.材料：

CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 2.试剂：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液。4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液。3.仪 器

超净工作台、CO2培养箱、荧光显微镜 4.其它用品：

盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。

四、方法与步骤

由于上节课鸡胚成纤维细胞被污染，本次实验所用细胞为CHO细胞（1）准备好实验器材。（本次实验无需在超净台中进行）

（2）将上节课进行细胞爬片的培养皿从培养箱中取出，取出盖片，于小平皿中。（3）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100处理约10min(1mL)（5）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)（7）37℃预温 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10µL湿盒中室温染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。（10）37℃预温 PEM洗数3次，滴加10µL Ho.33342复染色。（11）荧光显微镜下观察并拍照。

五、注意事项

1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。2.注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 3.各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 4.荧光观察注意避光操作，防止荧光淬灭。5.节约试剂。

六、实验结果

本次实验我们对CHO细胞爬片结果进行了荧光染色，在荧光显镜下用不同波长的激发光对细胞骨架微丝结构及细胞核进行了观察、拍摄照片并将结果叠加。得到以下的实验现象：

图1.CHO细胞微丝荧光染色图

图2.CHO细胞核荧光染色图

图3.CHO细胞微丝及细胞核荧光染色合成图

从拍摄的照片可以较为清晰的看到CHO细胞骨架的微丝被染成了绿色，细胞核被染成蓝色；微丝的形状为长条的纺锤状细丝，遍布整个细胞，在细胞中起到了类似骨架般的支撑作用；细胞核为椭圆形，之后再将两图合成，可观察到细胞核被遍布的微丝结构包围。实验较为成功。在实验时要注意荧光染料均存在淬灭问题，所以要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。

【参考文献】

[1] 桑建利, 谭信.细胞生物学实验指导.北京:科学出版社, 2010.[2] 北京师范大学生命科学学院.细胞生物学实验.北京:北京师范大学生命科学学院,2015.9.

第二篇：细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察

细胞生物学实验

细胞骨架组分的荧光染色观察

一、实验目的

1、掌握细胞骨架的显示方法

2、掌握荧光显微镜的使用方法

3、了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

4、了解荧光探针Hoechst 33342（Ho.33324）与细胞成分的结合特性和光谱特性

二、实验原理

1、微丝股价是一种高度动态的三维网状结构，与细胞的多种生理活动如细胞运动、胞质分离、细胞器的定位、细胞内物质的运输、吞噬作用、细胞极性生长等密切相关。

2、鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

3、由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。

三、实验材料

1、材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）

2、试剂：

（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM

EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇

（2）0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。

（3）4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。

四、实验步骤

1、取出上次实验爬片于小盖玻片上的CHO细胞；

2、取出培养有CHO细胞的盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)4、37℃预温 PEM洗3次

5、加入0.5%Triton X-100处理约10min(1mL)；

6、取一洁净的载玻片，按照其的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L湿盒中室温染色30min；

7、在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片； 8、37℃预温 PEM洗数3次；

9、滴加10L Ho.33342复染色；

10、荧光镜下观察。【注意事项】

1、注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；

2、各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；

3、荧光观察注意避光操作

4、节约试剂。

五、实验结果

图一：CHO细胞微丝荧光染色图

图二：CHO细胞细胞核荧光染色图

图三：CHO细胞微丝与细胞核荧光染色叠加图

六、实验结果分析

染色后微丝呈绿色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。但细胞数量较多，导致有些染色结果重叠。

七、思考题

1、PEM缓冲液的作用是什么？

细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成G-actin；而在Mg2+和高浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境，让单体肌动蛋白（G-actin）聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。同时，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin装配成F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。2、0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。

3、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？

（1）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。（2）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。

参考文献：细胞生物学实验(桑建利, 谭信)

第三篇：细胞骨架的观察

细胞生物学实验

细胞骨架的观察

姓名：邓燕玲 学号：201011202912 专业：生命科学生物科学 实验时间：20121030 指导老师：张伟 同组同学：张丽华

细胞生物学实验

实验目的

1.了解细胞骨架的组成、结构和功能。2.学习细胞骨架标记的原理和方法。3.学习用鬼笔环肽标记微丝的方法步骤。

4.观察小鼠胚胎成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞的细胞微丝骨架。5.讨论细胞骨架在中学中教学的重点与难点。

