第一篇：分子生物实验报告及讨论
蛋白质SDS-PAGE分离和Western Blot
一、实验目的
1． 掌握SDS-PAGE分析的原理和技术，应用于蛋白质的分析和鉴定。
2． 实验采用HL60细胞总蛋白作为材料，进行SDS-PAGE后，用半干式转移法将蛋白质转移到PVDF膜上，应用Western Blot分析技术，分析PVDF膜上的c-Myc蛋白。通过本实验，掌握半干式转移的操作和Western Blot的基本原理和操作技术。
二、实验原理
1.蛋白质SDS-PAGE原理
聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。化学聚合的催化剂通常多采用硫酸铵或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED），在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成的氧自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性且透明，相对的化学稳定，对PH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广范的范围，并且之制备凝胶的重复性好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离蛋白质的方法有很多种。本实验采用SDS-PAGE法。SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，是各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分力量的函数。不同的凝胶浓度合适用于不同的分子量范围，可根据所测分子量范围选择最适合的凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样本相近的蛋白质作为标准蛋白质。
并非所有的蛋白质都能用SDS-PAGE测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白。2.Western Blot原理
Western Blotting是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印记。经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移至固相载体（如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting一般分五个步骤：
（1）固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE并从凝胶上转移到PVDF膜上。
（2）封闭：封闭膜上没有特殊抗体结合的场所，使其处于饱和状态，以减少非特异性结合。（3）第一抗体与抗原的特异性结合。
（4）第二抗体或配体试剂与第一抗体的特异性结合并作为指示物。
（5）被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。本实验采用HL60细胞总蛋白作SDS-PAGE，经半干式转移将电泳所分离出的蛋白条带转移到PVDF膜上，用兔抗人c-Myc多克隆抗体作为第一抗体与c-Myc蛋白发生反应，然后用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG作为第二抗体与第一抗体结合，经过显色底物的显色检测c-Myc蛋白。
三、实验器材和试剂 详见实习指导。
四、实验步骤
1.安装并组装夹板，依次灌制分离胶和浓缩胶。2.上样电泳。
3.裁剪胶体2cm*7cm两份，一份用考马斯蓝染色，最后脱色观察结果。4.上述另一份样本经半干式转移至PVDF膜上，转膜后封闭 5.依次与第一抗体和第二抗体结合，显色。
五、实验结果
1.蛋白质SDS-PAGE结果 相比于marker带，样本带为HL60细胞中总蛋白所电泳出的条带，由于总蛋白中各蛋白质分子量各异，故所形成的SDS-蛋白质复合物的椭圆棒长度各异，进而电泳后出现多个距离相近的条带，下一步Western Blot所检测的c-Myc蛋白亦在其中。
而marker和样本总蛋白条带均比较宽而模糊，原因为染色后存放时间太久，凝胶存在一定的孔径，SDS-蛋白质复合物于凝胶中向周围扩散，染料亦扩散，最终使条带不集中和清晰。2.Western Blot结果
样本带中红色的条带为显色的c-Myc蛋白条带。其处于marker第二和第三条带之间，分子量符合预测结果（一般于SDS-PAGE上表观分子量为62KD）。而显色结果不理想，其原因在后文中有详细讨论。
六、注意事项
1.聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性。称量聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺时应带手套和面具。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因可能会含有少量未聚合材料。
2.SDS的微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩。称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS。SDS溶液无需灭菌。
3.用封口机密封塑料袋时要尽量排除藏匿的气泡。
4.拿取凝胶、Blotting Paper和PVDF膜时必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶向滤膜转移。
5.封闭液的作用是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。
6.PBST是一种磷酸钾、钠盐溶液，既可稳定蛋白质固定于PVDF膜上，同时又可以洗去多余的封闭液及其杂质。Tween-20是一种非离子型的蛋白去污剂，它可以出去免疫探针的非特异性结合，使免疫反应背景更加清晰。
7.转移过程中电压不应大于50V，若电泳初始电压大于20V，则应检查离子强度对不对，若转移过程中电压增加幅度大于10V或温度增加，则表示buffer感和，此时应停止电泳，多加几层湿的blotting paper。8.PVDF膜最好一次放到位。
9.Westing Blot可检测出1-5ng中等大小的蛋白质。
七、实验讨论
1.配胶缓冲液系统对电泳产生的影响？
