质粒DNA的抽提与纯化 (附注问题非常详细)

第一篇：质粒DNA的抽提与纯化 (附注问题非常详细)

质粒DNA的抽提与纯化(附注问题非常详细)

目的： 采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术

原理： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂 仪器（见附录）：

主要试剂： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH 1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc(pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTA

实验方法：

1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时

2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒

3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟

5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟

6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟

7．12000rpm离心15分钟 8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次

9．加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3 mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀

10． 置于-20℃冰箱1～2小时

11． 15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀 12． 70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干

13． 将沉淀溶于50μl TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20℃保存 14． 取样5μl，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。

附注：

1．溶液Ⅰ--－溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。EDTA的作用：

（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的PH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性.SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3…R┿-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。3．溶液Ⅲ--3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸.所以该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液.用PH4.8的NaAc溶液是为了反pH12.6的抽提液,调回PH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在.而高盐的3MOL/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之.前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全.4.为什么用无水乙醇沉淀DNA? 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂.DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇来替代懈水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵).但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率.折中的做法初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇.也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA.一般在室温下放置15-30分钟即可.5.在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1－0.25MOL/L? 在Ph为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na2+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与Kac来处理? 加进去的Rnaese本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加Kac使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全.也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到较好的效果。7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%.本实验选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.9.抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好? 酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水想有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走.也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用.10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇? 在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容光焕发器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用.加入异戌醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生.一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比.也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成,)节同时异戌醇有助于分相,使离必后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定.11.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化? 因为酚与水有一定的互溶.苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失.用Tris调节至PH为8是因为DNA在此条件下比较稳定.在中性或碱性条件下(PH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品.保存在冰箱中的酚,容易被空气氧公而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用.为了防止酚的氧化,可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至终浓度为0.1%.8-羟基喹啉是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制Dnase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris PH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子这宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

第二篇：质粒DNA抽提实验报告

质粒DNA抽提实验报告

一．实验目的：

1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。

2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。

二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：

1.5mlEP管、高速离心机、移液枪

溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH、1% SDS 溶液III： 3 mol/L NaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 7.51 mmol/L EDTA 四．实验步骤:

1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/min离心1min，去上清液（重复一次）

2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞

3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min

4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min

5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min

6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min 7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干

8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用

五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNA

PCR以及电泳实验报告

一．实验原理：

PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。

二．实验仪器及试剂：

EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等 DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶

三．PCR反应体系（25μl）2× PCRmix 12.5μl 引物1 1μl 引物2 1μl 20ddH2O 10.5μl

四．操作步骤 1、94℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次 2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次 3、72℃，10s

4、电泳检测

五．实验结果分析

分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：

如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的

2000bp 1000bp

750bp 500bp 250bp 100bp 实验组

对照组

第三篇：质粒抽提常见问题与解答

1.没有提出质粒或者质粒收获量很低

A菌种老化

建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。

B低拷贝质粒

建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。

C质粒丢失

建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。

D裂解不充分

建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。

EBuffer中有沉淀未溶解

建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。

G离心柱中乙醇残留

建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。

H洗脱液加入位置不正确

建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。

I洗脱液pH值不正确

建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。

J洗脱体积的选择

建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。

K洗脱时间的选择

建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。

2.质粒纯度不高

A蛋白质污染

建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。

BRNA污染

建议：检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseA。

C基因组DNA污染

建议：加入BufferB1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。

D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株

建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。

3.加样时DNA飘出加样孔外

原因：柱中残留乙醇未除干净。

建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。

第四篇：基因重组质粒的构建与抽提

基因重组质粒的构建与抽提

摘要....................................................................................................................................................Ⅰ Abstract............................................................................................................................................Ⅱ 引言.......................................................................................................................................................1 1 材料与仪器、用品.........................................................................................................................2 2 原理与方法......................................................................................................................................3

2.1 获取目的基因.......................................................................................................................3