实验原理

1.细胞骨架一般是指真核细胞质内的蛋白质纤维网架系统。广义大的细胞骨架包括细胞膜骨架、细胞核骨架和细胞质骨架。直至1963年，科学家用戊二醛在室温下固定成功后，人们才广泛地观察到各类细胞骨架纤维的存在。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维。不同成分有不同的结构和功能。细胞骨架处于不断地动态平衡中，并且有极性。2.微丝的标记方法可分为在固定细胞中标记和在活体中标记。本实验采用的是固定细胞标记，主要运用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，这需要对样品进行化学固定和膜的通透。

3.荧光探针是一种标记物，其中包含的荧光物质在从外界吸收能量后变成激发态，在回到基态时以电磁波的形式释放能量，从而产生荧光。荧光物质在受到长时间的照射后会淬灭。

4.鬼笔环肽（phalloidin）是一种剧毒生物碱，能结合F-actin，而不与G-actin结合，并且在结合后可以抑制微丝的解聚，破坏微丝聚合和解聚的动态平衡。鬼笔环肽对细胞有毒害作用，因此不利于活体细胞的研究。

5.荧光显微镜是用于观察和分析样品中产生的荧光物质的成分和定位的一种光学显微镜，荧光物质在受到激发光的激发下，会发出比激发光波长更长的光，从而在显微镜下观察。

实验器材

1.材料：小鼠胚胎成纤维细胞、CHO中国仓鼠卵巢细胞

2.试剂：PEM缓冲液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：荧光显微镜 实验步骤

1.将小培养皿中的培养液用移液枪吸掉，加入预热的1mlPEM清洗，注意不要打在盖玻片

细胞生物学实验

上，洗三次。

2.加入1ml37°C预热的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入预热的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段与载玻片宽度一样的封口膜，将封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10L的 55nM Alex –phalloidin，将载玻片有细胞的一面朝下盖片，在暗盒中静置25min。7.用37°预热的PEM洗三次，将载玻片有细胞的一面朝上转移到一个新的载玻片中，在荧光显微镜下观察并拍照。

实验结果 思考题

1.PEM缓冲液的作用是什么？

答：促进微管中肌动蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形态固定，便于观察。2.1％Triton X-100处理细胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂类和蛋白质，使细胞膜穿孔，便于标记物质进入细胞。3.如何在中学教学中推进细胞骨架的教学？

第四篇：2014 细胞生物学实验课内容(细胞形态观察、细胞器活体染色、细胞骨架观察)

实验三 细胞形态的观察

【实验目的】

1.认识光学显微镜下细胞的形态结构； 2.掌握临时制片和显微绘图的方法。

【材料、器材和试剂】

材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱鳞茎；

器材：显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸； 试剂：1%碘液。

【方法和步骤】

1.口腔黏膜上皮细胞的制片与观察

口腔黏膜细胞涂片标本的制备：吸取一滴碘液滴在一张洁净的载玻片中央，用一根事先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，然后，将其放入载玻片上的染液中并来回搅动使细胞散开，染色1 min左右后小心加盖玻片（尽量避免产生气泡），用滤纸吸去盖玻片周围的液体。

观察：将自制的口腔黏膜上皮细胞标本装片置于显微镜下观察，先用低倍镜观察较分散的、轮廓清晰的黏膜上皮细胞。由于该细胞体积较小、着色较淡，观察时应稍降低视野亮度以便于较快找到目标（在低倍镜下，用碘液染色的细胞呈黄色，成群或分散分布，形态大小多呈扁平椭圆形）。选择轮廓清晰的细胞移至视野中央，转换至高倍镜下观察。在高倍镜下，可见口腔黏膜上皮细胞外围有一层薄薄的细胞膜，扁圆形的细胞核呈深黄色，细胞质呈浅黄色或浅蓝色，核中央致密的结构为核仁。

2.洋葱鳞茎内表皮细胞的制片与观察

表皮细胞装片标本的制备：取一干净载玻片，在其中央滴一滴碘液，将洋葱鳞茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用剪刀在内表皮划“田”字形小方格，每一小方格边长3-4mm，然后用镊子轻轻撕下一小方格的膜质表皮，置于载玻片的碘液滴中铺平，取一干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓地盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。

观察：将制备好的装片标本放到显微镜下，先用低倍镜观察，可见许多长柱状、排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中一个典型的细胞移至视野中央，再转换至高倍镜下仔细观察细胞壁、细胞核、细胞质和液泡等结构。