在SDS－PAGE中，加入缓冲液后，浓缩胶中pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离很少，在电场的作用下泳动效率低。而氯离子浓度却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，使蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加而呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，紧随氯离子之后。同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
综上可见，环境pH对整个反应体系的影响至关重要，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2.配制凝胶的注意点？
使聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。勿即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。可待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
3.凝胶时间不对，或慢或快的原因？
通常胶在30min—1h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED或APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。4.电泳条带出现“微笑”、“皱眉”或拖尾现象的原因及处理方法？ “微笑”状条带即为两边翘起中间凹下的形状。主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中，可待其充分凝固再作后续实验。
“皱眉”条带即为两边向下中间鼓起的形状。主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净，可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
拖尾现象主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理方法如下：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
5.什么是“鬼带”，如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。6.电泳的条带很粗的原因？
电泳中条带很粗较常见，主要是未浓缩好。其处理办法为适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压等。
7.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。一般对电泳不会有太大的影响。8.电泳时间比正常要长的原因？
可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。9.背景过高的原因及解决办法？
背景过高可能原因如下：1）抗体浓度过高； 2）封闭液选择不当； 3）封闭不完全； 4）抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应；5）清洗不充分； 6）曝光时间过长； 7）膜出问题；8）缓冲液污染或长菌9）仪器污染。其相应的解决办法为：1）降低抗体（一抗/二抗）浓度；2）比较不同封闭液供进一步选择；3）根据不同的体系优化封闭液，提高封闭物浓度，优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜，在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20，用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体；4）更换封闭液，封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测；5）增加清洗次数及清洗液体积，如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05%；6）缩短曝光时间；7）确保转膜前，根据指导将膜彻底浸润；更换新膜，确保膜始终有足够的液体覆盖避免干掉，避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子，每一步孵育都应确保充分；8）重新配制缓冲液；9）确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染，确保转膜后膜上没有残留的胶。
10.转膜不充分的原因和解决办法？ 转膜不充分的可能原因如下：
1）膜没有完全均匀湿透；2）靶蛋白分子量小于10,000；3）靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH 值；4）甲醇浓度过高；5）转移时间不够。其分别的解决办法为：
1）使用100%甲醇浸透膜；2）选择小孔径的膜，缩短转移时间；3）可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液；4）过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替；5）对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。
11．没有阳性条带或阳性条带比较弱的原因及解决办法？ 无阳性条带的原因：
1）抗体染色不充分；2）酶活性降低或失活；3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低；4）试剂不匹配；5）抗体活性降低或失效；6）封闭过度；7）曝光时间过短。其分别的解决办法为：
1）增加抗体浓度，延长孵育时间；2）直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物；3）设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。；4）一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性；5）选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液；6）减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型；7）延长曝光时间。12.原因：
1）二抗的非特异性结合；2）一抗的特异性不够；3）蛋白降解；4）二聚体或多聚体存在；5）抗体浓度过高；6）蛋白上样量过大。其解决办法为：