2.1.1提取RNA.................................................................................................................3 2.1.2 RNA反转录为cDNA............................................................................................3 2.1.3 聚合酶链式反应......................................................................................................4 2.2 回收目的基因.......................................................................................................................5

2.2.1 核酸电泳....................................................................................................................5 2.2.2 胶回收........................................................................................................................6 2.3 DNA分子体外连接.............................................................................................................7 2.4 转化.......................................................................................................................................7 2.5 抽提鉴定质粒.......................................................................................................................8 3 讨论...............................................................................................................................................10 3.1试剂.....................................................................................................................................11 3.2 核酸酶................................................................................................................................11 3.3 核酸电泳缓冲液...............................................................................................................11 3.4 胶回收效率........................................................................................................................11 3.5 DNA酶切位点..................................................................................................................11 3.6 转化效率............................................................................................................................11 3.7 试剂盒................................................................................................................................12 参考文献...........................................................................................................................................13 致谢....................................................................................................................错误！未定义书签。附录....................................................................................................................................................14

Contents Chinese Abstract............................................................................................................................Ⅰ Abstract.........................................................................................................................................Ⅱ Preface.............................................................................................................................................1 1 Materials and equipment, supplies...............................................................................................2 2 The principle and method.............................................................................................................2 2.1 Acquire target gene...............................................................................................................2 2.1.1 Extraction of RNA........................................................................................................2 2.1.2 RNA transcription for cDNA.........................................................................................3 2.1.3 Polymerase chain reaction..............................................................................................3 2.2 Recycling target gene............................................................................................................5 2.2.1 Nucleic acid electrophoresis...........................................................................................5 2.2.2 Plastic recycling.............................................................................................................4 2.3 Connection of DNA molecules in vitro.................................................................................5 2.4 Transformation......................................................................................................................2.5 Extraction and identification of plasmid...............................................................................6 3 Disguss.......................................................................................................................................10

3.1 Reagent................................................................................................................................11

3.2 Nuclease..............................................................................................................................11

3.3 The nucleic acid electrophoresis buffer...............................................................................11

3.4 Efficiency of plastic recycling.............................................................................................11

3.5 DNA enzyme loci................................................................................................................11

3.6 The efficiency of conversion...............................................................................................11

3.7 Kit........................................................................................................................................12 References.....................................................................................................................................10 Acknowledgement.........................................................................................................................10 Appendix.......................................................................................................................................10

引言

自噬是一种实现细胞本身代谢需要和某些细胞器更新的生命活动，该活动对于动物机体生长发育具有重要意义。自噬相关基因LC3通过与细菌质粒结合可以大量复制。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。不同微管之间的差异，主要与结合于微管的非微管结构蛋白有关，它们参与微管结构的组装，维持微管的稳定LC3和微管与其他骨架纤维之间的连接，表现为广泛的功能性作用，该类蛋白被统称为微管相关蛋白，LC3即微管相关蛋白轻链3，作为动物机体的一个自噬相关基因，对于其自噬活动相关微管蛋白质表达具有重要意义，目前国内外对该基因研究逐步增多、不断深入。Vega-Naredo等研究表明LC3 调控对巨噬过程是至关重要的,因为蛋白质LC3-II定位自噬前体和自噬小体,它被认为是一个自噬标记，在其对两性哈德氏腺的实验中，免疫印迹分析显示了LC3-I和LC3-II两个对应波段[1]；Hanqing Dong等的发现表明,LC3 结合可能发生在脂滴表面,导致限制膜形成，在原位分隔脂滴的一部分，其他脂滴的候选识别是脂滴-相关蛋白质；Noboru Mizushima和Masaaki Komatsu的文章叙述了选择性自噬最有特性的基质是p62,它也被称为死骨片1 / SQSTM1，p62是广泛表达的细胞蛋白质,在动物中守恒,但在植物和真菌不是，在分隔膜中通过LC3-作用区域p62直接与LC3相互作用[3]。此次实习实验过程中，将该基因作为目的基因，采用基因克隆技术构建重组基因，并提取出目的基因。提取出的目的基因可成为相关研究、实验的组成环节，例如用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学检验，以及动物机体蛋白质表达控制研究、自噬研究等。