【实验结果】

绘图并进行适当标注：人口腔黏膜上皮细胞和洋葱鳞茎内表皮细胞。【讨论】

简述观察细胞形态时，制作临时装片和显微镜镜检时的注意事项。

实验四 线粒体和液泡系的活体染色

【实验目的】

1.掌握一些细胞器的超活性染色技术和原理。

2.观察动物、植物细胞内线粒体和液泡系的形态、数量和分布。

【材料、器材和试剂】

材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱；

器材：显微镜、牙签、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片；

试剂：Ringer溶液；1/5000詹纳斯绿B溶液；1/3000中性红溶液。

【方法和步骤】

1.线粒体的超活染色与观察

（1）人体口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色和观察

① 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液； ② 用一根预先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加一滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于显微镜下观察；

③ 在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，转换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或棍棒状的线粒体。（2）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色和观察

① 用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴在干净的载玻片上，然后用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10-15min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。

2.液泡系的超活染色和观察

① 洋葱鳞茎内表皮一小块，置于1/3000中性红溶液中，染色5-10min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察，可见被染成砖红色的中央大液泡。

【实验结果】

1.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎内表皮细胞和人体口腔黏膜上皮细胞线粒体分布图。2.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎表皮细胞指示液泡系的形态和分布。

【讨论】

1.简述线粒体詹纳斯绿B活体染色和液泡系中性红活体染色的原理； 2.分析线粒体和液泡系活体染色时需要注意的事项。3.细胞内线粒体的形态和分布有何特点？

实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察

【实验目的】

了解细胞骨架的结构特征及其样品制备技术。

【材料、器材和试剂】

材料：洋葱鳞茎；

器材：普通光学显微镜、5Oml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸；

试剂：M 缓冲液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸缓冲液；1% Triton X-100；0.2%考马斯亮蓝R250；3%戊二醛。

【方法和步骤】

1.撕取洋葱鳞茎内表皮（约lcm大小若干片）置于装有pH 6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；

2.吸去磷酸缓冲液，用l% Triton X-100处理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M缓冲液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；

5.pH 6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10min； 6.0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30min；

7.用蒸馏水洗1或2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

2【实验结果】

绘制洋葱鳞茎表皮细胞微丝束的分布图。

【讨论】

1.阐述采用考马斯亮蓝R250染色法显示微丝的原理； 2.分析和论述在光学显微镜下观察到的细胞骨架的形态特征。

第五篇：细胞骨架观察实验设计

细胞骨架观察实验设计

I、实验内容

一、正常细胞

二、秋水仙素处理 三、VP16处理 四、低温处理 II、实验流程

一、细胞传代

二、细胞爬片

1~2d

三、细胞处理

6h

四、细胞固定、免染、观察

1d III、实验过程

一、细胞传代

1、实验材料

VEC

2、实验器材

超净台、CO2培养箱、普通冰箱、倒置显微镜、离心机、离心管、微量加液器、吸管、细胞培养瓶（皿）、镊子、酒精灯、消毒酒精、废液缸

3、试剂

胰酶、PBS、培养液（牛血清、双抗）

二、细胞爬片

已处理盖片

三、细胞处理

细胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、细胞固定、免染、观察

1、实验材料

已处理的爬片

2、实验器材

离心机、离心管、玻璃培养皿、载玻片、滤纸、封口膜、温箱、荧光显微镜、微量加液器、镊子

3、试剂

PBS、BSA封闭液、一抗、二抗、蒸馏水、DAPI

4、步骤

固定

爬片置于玻璃培养皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸弃PBS，加-20℃预冷甲醇，固定5min 吸弃甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸弃PBS，加100uL 2﹪BSA封闭液，盖上培养皿盖，室温固定15min 滤纸吸去片子上封闭液，加30uL（1:500）稀释一抗，盖上封口膜（勿大于盖片），37℃孵育30min ,边上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在边缘吸弃PBS（滤纸），滴加30uL（1:200）稀释二抗，避光，盖封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸弃PBS，蒸馏水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干净载玻片上，滴加3uLDAPI，将爬片镊子夹上，反盖于防淬灭剂上 荧光镜观察

IV、注意事项

1、区分盖片正反面

2、保持样品湿润

3、一抗二抗孵育后，封口膜轻轻冲起

4、二抗孵育后，避光操作，以免荧光淬灭

5、标本染色后立即观察，不看时4℃保存