1）增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）；2）使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性；3）使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂；4）增加蛋白质变性过程及强度；5）降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带；6）降低上样量。
第二篇：分子生物课件
•经典的基因概念：三位一体基因：突变的最小单位 重组的最小单位 功能的最小单位
•现代的基因概念： 1基因具有精细结构： 重组子（recon）突变子（muton）顺反子（cistron）
2基因序列的多样性：跳跃基因 断裂基因 重复序列 假基因
•突变子：突变单位，基因内部有许多突变位点，也称突变子（muton）即突变后产生变异的最小单位。•重组子：重组单位，基因内部有多个重组单位，也称重组子（recon）不能由重组分开的最小单位。
•顺反子（cistron，又叫作用子）：功能单位，从功能单位的意义上讲，一个顺反子相当于一个基因的DNA或RNA单元，它的产物是一个完整的肽链或者RNA分子，平均大小约为500-1500bp。
•断裂基因(split gene)：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。1977年美国的Sharp和Roberts两组科学家分别同时发现。
内含子(intron)：•在成熟mRNA的片段中未反应出的DNA区段(ABCDEFG)非编码序列 外显子(extron/exon):•DNA序列中被转录成为mRNA中的片段(1234567)•编码序列 •重叠基因(overlapping gene)：两个或两个以上的基因共有一段DNA序列的现象
•重复序列：是指在一个DNA分子中出现不止一次的序列，重复序列可彼此相同方向（正向重复）也可以相反方向（反向重复）•根据重复程度，可以将DNA序列分为三种类型：
–单一或轻度重复序列：基因组中只有一个拷贝或重复频率很低的序列； –中等重复序列：重复次数几十次到几百次的序列； –高度重复序列：重复次数几百次到几百万次的序列
•跳跃基因：是一类反转座子(retrotransposon)，即通过RNA中间产物在天然状态下由基因组中一个位点进行复制，插入到基因组其它位点从而整合到基因组中的DNA序列。•跳跃基因可引起基因组发生大范围基因重排。
•假基因（pseudogene）：在多基因家族，核苷酸组成序列上与有功能的基因非常相似，但不具正常功能的基因 根据基因的转录和翻译功能可以把基因分为三类
•第一类是编码蛋白质的基因，它具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因以及编码阻遏蛋白的调节基因 •第二类是只有转录功能而没有翻译功能的基因，包括tRNA基因和rRNA基因
•第三类是不转录的基因，它对基因表达起调节控制作用，包括启动基因和操纵基因 •基因组–细胞内遗传信息的携带者DNA的总体
•细胞核（chromosome DNA）•细胞质（mitochondrion DNA）•基因组中不同的区域具有不同的功能 –有些区域编码蛋白质的结构基因 –有些区域复制及转录的调控信号 –有些区域的功能尚不清楚 病毒的结构和功能
•病毒不能独立地复制，必需进入宿主细胞中，借助细胞内的一些酶类和细胞器才能使病毒得以复制 •外壳蛋白（或被膜）的功能是1–识别和侵袭特定的宿主细胞 2保护病毒基因组不受核酸酶的破坏
病毒基因组的结构特点
1.病毒基因组大小相差较大，与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小 2.病毒基因组只有一种核酸组成：DNA或RNA 3.多数RNA病毒的基因组是由连续的
4.基因重叠，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子
5.基因组的大部分可编码蛋白质，只有非常小的一部份不编码蛋白质（通常是基因表达的控制序列）6.形成多顺反子结构（polycistronie 7.除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次 8.噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的，而真核细胞病毒的基因是不连续的
乳头瘤病毒（papillomavirus）是感染人和动物皮肤粘膜并引起乳头状瘤病变的一种DNA病毒 •属于乳多空泡病毒（papovavirus）科 •根据病毒感染的宿主不同可以分为
–牛乳头瘤病毒（BPV）–人乳头瘤病毒（HPV）乙肝病毒基因组的结构和功能
（一）•乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是目前已知的感染人类的最小的双链DNA病毒 •HBV的基因组结构显得特别精密浓缩，基因组DNA结构奇特
•环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。其中的2/3为双螺旋结构，1/3为单链，DNA中的两条链不等长 •长链为负链，5’端与3’端无共价连接，而是与一种蛋白质共价相连
•短链为正链，长度视病毒而异，一般长约1.6-2.8kb,约为长链的2/3，短链之间的空隙可由病毒颗粒中的DNA聚合酶充填 1.重叠的基因序列比较多 –已确定的开放读码框架（open read frame，ORF）有4个，分别编码： •病毒的核壳（C）•包膜（S）蛋白
•病毒复制酶（聚合酶)•与病毒基因表达有关的蛋白质（X）2.调节序列位于基因内部
–启动子存在于编码蛋白质序列内
–增强子（enhancer）位于聚合酶基因中 –polyA附加信号位于CORF中
–皮质激素敏感因子（GRE）位于SORF和聚合酶基因中 HBV DNA复制过程
1.以“-”链DNA 为模板合成全长的“+”链RNA（称为前基因组RNA）（亲代“-”链DNA →“+”链RNA）
2.该“+”链RNA被包装在未成熟的核心样颗粒中，同时还有DNA 聚合酶和一种蛋白质也被包装在颗粒中（“+”链RNA等包装成病毒核心颗粒）
3.在该颗粒中，再以“+”链RNA 为模板由反转录酶催化合成“-”链DNA（“+”链RNA→子代“-”链DNA）
4.“+”链DNA的合成便以该“-”链DNA为模板和一段RNA为引物而聚合延伸，核心样病毒颗粒成为成熟的病毒颗粒。这时，“+”链DNA还没有合成完毕，因而造成病毒基因组两条DNA链长度不一样（子代“-”链DNA →子代“+”链DNA）细菌染色体基因组结构 1.形成类核（nucleoid）由一条环状双链DNA 分子组成细菌的染色体，并相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的DNA超螺旋 2.染色体DNA通常与细胞膜相连连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异在DNA链上，与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合 3操纵子结构