质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子，即细胞附殖粒、又称胞附殖粒。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中，总体多为原核生物。构建重组质粒指将目的基因，即外源基因，与具有自主复制能力的载体在体外人工连接，构建成新的重组DNA，随后抽提质粒可以将目的基因与细菌DNA分离，以获得高纯度的目的基因。笔者通过实验学习、实际动手操作，完成了此质粒的构建和抽提过程，并在文中阐述了获取目的基因后而进行的LC3基因克隆过程，其中使用GFP、RFP载体构建质粒。基因克隆又称为分子克隆，指采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子的过程。其是七十年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可简要叙述为分、切、连、转、选五个步骤。其最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制，即把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入细菌中，建立基因克隆体系。本实验构建含GFP-RFP-LC3基因的重组质粒，GFP、RFP分别为绿色和红色荧光基因；使用的T载体为克隆载体，符合基因工程的载体应具有的基本性质，包括在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，使外源重组的DNA片段得以扩增；分子量小，利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段，且在实验操作中也不易被机械剪切而破

[2]

坏；载体分子中具有两个以上的容易检测的遗传标记，以赋予宿主细胞的不同表型特征；载体具有较多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。

细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质，最终获得高纯RNA产物的过程，目前，国内外提取RNA的技术均比较成熟，生产出的有关试剂盒利用分子量比较大的有机溶剂氯仿使有机相和无机相迅速分离，初步获取RNA，并进一步分离纯化。提取RNA后将其反转录并扩增，即可获得用于重组质粒的目的基因。重组质粒过程中利用了聚合酶链式反应（PCR）、琼脂糖凝胶电泳等方法。聚合酶链式反应是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术，它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生微克量的PCR产物。琼脂糖凝胶电泳以琼脂凝胶作为支持物，利用核酸分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。重组质粒构建后，使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒，本实验采取的离心法抽提质粒，即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。最后将得到的质粒送至有关生物公司测序，测序结果分析表明，目的基因片段存在于送检样品中，说明实验成功构建并获取了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒。材料与仪器、用品

鸭肝脏组织，液氮，75%酒精，无水乙醇，氯仿，蒸馏水，普通双蒸水，琼脂糖，50倍浓度商品化TAE，2000bpDNA标准参照物（Marker），填充剂（Loading）,氨苄霉素，LB培养液，E.coli DH5a 菌株。

美国Omega RNA提取试剂盒，包含HiBin微型制备管，2毫升收集管，RNA-Solv试剂，RNA Wash 缓冲液 I，RNA Wash 缓冲液 II，DEPC水等。

AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂盒中的试剂包括小量制备 制备管, 2毫升 微量离心管,1.5毫升 微量离心管, RNA酶 A, 缓冲液 S1, 缓冲液 S2,缓冲液 S3,缓冲液 W1, 缓冲液 W2 浓缩液，Eluent洗脱液。

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂盒中试剂包括缓冲液 W1，缓冲液 W2浓缩液，缓冲液 DE-A，缓冲液 DE-B，Eluent洗脱液。

RNA引物混合液，包含模版RNA，随机引物，无RNA酶双蒸水等。

反转录反应液，包含模版RNA引物变性溶液，随机引物，5倍浓度M-MLV 缓冲液，dNTP混合物，RNA酶抑制剂，RNA酶M-MLV，无RNA酶双蒸水。

一次性口罩，一次性手套，实验工作服，超净工作台，恒温培养箱，制冰机，研钵，移液器，枪头，无DNA酶和RNA酶的收集管，1.5毫升收集管，2毫升收集管,制备管，离心机，恒温水浴锅，振荡器，冰盒，酒精灯，蒸馏设备和用品（50毫升烧杯，蒸馏头，100℃温度计，冷凝管，接引管，三角瓶，铁夹，铁环，酒精灯，沸石，50m量筒，铁架台），PE管，PCR仪，锥形瓶，微波炉，水平电泳槽，电泳仪，电泳仪电源，记号笔，卫生纸，玻璃涂棒。原理与方法

