考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架

第一篇：考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架

考马斯亮蓝R250染色法观察细胞骨架

高熹 1120152430（李安一）

（北京理工大学生命学院16121501班）

摘要：狭义的细胞骨架概念是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系微管、微丝及中间纤维组成的体系。考马斯亮蓝R250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合的一种物质，用于微量蛋白质染色。该实验通过植物和动物细胞的细胞骨架染色，观察细胞骨架，使我们掌握了动植物细胞内微丝的染色方法。关键词：细胞骨架；考马斯亮蓝；微丝；染色；实验 引言

由微管、微丝和中间丝所组成的蛋白纤维网架结构体系称为“细胞骨架系统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称“细胞内的三大系统”。是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。广义的细胞骨架概念是细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和胞外基质所形成的网络体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。发现较晚，主要是因为一般电镜制样采用低温（0-4℃）固定，而细胞骨架会在低温下解聚。直到20世纪60年代后，采用戊二醛常温固定，才逐渐认识到细胞骨架的客观存在。真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。

微丝普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm一般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1%-2%，但在活动较强的细胞中可占20%-30%。在一般细胞主要分布于细胞的表面，直接影响细胞的形状。微丝具有多种功能，在不同细胞的表现不同，在肌细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩（收缩蛋白），在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌动蛋白构成，和肌球蛋白一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩。微丝是双股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维，直径为7纳米，螺距为36纳米，两股肌动蛋白丝是同方向的。肌动蛋白纤维也是一种极性分子，具有两个不同的末端，一个是正端，另一个是负端。微丝与它的结合蛋白以及肌球蛋白三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运动。由微丝形成的微丝束称为应力纤维，常横贯于细胞长轴。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。聚合的及非聚合态的肌动蛋白能与其多种结合蛋白相互作用，这些结合蛋白对肌动蛋白的聚合及对微丝的稳定、长度及分布具有调节作用。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。一般当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，即应力纤维。应力纤维上还周期性地分布着微丝结合蛋白，包括-辅肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、类肌钙蛋白等。应力纤维的端部连接着质膜上的粘着斑，与加强细胞对基质的附着、铺展及维持细胞特定形状有关。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染色微丝，实验中用1％Triton X－100抽提掉胞质中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。实验器材及试剂

2.1 器材

光学显微镜、温箱、细胞培养设备、平皿、直径30mm小染缸、载波片、盖玻片条（剪掉一角以区别细胞正反面）。2.2 材料

体外培养的贴壁生长的HeLa细胞、洋葱鳞茎。2.3 试剂

细胞培养基（DMEM、RPMI－1640等）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.4）、0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.3）、M－缓冲液、1％Triton X-100（用M－缓冲液配制）、0.2%考马斯亮蓝R250、3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）。实验步骤

3.1 HeLa细胞染色

（1）细胞培养在平皿中的盖玻片上，尚未致密时即可使用。取出盖玻片，用PBS洗3次。

（2）用1％Triton X-100处理25～30min，室温或37度均可。（3）立即用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。

（4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞5～15min。（5）PBS洗数次，滤纸吸干。

（6）用0.2%考马斯亮蓝R250染色1小时，然后用水小心冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。

（7）普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。3.2 植物细胞染色

（1）取洋葱鳞茎表皮，大小约1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液（6.8）的小烧杯中。

（2）吸去缓冲液，用1％Triton X-100处理洋葱表皮20～30min。（3）除去Triton X-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10min。（4）加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制，pH6.8）固定0.5~1h。（5）用PBS洗3次，滤纸吸去残液。（6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。（7）蒸馏水洗数遍。将样品置于载玻片上，加盖玻片，光学显微镜下观察。实验结果

图1 Hela细胞骨架染色图

图2 洋葱鳞茎细胞骨架染色图

结果分析

由实验结果来看，图2洋葱鳞茎细胞的细胞骨架染色较为成功，可以清楚地在图中看到染成蓝紫色的微丝细胞骨架。而Hela细胞骨架染色出现了一些问题，显著观察到的是细胞出现了破裂，造成细胞被染色的部分游离分散在了玻片上，由于分工不同，Hela是李安一同学做的，在与他交流后，分析可能是最后蒸馏水冲洗的时候操作不当，可能造成了细胞的吸水胀破，引发了细胞骨架的游离的现象。而这种现象在班里很多组里都有出现，因此，这里考虑实验步骤的错误，改进方法为可以用缓冲液去洗涤脱色。实验反思