结构基因为多顺反子，若干个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节 数个操纵子还可以由一个共同的调节基因（regulatorygene）即调节子（regulon）所调控
4.结构基因都是单拷贝，rRNA基因为多拷贝基因组DNA中不编码的部份所占比例比真核细胞基因组少得多 原核生物终止子有强、弱之分强终止子：含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，无需终止蛋白参与即可使转录终止弱终止子：也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止
DNA分子组成operon）结构rRNA基因是多拷贝isogene).DNA序列，包括插入序列和转座子DNA分子中具有多种功能的识别区域
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能—1
•大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右
•900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中 •已知的基因中，8 ％的序列具有调控作用
大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码酶类的基因 合成代谢酶类基因：氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸维生素
分解代谢酶类基因：碳、氮化 合物
具有相关功能的基因在一个操纵子内，由一个启动子转录 •大多数基因的相对位置是随机分布的
•双向转录：DNA两条链作为模板指导mRNA合成的机率差不多相等
•在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录，23个操纵子按反时针方向转录 •在大肠杆菌染色体基因组中，基因都是单拷贝基因
•在某种特殊环境下，需要有多拷贝基因来编码大量的基因产物 基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系
ProkaryoteGenome
1、常仅由一条环状双链
2、只有一个复制起始点
3、具有操纵子结构
4、编码顺序一般不会重叠
5、基因是连续的，无内含子，转录后不需剪接
6、编码区在基因组中所占比例大于真核基因组，小于病毒基因组
7、基因组中重复序列少，一般为单拷贝，8、具有编码同工酶的基因
9、基因组中存在可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子
10、在DNA分子中具有多种功能的识别区域 真核生物基因组特点
1.基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组
2.基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链 3.存在重复序列，重复次数可达百万次以上 4.基因组中不编码的区域多于编码的区域
5.大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，split gene）
6.基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小 高度重复序列high repeated sequence•
在基因组中所占比例随种属而异，约占10-60％，在人基因组中约占20 ％。高度重复顺序又按其结构特点分为三种 种类–1反向重复序列–2卫星DNA–3较复杂的重复单位组成的重复顺序 高度重复顺序的功能
1.调节反向序列常存在于DNA复制起点区的附近。另外，许多反向重复序列是一些蛋白质（包括酶）与DNA的结合位点 2.参与基因表达的调控DNA的重复顺序可以转录到核内不均一RNA（hnRNA）分子中，并形成发夹结构，这对稳定RNA分子，免遭分解有重要作用
3.参与转位作用：几乎所有转位因子的末端都包括反向重复顺序，长度由几个bp到1400bp。由于这种顺序可以形成回文结构，因此在转位作用中既能连接非同源的基因，又可以被参与转位的特异酶所识别
4.与进化有关：不同种属的高度重复顺序的核苷酸序列不同，具有种属特异性，但相近种属又有相似性。如：人与非洲绿猴的α卫星DNA长度仅差1个碱基（前者为171 bp，后者为172bp），而且碱基序列有65％是相同的，这表明它们来自共同的祖先
5.同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，即DNA指纹
6.α卫星DNA 成簇的分布在染色体着丝粒附近，可能与减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序 中度重复序列middle repeated sequence •重复数十至数万（<105）次•复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序•约占基因组10-40％，种属之间差异很大（人12％）•大多不编码蛋白质，其功能可能类似于高度重复顺序•存在于结构基因之间、基因簇、内含子，大多数与单拷贝基因间隔排列•具有种特异性
•Alu家族•KpnⅠ家族•Hinf家族•多聚dＴ－dＧ家族•rRNA基因•tRNA基因•HLA基因•组蛋白基因•免疫球蛋白基因 中度重复顺序
1•短分散片段（short interspersed repeated segments, SINES）–重复顺序的长度：平均长度约为300bp
–基因组中排列方式：与平均长度约为1000 bp的单拷贝顺序间隔排列 –拷贝数：10万左右•Alu家族•Hinf家族，等
2•长分散片段（Long interspersed repeated segments, LINES）–重复顺序的长度：平均长度为3500-5000bp–基因组中排列方式：与平均长度为13000 bp（个别长几万bp）的单拷贝顺序间隔排列–拷贝数：1万左右•KpnⅠ家族，等 中度重复顺序——Alu家族
•含量最为丰富的一种中度重复顺序家族•单倍体人类基因组中，重复达30万-50万次，约占人基因组的3-6％
•Alu家族每个成员的长度约300bp•限制性内切酶Alu（AG↓CT）可将其切为两段（130和170bp），因而定名Alu家族（Alu序列）•Alu序列分散在基因组中（间隔区DNA，内含子），平均每5kbDNA有一个Alu顺序•Alu顺序具有种特异性 •Alu序列5’端比较保守Alu家族在基因组中广泛分布的原因可能是： –Alu顺序先转录成RNA 分子，再经反转录成cDNA，然后重新插入基因组所致 –有人认为：Alu序列两侧存在6-20bp重复顺序，很象转座子。能够移动 Alu家族的功能是多方面的： –可能参与hnRNA的加工与成熟 –与遗传重组及染色体不稳定性有关 –有形成Z-DNA的能力 –可能具有转录调节作用 中度重复顺序——KpnⅠ家族