2.1 获取目的基因 2.1.1提取RNA RNA提取的原理就是将细胞破碎裂解，利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和DNA的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终得到纯净的RNA的过程。影响RNA提取质量的因素有很多，尤其是RNA酶的污染。RNA酶无处不在，包括破碎细胞内的RNA酶,实验室空气、实验台上的酶，实验所用试剂中的酶,实验人员身上携带的酶以及实验器材的污染等等，而且RNA酶性质稳定，实验室很难做到完全隔离这个酶的作用[4]。RNA提取试剂盒的通病就是A260/A230普遍偏低，主要是因为RNA样品中易残留RNA酶的变性剂异硫氰酸胍和β-巯基乙醇，细胞裂解不彻底，导致核糖核酸不能完全释放出来。另外，有些细菌的细胞壁坚韧，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎，降低了核糖核酸的量[5]。

本实验使用美国Omega RNA提取试剂盒。实验前，酒精充分消毒实验台、实验室空气，戴棉手套取适量液氮置于保温瓶中，将用酒精冲洗过的研钵泡入液氮中，同时将鸭的肝组织泡入液氮中，待两者充分冷冻，在研钵中研碎鸭肝组织。

操作步骤包括取适量组织粉末置于无DNA酶和RNA酶的收集管中，离心，5000转/分钟，5分钟，4℃。加1毫升RNA-Solv试剂，振荡混匀，室温孵化3分钟。加0.2 毫升氯仿（每1 毫升 RNA-Solv与组织混合液加0.2 毫升氯仿），盖好管盖，用手剧烈振荡15秒，冰上孵育10分钟。随后4°C，12000转/分钟，离心10分钟，离心后混合物分三层，RNA存在于最上层水相。将五分之四的RNA水层置于新的收集管，加三分之一收集管的无水乙醇。轻微混匀并离心后，小心吸出不大于700 微升的上层RNA水层液体于无RNA酶的制备管中，振荡混匀沉淀，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。重复上一步骤，再次离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。将制备管置于新的2毫升收集管，加400微升RNA Wash 缓冲液 I，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液。用同一收集管，加500微升RNA Wash 缓冲液 II，离心，10000转/分钟，1分钟，20℃，弃去滤液，随后用空收集管离心，13000转/分钟，2分钟，20℃，完全干燥。干燥可使用的方法亦有用移液器将离心管内残余的液体吸出，打开管盖，将沉淀于超净台上晾5分钟；或将装有沉淀的管子盖紧盖子后，放进一次性手套中，然后打开管盖，稍微包扎手套后，于50°C烘箱中放置3分钟。最后洗提RNA，将制备管置于新的1.5毫升收集管，加入40微升的DEPC水，确保加入到制备管中央，随后室温静置2分钟，离心，13000转/分钟，1分钟，20℃。得到的RNA保存在超低温冰箱。2.1.2 RNA反转录为cDNA 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶催化,以dNTP为原料，合成DNA的过程，是DNA

生物合成的一种特殊方式。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶，即以RNA为模板催化DNA链的合成，合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′末端上，按磷酸到五碳糖(5'-3')的方向方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程[

6、7]。

操作步骤包括收集管中配制模版RNA引物混合液，为6微升体系，包含模版RNA2微升，随机引物1微升，无RNA酶双蒸水3微升。70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。离心数秒种使模版RNA引物的变性溶液聚集于收集管底部。在收集管中配制反转录反应液，为10微升体系，包含上述模版RNA引物变性溶液6微升，随机引物1微升，5倍浓度M-MLV 缓冲液2微升,dNTP混合物0.5微升，RNA酶抑制剂0.25微升，RNA酶M-MLV0.5微升，无RNA酶双蒸水0.75微升。因为本实验使用随机引物，所以先于30℃恒温水浴锅保温10分钟，然后42℃保温60分钟。70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA做好标记并保存于超低温冰箱。2.1.3 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，它的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加[8]。聚合酶链式反应是利用DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制以得到多量脱氧核糖核酸[