本次实验步骤无明显错误，最后部分结果不太好，在排除自身操作的同时，对实验步骤产生一定的质疑，未来的实验不能按图索骥，要勤于思考，对每一步加深了解并给出自己的见解。参考文献

[1]赵孟莲, 牛敏英, 范保荣,等.用考马斯蓝R250(Coomassie Blue R250)显示人成纤维细胞内微丝的观察[J].解剖学报, 1983(2).[2]刘宇炜, 文若剑, 向赟.热疗后Hela细胞微丝和形态改变关系的研究[J].江汉大学学报(社会科学版), 2003, 31(2):13-16.[3]王崇英, 高清祥.细胞生物学实验[M].高等教育出版社, 2011.

第二篇：考马斯亮蓝染色总结

12.5％考马斯亮蓝染色液的配制（含30％甲醇，10％乙酸）考马斯亮蓝R250 0.125g 甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加ddH2O至 100ml 染胶1h~2h 脱色液配制（含30％甲醇，10％乙酸）甲醇 30ml 冰乙酸 10ml 加dd H2O至 100ml 注：1.染色液可回收利用；室温保存即可；甲醇可以用乙醇代替。

2.其它脱色液：

（1）用水脱色，但效果非常不好，建议不要用。

（2）脱色液也可以用0.5％mol/l的氯化钠，没有气味，脱色效果也不错。但胶可能会胀的厉害!（3）20%的甲醇和0.1M的tis-磷酸（PH6.5）

先用tis-磷酸（PH6。5）漂洗2min，然后用20%的甲醇漂洗1min（最好不要超过1min），最后用20%的NH4SO4固定30min 3.dd H2O煮法脱色

PAGE胶染色完毕后，如果用一般的甲醇－乙酸脱色液进行脱色，一般至少需要2－3h，可利用蒸馏水煮的方法：（1）.先将500ml蒸馏水放在一个干净的烧杯中，在电炉上煮沸。（2）.将染色好的胶用DD水冲净后放入煮沸的蒸馏水中，煮3～5min。

（3）.将DD水倒掉，看胶是否已经脱净，如果还不好，可以用少量水再煮一次。一般整个脱色过程最多15min即可搞定！还可以避免每次脱色时的醋酸味！4.重复利用

（1）染色液和脱色液重复次数不一定的,可以根据他们的着染能力和脱色能力考虑是否换新的.夏季甲醇挥发快,用3~5次应该可以用.当然,用时要加盖.（2）脱色时注意防止挥发,脱色液可以用活性碳处理后反复用多次的.（3）脱色液反复使用，用两三次后用活性炭“包被”的滤纸过滤，滤纸可反复使用。脱色液反复使用后，胶有点泛红，但不影响观察，如果要发表，建议用新配脱色液。

5.加快染色和脱色速度

（1）染色和脱色都可以在微波炉中加热甚至煮沸，很省时间。但注意不要沸腾时间太长，否则容易把胶上煮出泡状的破损。

（2）若为了提高考染及脱色速度，可在45℃左右的水浴中进行，染色时间只需几分钟（其间轻轻晃动一二次，整个胶变为较深的亮兰色即可）。脱色也在水浴中（约需15分钟），（3）胶放入用乙醇-乙酸配成的脱色液后微波加热10秒钟至微热,上摇床,10分钟后,倒掉,换新的脱色液重复一次,不超过半个小时也好了.（4）用乙醇和乙酸配脱色液,然后加热脱色，很快的，可加热到马上要沸腾为止。不但脱色可以，染色也可加热，速度也很快（5）用蒸馏水洗胶，并放在微波炉里加热，效果很好。

只是要掌握好时间，时间太长而蛋白的含量又比较低的话，容易脱过了！

（6）加入甲醇－乙酸脱色液后，将其直接放到微波炉里加热一分钟，然后放几张干净的tissue进去（把它叠成条状，沾在脱色皿边上就OK啦!(不要和胶混在一起）)，能吸去很多染料，加快脱色，效果不错。6.注意问题

（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。

（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；《分子克隆》：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。7.胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”）