•中度重复顺序中的第二大家族，拷贝数约为3000—4800个，人体基因组中约占1％
•KpnⅠ顺序较长（如：人KpnⅠ顺序长6.4kb），属于长分散片段，散在分布于单拷贝基因间 •限制性内切酶KpnⅠ可将其切为4个片段（1.2、1.5、1.8、1.9kb），因此得名
•KpnⅠ家族中至少有一部份通过KpnⅠ顺序转录成RNA，再逆转录为cDNA，重新插入到基因组DNA中 •3’端有广泛的同源性
中度重复顺序——Hinf家族
•Hinf家族：以319bp长度的串联重复存在于人体基因组中 •用限制性内切酶HinfⅠ消化人体DNA，可以分离到这一片段
•Hinf家族在单倍体基因组内约有50—100 个拷贝，分散在不同的区域
•319bp单位可以再分成两个亚单位，分别为172bp和147 bp，它们之间有70%的同源性
中度重复顺序——多聚dT-dＧ家族•多聚dＴ-dＧ家族的基本单位是：dＴ-dＧ双核苷酸，多个dＴ-dＧ双核苷酸串联重复在一起，分散于基因组中•在人基因组中，多聚dＴ-dＧ顺序平均长度为40bp，达106拷贝
•功能–可能是基因转变或不等交换的识别信号–多聚dT-dＧ中，嘌呤和嘧啶的交替顺序有助于Z-DNA的形成，在基因调节中起着重要作用
中度重复顺序——rRNA基因
•真核生物有4种rRNA（18S、28S、5S、5.8S）–18S、28S和5.8S rRNA基因在同一转录单位 –5S rRNA
•在低等真核生物（如：酵母）中也和18S、28SrRNA在同一转录单位；
•在高等生物中，5S rRNA位于1号染色体，单独转录，其重复次数高于18S和28S rRNA基因
•rRNA基因通常成簇存在，而不是分散于基因组中，这样的区域称为rDNA区 染色体的核仁组织区（nucleolus organizer region）就是rDNA区
真核基因组的另一特点就是存在多基因家族（multigenefamily）•多基因家族是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因 多基因家族大致可分为两类：
•一类是：基因家族成簇地分布在某一条染色体上，其可同时发挥作用，合成某些蛋白质（如：组蛋白基因家族就成簇地集中在第7 号染色体长臂3 区2 带到3 区6 带区域内）
•另一类是：一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质（如珠蛋白基因家族）
在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因（pseudo gene）
•假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因
在哺乳动物包括人体基因组中，存在着大量的非编码顺序。这些顺序中，只有很小一部份具有重要的调节功能，绝大部部分都没有什么特殊功用。在这些DNA序列中虽然积累了大量缺失，重复或其他突变，但对生物并没有什么影响，它们的功能似乎只是自身复制，所以人们称这类DNA为自私DNA或寄生DNA（parasite DNA）人类基因组（human genome）人类细胞中所有遗传信息的总和由两个基因组组成 –核基因组（复杂）–线粒体基因组（简单）
重要的遗传信息存在于核基因组内
遗传信息表现 ——特异多肽（在胞浆核糖体上合成）线粒体基因组(Mitochondrial genome)双链环状 DNA 基因排列高度紧凑，总长为16569bp，两链DNA的碱基组成差异很大 ––重链（H 链）富含鸟嘌呤––轻链（L 链）富含胞嘧啶 细胞内的数目：数千拷贝 特点：呈母系遗传方式
––精子中仅含极小量线粒体基因组
––受精卵中线粒体基因组几乎都来自卵子
在减数分裂过程中，卵子的线粒体 DNA分子完全随机地分配到两个子代细胞中 ♦线粒体基因组
共含 37个基因–链编码 28个–链编码9个
13个可转录为mRNA，并在线粒体核糖体上翻译为多肽，参与组成氧化磷酸化系统 22个编码tRNA2 个编码rRNA线粒体基因组高度压缩、约93％的顺序参与基因的％ ♦编码不含有内含子，大多彼此相接，甚至部分重叠
♦唯一一个有意义的非编码区是替代环displacement loop））♦与三链DNA结构形成相关
♦含有Ｒ链和 L链转录的主要启动核基因组(Nuclear genome)♦ 分布于24条不同类型的DNA双链上––22条常染色体–2条性染色体（X、Y））♦ 碱基组成和基因密度的区域差异明显 ♦ DNA含量占总量99%以上
♦ 每条染色体长度 50 —250 Mb
♦ 标准 Giemsa染色：有550条深浅相间区带
人类基因的组织特点♦功能相似或相关的基因常常分布在不同的染色体上（偶尔聚集在一起）♦基因的大小和内部组织差异极大––大小：几个Kb ——数百个Kb––组织：含重复序列，常常位于编码序列，与蛋白质的重复结构形成有关♦重叠基因和基因内基因，极为罕见
编码序列仅占全部核基因组的3%♦绝大多数基因位于核基因组，但具体数字目前尚不清楚––根据突变负荷（mutational load）和人基因的平均突变率进行理论计算，提示：上限为100000个––根据已知基因组序列、CpG岛数目以及表达序列标记分析，估计：总数为65000-80000个，是所有基因的99.98％ CpG 岛（CpGisland）
♦基因组中有高密度的CpG二核苷酸对的单拷贝序列
♦人基因组在约40%的组织特异性表达基因的5’上游序列中含有这种序列，因此CpG岛经常被作为搜寻未知基因的一个参考标志
♦CpG岛中的C是最易被甲基化的底物，而其甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关，因此研究CpG甲基化是研究基因调控的一个重要方面 人类基因组
多基因家族和重复顺序DNA
♦ 二倍体细胞的核基因组中的 DNA序列通常以2个等位基因拷贝的方式存在 ♦ 40％的人类核基因组由一组紧密相关的非等位性DNA序列构成
♦ DNA序列家族：由具有序列相似性（或同源性）的DNA构成。实际上是一类重复序列 ♦ 包括：多基因家族（具有功能）非基因的重复 DNAD序列家族
多基因家族（multigenefamily）
特点： 1.各成员总的序列相似性不同，特殊序列的保守程度也不一样
2.可紧密地成簇分布（特异的亚染色体区）也可广泛地散在分布 3.RNARNA基因家族常含数目众多的家族成员 4.常含有假基因和基因片段
5.基因簇中个体基因的表达可能由共同的基因座控制区协调 6.散在分布的基因家族常含有许多加工过的假基因
基因家族
♦ 经典的基因家族 ：各成员之间的序列高度同源，表明其在进化和功能上相关的重要特征