9、10]。

本实验第一次聚合酶链式反应是用两对引物分别扩增cDNA为DNA,目的是判断哪一对引物扩增效果好，选择其进行DNA扩增。准备步骤包括制作双蒸水，首先取蒸馏水200 微升，于超净台点燃酒精灯，安装设备对蒸馏水再次蒸馏，PE管分装后放置于-20℃保存，注意操作完成后用酒精棉擦拭双手，禁用双手触碰PE管口。RNA引物获取，是将目的基因送至博士生物公司，由其进行引物的设计与合成；合成的引物经过真空冷冻干燥，呈薄膜状附在离心管中，盛有引物的离心管经过离心后开启，随后加入规定量的双蒸水合上管盖充分振荡使其溶解，备用。

操作步骤包括准备四个PE管，并分别标记为1-

1、1-

2、2-

1、2-2，将两对引物分别加入两个模版中，配制25微升体系，每管加入r-Tag酶12.5微升，上下游引物各0.25微升，dNTP1微升,模版3微升，双蒸水11微升。将所有PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留混合液，随后摆到双面板上；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，打开电源开关，设置运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，4℃、保存时长，循环30次。

2.2 回收目的基因

2.2.1 核酸电泳

核酸电泳，其中利用了琼脂糖凝胶，琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度[11]。将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA[12]，一般来说，需要分离的目的基因片段越大，琼脂糖浓度越小，凝胶密度越小，反之亦然。样品加入量加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散。每孔点样的体积一般少于25微升，吸取每一个样品时，操作需谨慎，没有颜色的样品需要加入填充剂。另外，电泳系统须加入适宜DNA标准参照物进行判定，过大或过小的标准参照物姐不利于判定结果。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳准备步骤包括核酸用琼脂糖凝胶制作，配制1%的琼脂糖凝胶，首先称取1.000g琼脂糖加入锥形瓶中，倒入100毫升电泳缓冲液TAE(50倍浓度TAE20毫升加1升水，混匀)，摇晃混匀后用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热两三分钟，在水龙头上冲凉冷却至60℃左右后加入10微升EB替代染料，在此过程中注意自身防护。同时用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子，将配好的琼脂糖凝胶液体倒入电泳槽，凝固约20分钟。溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块，倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

将完全凝固的琼脂糖凝胶放置在加有缓冲液的电泳槽，缓冲液一定要没过凝胶，由负极到正极电泳；琼脂糖加样时用移液抢将样品加至点样孔，动作稳重注意不要戳破凝胶导致滤液，点样是每孔加50微升样品混合液，标准参照物加10微升；接通电泳仪电源，调节电流为120A，电压为120V，开始电泳；约20分钟后样品跑到五分之四凝胶宽度，取出电泳胶，观察结果，以确定扩增目的基因引物为第一对或第二对(图1)。

图1 引物选择PCR结果

Figure 1 The result of PCR for primer choice 2.2.2 胶回收

cDNA扩增引物选择结果显示引物2的扩增效果较引物1好，因此选择引物2进行目的基因扩增。加入第二对引物进行第二次的聚合酶链式反应扩增DNA并回收产物，扩增使用高保真的连接酶。配制50微升体系，每管加入缓冲液15微升，高保真酶La Tag0.3微升，上下游引物各1.2微升，dNTP5微升,模版3微升，双蒸水24.3微升，随后将PE管振荡，并瞬时离心一次，使管壁没有残留；使用PCR扩增仪进行RNA扩增，运行条件为94℃、5分钟，94℃、30秒，51℃、30秒，72℃、5分钟,72℃、10分钟，10℃、保存时长，循环40次。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，配胶过程同上，点样时，每孔加50微升样品混合液和5微升Loading，然后接通电泳仪电源，调节电流为120Ma，电压为120V，开始电泳。约20分钟跑胶完成，观察结果（图2）。为对琼脂糖凝胶电泳的某一核酸条带做进一步分析，可对DNA进行胶回收

