第一篇:PCR技术详细步骤-从RNA抽提到电泳鉴定
PCR技术详细步骤-从RNA抽提到电泳鉴定
(2010-04-21 21:16:04)转载 标签: 杂谈 分类:须一技之长,专业
RNA抽提 一,准备工作
1,实验器具与材料:
(1)移液枪:1ml、200ul、10ul(2)吸头:1ml、200ul、20ul(3)吸头台:放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个(4)EP管1.5ml、100ul(5)玻璃研磨器(6)容量瓶:1000ml(7)盐水瓶:100ml(8)15ml塑料管一个(配75%乙醇用)2,实验器具的处理与准备
(1)塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
(2)玻璃制品:(主要是玻璃研磨器)
先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
(3)金属制品:(镊子等)
先洗干净,再送干烤3次。(不需要泡DEPC水)3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75%乙醇的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。
(2)75%乙醇(要在抽提时现配):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放于-20℃备用。(3)异丙醇:放入棕色瓶(4)氯仿:放入棕色瓶
(5)Trizol:100ml/瓶 存放于4℃ 二,抽提时注意事项:
全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。三,抽提步骤 1. 匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下,室温静置5分钟。2. 分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3. RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。3 4. RNA的洗脱
小心倒掉上清,留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次,后7500rmp离心5分钟。5. RNA的再溶解
小心倒掉上清,取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟,此时RNA沉淀变透明)。注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。再在管中加20ul的DEPC水溶解,在55-60℃下孵育10分钟助溶。6,RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录。TRIzol法抽提总RNA 细胞1×107 组织100mg ↓
加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)↓
颠倒混匀10下,室温5分钟 ↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)↓
颠倒混匀15S,室温5分钟 ↓
4℃,离心12000rmp,15分钟 ↓
转上层水相(约400-500μl)于另一新1.5mlEP管中 ↓
加等体积异丙醇(约400-500μl),混匀后-20℃中1小时 ↓
4℃,离心12000rmp,10分钟 ↓ 弃上清 ↓
加冰预冷的75%乙醇(用高压后的DEPC水配)1ml ↓
4℃离心7500rmp,5分钟 ↓
弃上清,超净工作台开风机干燥约30分钟(不能完全干燥)↓
溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录 4 逆转录(RT)一,准备工作
1,实验器具与材料:(1)移液枪:200ul、10ul(2)吸头:200ul、20ul(3)EP管1.5ml、100ul(4)水浴箱
2,实验器具的处理与准备 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法:(新合成的引物的稀释)假如终浓度为X uM(pmol/ul)加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)二,RT时注意事项:
为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。三,RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)1,准备0.65ml的EP管
2,冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。3,65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4,短暂离心后,冰上操作:加入4ul 5×First-Strand Buffer,1ul 0.1MDTT,1ul RNAse Inhibitor,1ul SSⅢ逆转录酶。5,短暂离心
6,50℃水浴60分钟进行逆转录。7,70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8,-20℃保存,或立即进行PCR。用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)1,准备0.65mlEP管
2,加入4.5ul DEPC水,1ul引物,1ul模板RNA 3,稍离心,100℃沸水裕1min 4,加入0.5uldNTP,2ul 5×Buffer,1ul AMV逆转录酶 5,稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT 6,100℃沸水裕3min灭活AMV 7,立即PCR或-20℃保存。5 聚合酶链式反应(PCR)二,准备工作
8,实验器具与材料:(1)移液枪:200ul、10ul(2)吸头:200ul、20ul(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个(4)EP管1.5ml、100ul 2,实验器具的处理与准备
(1)塑料制品:(包括吸头、EP管等)送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。3, 试剂配制和准备:
(1)双蒸水: 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)PCR中所需要的各种试剂 三,PCR时注意事项:
佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。四,PCR步骤 1,准备100ul EP管
2,依次在管中加入:(50ul反应体系)ddH2O 37.5ul ×? 10mM dNTP 1ul ×? 10×PCR buffer 5ul ×?
25mM Mgcl2(加之前要摇匀)3ul ×? 上游引物 1ul ×? 下游引物 1ul ×? 模板cDNA 1ul 3,稍离心
4,100℃沸水浴1分钟
5,趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)6,再加入50ul液体石蜡封闭 7,10000rmp离心1分钟 8,PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec
进行40个循环,然后72℃ 10min 完后4℃保温。9,10000rmp离心5min 10,将下层水相转入新的0.65mlEP管中,-20℃保存。6 电泳鉴定 一,准备工作 1,实验器具与材料:(1)移液枪:10ul(2)吸头:20ul(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个(4)三角烧瓶:50ml一个(5)琼脂糖
2,实验器具的处理与准备(1)塑料制品:(包括吸头等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。(2)电泳板及电泳槽: 用自来水冲洗干净备用 3, 试剂配制和准备:(1)电泳缓冲液(TAE):
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液:将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中,在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0(约需4gNaOH)。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。
再配制50×TAE溶液:在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱,加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液,再加蒸馏水定容至500ml,室温保存。(2)琼脂糖溶液(1.0%):
50×TAE溶液取10ml,稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖,电炉上煮至沸腾,溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中,在室温下放置45min左右后进行电泳。(3)溴化乙锭(EB)(10mg/ml):
在20ml水中加入0.2g溴化乙锭,磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中,室温保存。
(4)加样缓冲液(Loading Buffer)一般为6×Loading Buffer 二,电泳鉴定时注意事项:
佩戴一次性手套,避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的,不要超过两周。五,电泳步骤
1,50×TAE取10ml稀释成500ml,取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。
9,用透明胶封闭电泳板,琼脂糖溶液冷却至温热时,倒入带梳子的电泳板中,冷却后,拔出梳子,放入电泳槽中。
10,加样:PCR Marker:1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混匀于塑料膜上,加入孔中。PCR样品:5ul 样品DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。11,接上电源,电压120V,电流50mA进行电泳。12,电泳约1小时后,紫外灯检测。