♦ 具有大而高度保守功能区的基因家族 ：各成员编码的一些产物具有高度保守的功能区，这些往往在发育过程中起着很重要的作用
♦ 具有小段保守氨基酸基序的基因家族 ：各成员的 DNADNA序列可能并不明显相关，不过所编码的产物却具有共同的功能特征，存在小段保守顺序（氨基酸基序）
♦ 超基因家族： 其产物总的看来有相关的功能，但缺乏 大片段的DNA同源序列，也无明显的保守氨基酸基序，而是大体上有共同的结构特征。这些基因似乎进化上有亲缘关系，但与那些经典的基因家族或保守功能区／基序家族相比，亲缘关系较远，故将这些称为基因超家族
––HLA基因、TCR基因等产物与免疫系统功能相关，尽管其同源性很低，但相似的功能及总的功能区结构提示：其同属IgIg超家族，但进化上亲缘关系较远TT基因家族
成簇基因家族 ：由一个或多个位于特异亚染色体区的基因簇构成，每一基因簇常由串联基因重复事件形成，而且常可产生无功能的假基因
散在的基因家族 ：各基因成员之间没有明显的结构上的关系，常常散在分布于几个染色体上 ♦ rRNA基因家族：28S、5.8S5、18S rRNA基因成簇排列在一起，每个基因含60个拷贝 人类基因组计划内容
遗传图（连锁图），物理图，序列图，基因图 遗传图
•第一代标记•经典的遗传标记（蛋白质和免疫学的标记）•70年代中后期，限制酶片段长度多态性（RFLP）•第二代标记•85年，“小卫星中心”（minisatellitecore）•89年，“微卫星标记”（microsatellitemarker）•第三代标记•单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism，SNP）SNP 作图的一般步骤包括： ①获取DNA序列；
②从DNA序列确定序列标签位点（sequence tagged sites，STSs）； ③扫描STSs或ESTs确定候选SNPs； ④确定SNPs；
⑤将SNPs定位于染色体特定位置。物理图 ♦内容
–测定人类基因组DNA分子的物理长度
–描述了DNA分子两个位点或染色体两个位标之间的实际距离 ♦单位：核苷酸数♦基本原理： 人类基因组 打碎
拼 接–可以随意研究、又能够知道研究内容所处的染色体位置 ♦图距： Mb、kb、bp作为图距
––平均图距100kb（测定40000个以上的STS））♦路标：DNA探针的STS序列为路标♦ 构建物理图的一个主要内容：
––把含有STS对应序列的DNADNA克隆片段连接成相互重叠的““片段重叠（contigcontig）
♦ 以STS为路标的物理图与已建的遗传图进行对比，可以把遗传学信息和物理信息进行互相转换（如某一区域1cM1cM的遗传间距可以粗略的“折算”成某一区域1cM的物理间距）
包括:人类基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图••大片段限制性内切酶切点图序列图 ♦ 策略：把庞大的基因组分成若干有路标的区域后，进行测序分析
♦ 序列分析需要用一个区域DNA片段重叠群使测序工作不断延伸，这中间的STS被用作任何两个片段（上百个bp）间的重叠区域，使分别被测的短序列进行正确的拼接
♦ 基本策略是建立 DNA小片段的重叠群并尽可能地降低重叠部分所占的比例以提高效率和降低成本基因图 ♦ 内容： 鉴别出占据 22--5%长度的全部基因的位置、结构与功能 ♦ 方法：mRNA到染色体的位置 ♦ 原理：
––生物性状和疾病由蛋白质决定；
––蛋白质均由mRNA编码（RNA聚合酶指导合成，带有多聚A尾巴）； ––mRNA通过反转录酶合成cDNAc；
––用较稳定的cDNA作为探针进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。基因图
♦ 根据 mRNA的特点，可用与多聚AA尾巴（poly AA）互补的寡聚T）或克隆载体的相关序列为引物，对mRNA的双端尾侧的几百个bp进行测序，得到EST（表达序列标签）
意义：在于它能有效的反映在正常或受控条件中表 达的全基因的时空图 通过这张图我们可以了解某一基因在不同时间不同 组织不同水平的表达
♦人类基因组计划的意义：随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因研究的意义在于它可以支持和推动生命科学中一系列重要的基础性研究。如基因组遗传语言的破译，基因的结构与功能关系，生命的起源和进化，细胞发育、生产、分化的分子机理，疾病发生的机理等。人类基因组计划的意义
♦为推动医学长足进步带来前所未有的机遇
♦基因诊断、基因疗法和基因药物的开发，有可能成为未来医学发展的重要分支
♦人类基因组计划的进一步成功还将促进生命科学与信息科学、材料科学的融合，从而带动一批高技术产业的发展后人类基因组计划伴随着人类基因组计划的迅速进展，基因的全序列逐步被完整的测出，会出现大量的不知道任何功能信息的序列。基因组学内容
♦１结构基因组学：是通过基因作图、核苷酸序列分析确定基因组成、基因定位的科学。其目的是确定界标或基因在构成基因组的每条染色体上的位置，以及同条染色体上各个界标或基因之间的相对距离。
♦２功能基因组学：是利用结构基因组学研究所获得的各种来源的信息，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。它包括基因功能发现，基因表达分析及突变检测，力图从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。功能基因组学延伸 内容
–人类基因组多样性计划 –基因组信息学 –功能基因组学 –比较基因组学 –环境基因组学 –病理基因组学 –肿瘤基因组解剖学计划 –药物基因组学 ♦端 粒（telomeretelomere）
是真核生物染色体末端的一种特殊结构由端粒DNA和端粒蛋白质构成 作用：1稳定染色体结构 2防止染色体末端融合
3保护染色体结构基因 4避免遗传信息在复制过程中丢失 组成
端粒DNA序列telomereDNAsequence（TEL）端粒结合蛋白telomere-binding proteins 端粒DNA序列:双链，长度>10kb 由5-8bp富含G的串联重复序列即富G链和其互补链富C链组成 四膜虫：5’—TTGGGG—3’ 人类：5’—TTAGGG —3’15kb 端粒结合蛋白 :保护端粒DNA，免被修饰和核酸酶作用。
人类：称为端粒重复序列结合因子（telomeric repeats binding factor TRF)人的端粒DNA,序列长约5～15kb序列：（TTAGGG）n，串联重复 端粒结合蛋白（TRF）
♦端粒酶是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶。具有逆转录酶活性 能以hTR为模板，向染色体末端添加TTAGGG序列结构 端粒酶RNA：含与TEL互补的模板RNA序列
端粒酶蛋白：应具有逆转录酶活性，对其结构和功能 ♦端粒酶功能