[

13、14]。

图2 cDNA扩增结果

Figure 2 cDNA amplification results 本实验使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒对目的片段切胶回收。准备步骤包括缓冲液 W2浓缩液中加入一定体积的无水乙醇，原因是此为第一次使用凝胶回收试剂盒。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。准备75℃水浴。试用前，检查缓冲液 DE-B是否出现沉淀，如出现应于70℃水浴加热并溶解。

操作步骤包括戴上防护帽在紫外灯下切下含有目的基因的DNA的琼脂凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎，计算凝胶重量，用加入凝胶后称量重量减去提前记录的1.5毫升离心管重量，该重量作为一个凝胶体积。加入3个凝胶体积的缓冲液 DE-A，混合均匀后于75℃加热，每而两三分钟间断混合，直至凝胶完全融化。加0.5个缓冲液 DE-A体积的缓冲液 DE-B，混合均匀。吸取上一步中的混合液，转移到DNA制备管，制备管置于2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加500毫升 缓冲液 W1，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，加700毫升 缓冲液 W2，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。以同样的方法加700毫升缓冲液 W2洗涤一次，离心，12000转/分钟，0.5分钟，弃去滤液。制备管置回2毫升离心管，离心，12000转/分钟，1分钟，弃去滤液。将制备管置于洁净的1.5毫升离心管中，在制备膜中央加30微升 Eluent或去离子水，室温静置1分钟，离心，12000转/分钟，1分钟，洗脱DNA。得到的DNA保存至超低温冰箱。2.3 DNA分子体外连接

本实验采用卡那霉素抗性T载体连接，此步骤即重组DNA分子，为目的基因导入细菌细胞并复制的必要条件。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后，酶-ATP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h过夜，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

T载体连接操作时，首先于小PCR管中配制50微升体系，包括Solution I 5微升，回收产物4.5微升，T载体0.5微升。随后混匀并于16℃连接过夜，连接时间至少8小时。2.4 转化

外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过抗生素筛选法筛选出重组子，并可通过限制性核酸内切酶酶切，电泳，根据DNA Maker标准判断阳性重组子中是否含有目的基因。感受态细胞制作原理为细菌在0°C氯化钙低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态[15]。转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，即原核细胞或者真核细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法[16]。基因克隆中的转化过程原理为质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，可以在含抗菌素的培养基中生长，从而鉴别选择出转化子。

准备步骤包括配制LB培养基、LB固体培养基、含抗生素LB培养基。首先，每升LB培养基，需在超纯水中加入蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，溶解混匀；LB固体培养基是在每升LB培养基中加入15克琼脂糖，混匀加热溶解；制作含氨苄霉素培养基，称量固体LB微波炉加热3分钟，冲冷水至不烫手，按1：1000比例加入氨苄霉素，倒薄薄的一层于培养皿中，待其凝固，盖上培养皿盖子，倒置并标记。

操作步骤包括准备冰盒，打开42℃水恒温浴锅，将无抗LB提前放入37℃预热；从超低温冰箱取出E.coli DH5a 感受态菌株，将商品化DH5a 感受态细胞快速且温柔取于冰中，待其于冰中融化；在超净工作台作业，吸取10微升载体连接产物，缓慢加入感受

态中，反复抽吸三次混匀，动作需轻微，防止产生气泡，放入冰盒30分钟；将样品放入42℃中热激90秒，此为转化必须环节；冰浴2分钟，使其停止转化过程；将预热的无抗LB8微升加入样品中，放入摇床45分钟至60分钟，复苏感受态细胞；将涂菌棒用酒精灯灭菌，从冰箱取出培养基放入37℃温箱预热；将摇好后的样品4000g离心5分钟，弃去上清600微升，余200微升，目的是使得细菌浓度升高，将剩余200微升样品混匀，加到培养板上，用灭菌放凉的涂菌棒涂匀；涂菌后的培养基保存于37℃恒温箱过夜。