以自身RNA为模板，逆转录合成和补充端粒DNA重复序列 所需物： 模板：端粒酶RNA 逆转录酶：端粒酶蛋白 原料：dNTP 引物：TEL 3’端。体外TEL类似序列也 能作为引物，是端粒酶测定的基础。
细胞内端粒酶活性的缺失，导致：端粒缩短
粒一旦缩短到短于某个“关键长度”，就很有可能导致：染色体双链断裂，并激活细胞自身的检验系统，使细胞进入M1期死亡状态随着端粒的进一步丢失，发生染色体重排，导致：无着丝粒染色体和非整倍体染色体的形成等，使细胞进入M2期死亡状态如果细胞要维持其正常分裂，就必须激活端粒酶，阻止端粒的进一步丢失否则，细胞不能进行染色体的正常复制 只有重新获得端粒酶活性的细胞，才能继续生存下去无法激活端粒酶的细胞（即无法阻止端粒进一步丢失），只能面临趋向衰老
♦抑制端粒酶活性为靶点的肿瘤 治疗研究 主要策略有： ①阻断端粒酶RNA的模板作用 ②抑制端粒酶催化蛋白亚基
③核苷类似物竞争性抑制反转录过程 ④细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性 ⑤对细胞内调节机制进行调控 ⑥其它抑制剂对端粒酶活性的调节
♦抑制端粒酶活性 ————阻断端粒酶RNARNA的模板作用
端粒酶是以其自身RNA为模板来合成端粒DNA序列，因此可以通过消除其模板作用抑制端粒酶活性，达到限制端粒合成的目的 除端粒自身模板作用的方法 义核苷酸封闭hTR 义肽核酸封闭hTR 头状核酶切割hTR序列 反义核苷酸封闭 hTRhTR 端粒酶RNA序列中含有与端粒DNA互补的模板序列，因此可设计能与之结合的反义核苷酸来灭活端粒酶，从而阻止端粒序列的合成
反义肽核酸封闭 hTRhTR ♦肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）是一类人工合成的DNA或RNA类似分子
PNA与核酸分子的不同之处在于：将DNA中的磷酸脱氧核糖骨架被酰胺键连接的多肽骨架所代替，碱基通过亚甲羧基链与骨架中甘氨酸的氨基连接
PNA具有与天然DNA相类似的结构特征和相同的DNA/RNA结合特性 锤头状核酶切割 hTRhTR序列
♦核酶是一类具有酶活性的小分子RNA，通过序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，从而使其失去生物学功能 ♦目前关于端粒及端粒酶的研究主要集 中在以下几个方面 a.端粒酶的结构和功能.b.端粒酶的纯化和激活机制.c.寻找端粒酶的专一性抑制剂及其在抗癌中的应用.d.端粒的高级结构及结合蛋白的作用机理.♦肿瘤发生的端粒--端粒酶学说
端粒每次分裂，端粒缩短缩短至某已特定长度，一发生P53、Rb等基因突变细胞继续分裂，少数端粒酶激活；其中有的染色体不稳定，出现融合M2期细胞，细胞永生化无限增殖给另外基因损伤的积累提供机会肿瘤二M1期细胞，死亡信号转导：胞外信号分子(可溶性分子、细胞表面分子、组织基质分子)靶细胞跨膜分子(如GPCR、EGFR等)靶细胞受体（胞内段）化学变化（如磷酸化、二聚体形成）靶细胞内信号转导分子化学变化与激活（如磷酸化、去磷酸化、聚体形成）激活的信号转导分子进入胞核进入胞核的转导分子作用于基因转录调控区，导致基因表达改变
第一信使：由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称。（激素、细胞因子、气体等）第二信使(secondary messenger)在细胞内传递信息的小分子物质，如：Ca2+、DAG、IP3、Cer、cAMP、cGMP、花生四烯酸及其代谢产物等。
第三信使(third messenger)负责细胞核内外信息传递的物质，又称为DNA结合蛋白，是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调节基因的转录。如立早基因(immediate-early gene)的编码蛋白质。
受体的定义:是靶细胞膜上或细胞内能特别识别生物活性分子(信号分子)并与之结合的成分，它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应的特殊蛋白质，个别是糖脂。能与受体呈特异性结合的生物活性分子则称配体(ligand)。受体的分类、一般结构与功能
存在于细胞质膜上的受体，绝大部分是镶嵌糖蛋白。根据其结构和转换信号的方式又分为三大类：离子通道受体，GG蛋白偶联受体(G protein Coupled Receptor , GPCR)和单跨膜受体(催化性受体)。
（一）膜受体(membrane receptor)
（二）胞内受体(intracellular receptor)位于细胞浆和细胞核中的受体，全部为DNA结合蛋白
1.离子通道受体受神经递质等信息物质调节。当神经递质与他们结合后，可使细胞膜上的离子通道打开或关闭，从而改变膜的通透性。
2.Definition for G-protein-coupled receptors,GPCR G蛋白偶联受体家族 3.单个跨膜α螺旋受体 含TPK结构域的受体
EGF:表皮生长因子 IGF-1:胰岛素样生长因子
PDGF:血小板衍生生长因子 FGF:成纤维细胞生长因子(催化性受体)蛋白质二聚作用
1.相互作用的分子拉近；2.能使底物与酶的活性位点以更适合催化作用的方位相互楔合大大增加了反应速度。这种定向作用对信号转导的突出意义
G蛋白(guanylatebinding protein)GTP-结合蛋白1.三聚体G蛋白,与膜受体偶联,位于细胞膜胞浆面的外周蛋白 2.结构：αβγ三种亚基固定于细胞膜内侧 3.特性：具GTP酶的活性
一、膜受体介导的信息传递 –cAMP-蛋白激酶途径组成：胞外信息分子，受体，G蛋白，腺苷酸环化酶(adenylatecyclase，AC)，cAMP，蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)–Ca2+-依赖性蛋白激酶途径 1.Ca2+－磷脂依赖性蛋白激酶途径
2.Ca2+－钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径(Ca2+－CaM激酶途径)–cGMP-蛋白激酶途径
受体鸟苷酸环化酶转导系统 特点：受体具GC活性无需G蛋白介导组成 –酪氨酸蛋白激酶途径酪氨酸蛋白激酶(tyrosine –protein kinase, TPK)分类受体型TPK（位于细胞质膜上）如胰岛素受体、生长因子受体等 非受体型TPK（位于胞浆）如JAK—STAT途径 –核因子κΒ途径
核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)TNFCer等激酶系统病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA等PKA、PKC等激活NF-κB –TGF-β途径
二、胞内受体介导的信息传递
•胞内受体 核内受体 胞浆内受体 •配体 类固醇激素 甲状腺激素 信号转导的研究方法与工具
一、蛋白质磷酸化状态的检测