培养大肠杆菌，在培养基上37℃恒温培养大肠杆菌过夜，长出的菌落呈乳白色大圆点状菌，表面和背面颜色一致，菌落边缘整齐均匀，表面光滑湿润,分散分布于整个培养皿（图3）。随后挑菌、摇菌、获得菌液，用于筛选、抽提鉴定质粒。挑菌时在细菌间超净工作台作业，取10只试管标号，依次摆到试管架上，灼烧试管盖和镊子，用镊子拔下试管盖后，在此灼烧试管口和试管盖，倒入约三分之一的氨苄抗性LB，用镊子夹枪头挑去细菌，连同枪头扔进试管，灼烧管口和试管口，在火焰中盖上试管盖。摇菌是在37℃摇床，过夜后就得到了菌液。余下的菌落用封口膜封上放入4℃冰箱中保存。

图3 转化后大肠杆菌培养结果

Figure 3 The result of the e.coli bacteria after transformation 2.5 抽提鉴定质粒

质粒是在细菌细胞中染色体之外能够自主复制的共价闭合环状双螺旋的分子或遗传因子。质粒抽提原理即去除 RNA，且将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒[

17、18]。

本实验采用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。

准备步骤包括RNA酶 A全部加入缓冲液 S1中并4℃贮存。准备无核酸或核酸酶污染的Tip头、离心管。缓冲液 W2浓缩液中加入指定体积的无水乙醇，原因是第一次使用试剂盒。试用前，检查缓冲液 S2是否出现沉淀，如有沉淀应于37℃水浴加热并溶解。

操作步骤包括取2毫升在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转/分钟,离心1分钟，弃尽上清。加250微升缓冲液 S1悬浮细菌沉淀，悬浮需要均匀，不能够有小的菌块，确认缓冲液W2中已加入无水乙醇。加250毫升，温和并充分地上下翻转6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤需要控制在5分钟之内。使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的和中的中和，降低溶菌效率。避免剧烈摇晃，否则可能导致基因组DNA的污染，此步骤需要控制在5分钟之内。采用离心法纯化质粒，吸取上一步骤中的离心上清并转移到制备管，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回离心管，加500微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；加700微升 缓冲液 W1，12000转/分钟,离心1分钟，弃去滤液；将制备管置回2毫升离心管中，12000转/分钟,离心1分钟。将制备管移入新的1.5毫升离心管中，在制备管中央加80 微升的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，12000转/分钟,离心1分钟，将Eluent或去离子水加热至65℃能提高洗脱效率。随后，质粒测序鉴定目的基因是否插入。菌液PCR后使用随机引物进行通测，引物合成及测序由北京华大生物公司完成（图4、5）。

图4 质粒基因组碱基序列

Figure 4 Plasmid genome base sequence

图5 质粒基因组测序峰

Figure 5 Plasmid genome sequencing 3 讨论

本文构建的目的基因LC3有关自噬活动，近年来，自噬在癌症免疫因素感染炎症和神经退行性变等领域的研究不断增加，准确地检测自噬基因对于研究自噬的生物学功能至关重要，根据LC3的特点构建重组质粒，从而获取大量LC3基因可作为自噬研究的组成环节。

本实验采用反转录的方法获取cDNA后，依据PCR产物的琼脂糖凝胶电泳效果显示第二对引物扩增的条带比较清晰,由此选择第二对引物进行扩增，得到相应目的基因。采用T载体连接方法，将目的基因引入感受态大肠杆菌，进行基因克隆。转化子扩增后，将转化成功的质粒提取出，进行电泳、测序等进一步鉴定。转化后质粒的琼脂糖凝胶电泳结果显示出现约600bp的明亮条带,为目的基因条带，说明目的基因成功导入细菌质粒并复制，进一步的基因测序鉴定结果表明实验完成了鸭RFP-GFP-LC3重组质粒的构建。最后使用试剂盒提取并纯化质粒，得到多量目的基因LC3。

整个过程的每个环节中皆包含影响实验结果的因素，各个因素稍有变化既可能对实验结果造成量或质的影响，现将需要注意的几个重要因素及其影响讨论如下： 3.1试剂

试剂使用前应当仔细阅读说明书。如用于提取RNA的Omega RNA提取试剂盒，其中的缓冲液 W2 浓缩液在提取开始或贮存在室温条件前，必须用无水乙醇稀释，如果使用了未经处理浓缩液，则无法充分洗涤RNA，使得最后产物中存在大量杂质。3.2 核酸酶

注意保证实验环境中RNA酶量最小化，操作过程应迅速且谨慎，始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具；避免在操作中说话聊天，戴口罩以防止引起RNA酶污染；配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新瓶，使用专门配制的无RNA酶制备管、收集管。酶如果没有被充分隔绝，将减少甚至提取不出RNA。3.3 核酸电泳缓冲液

琼脂糖核酸电泳的缓冲系统在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的选择和浓度，而且不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响，凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，否则将导致实验结果参照不准。3.4 胶回收效率

将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间，从而提高回收率；勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外灯对DNA造成的损伤；融化凝胶时应当完全，避免残留降低回收率，以及阻塞制备管滤膜影响后续步骤也会降低回收效率。3.5 DNA酶切位点

基因克隆时选择载体DNA酶切位点时应注意两个酶切位点的距离不应过小，否则影响限制性内切酶识别切点；目的基因片段内部不应含有所选的酶切位点；实验后继应用的所有载体都尽可能含有所选的酶切位点，并且要保证在载体上的插入方向正确（定向克隆）[20]；选择较常用的酶切位点，两个酶切点至少隔上3个碱基；使用酶切效率高，且双酶切有共同缓冲液的酶。3.6 转化效率

为了提高转化效率, 实验中要考虑细胞生长状态和密度，不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液；细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制，DH5α菌株的OD600 为0.5 时,这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。

质粒的质量和浓度方面应注意用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA，转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低，1纳克的超螺旋态DNA 即可使50微升的感受态细胞达到饱和，一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的二十分之一[

18、19]。

试剂的质量方面应注意所用的试剂,如氯化钙等均需是最高纯度的，并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处；防止杂菌和杂DNA 的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,Tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染[20], 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。3.7 试剂盒

本实验使用了若干试剂盒，例如AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒、美国Omega RNA提取试剂盒，使操作能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程，试剂盒中配备有相应使用说明书，按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果，使用试剂盒时要根据自己的实验需要选取专用提取试剂盒，如果不是专用试剂盒，提出的RNA不能确保其质量以及完整性，会影响RT-PCR、基因克隆、抽提质粒等后续实验的结果。

参考文献

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附录1：离心力和离心转速换算计算公式

RCF= 1.118 ×10-5×N2 ×R RCF表示相对离心力，单位为g N表示转速，单位为rpm（转/分）R表示离心半径，单位为cm。

本实验使用的离心机离心力和离心转速换算如下： 12000rpm=13205rcf 13000rpm=15497rcf

附录2：试剂稳定性

AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：

RNA酶 A，室温可以贮藏6个月，长期贮存于-20℃；缓冲液 S1为细菌悬浮液，加入RNA酶 A后，混合均匀，4℃贮存；缓冲液 S2为细菌裂解液，室温密闭贮存；缓冲液 S3为中和液，室温密闭贮存；缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2为浓缩液或去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存。的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，试剂稳定性及贮存条件如下：

缓冲液 W1为洗涤液，室温密闭贮存；缓冲液 W2 为浓缩液，又称去盐液，使用前，按照试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存；Eluent为洗脱液，室温密闭贮存；缓冲液 DE-A为凝胶融化剂，含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解，室温密闭贮存；缓冲液 DE-B为结合液，室温密闭贮存。