1、免疫印迹(phospho-protein specific antibodies)
2、免疫沉淀(protein-specific antibody + phospho-AA antibody
3、流式细胞仪分析
二、信号转导分子过度表达或过度激活
1、Overexpressionby gene transduction
2、Constitutively activated mutants
三、基因转录活性测定
1、Electrophoreticmobility shift analysis(EMSA)２、Reporter gene expression detection
四、信号转导分子的表达或活性抑制
1、Anti-sense
2、RNAi
3、Gene knock-out
4、Dominant negative mutants
5、Small-molecule inhibitors
6、Inhibitory oligopeptides 基因工程(Genetic Engineering)的基本定义(狭义)称遗传过程（Genetic EngineeringGenetic Engineering）从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因
除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术（DNA Recombination）
•基因工程的基本定义(广义)为DNA重组技术的产业化设计与应用包括上游技术和下游技术 游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）
游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程
基因工程的基本过程
（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（含外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）
（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）
（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）
（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（“增”）；
（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）
由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：“切、接、转、增、检”五步；
工具酶：在重组DNA技术中，对DNA进行切割、合成、剪接、补平、连接和修饰等工具酶是必不可少的。常用的工具酶主要有：
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶），分为三型。其中Ⅱ型被称为基因工程的分子手术刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。
二、DNA聚合酶
三、DNA连接酶
四、碱性磷酸酶
五、T4多核苷酸激酶
六、核酸酶S1
回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限酶所识别）粘性末端（stickyend）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。平末端（bluntend）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。同工异源酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一位点的酶称为。同尾酶（isoaudamers）:识别序列不同，但可产生相同粘性末端的限制酶称为
大肠杆菌DNA聚合酶ⅠE.Coli DNA polymeraseⅠ是单一多肽链的多功能酶有3种酶活性： ① 5′→3′DNA聚合酶活性 聚合作用:在引物的存在下，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的5′→3′聚合作用 ②3′→5′核酸外切酶活性校对作用
•这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸 ③5′→3′核酸外切酶活性切除修复作用
•从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸 Klenow片段的主要用途：
①补齐双链DNA的3′末端，同时可使3 ′末端DNA标记同位素。②cDNA克隆中，合成cDNA第二链。③DNA序列分析
（二）TaqDNA聚合酶（简称Taq酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5′→3′聚合酶活性和依赖于聚合作用的5′→3′外切酶活性TaqDNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增
（三）逆转录酶（reverse transcriptase）
是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。是多功能酶
逆转录酶的作用：
①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）
②核糖核酸酶H活性（RNaseH）: 3’→5’RNA外切酶活性 ③依赖DNA的DNA聚合酶活性（DDDP）
（四）末端脱氧核苷酰转移酶“搬运工”（terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT，简称末端转移酶）分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3′末端-OH上末端转移酶的功能 •在载体或目的基因3′末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接 •用于DNA 3′末端的同位素探针标记
三、DNA连接酶（DNA ligase）基因工程的”缝纫针”主要功能：催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5′磷酸基团与3′羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组
四、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA，RNＡ或dNTP上的5′-磷酸基团。主要用途： ①除去DNA片段上的5′磷酸以防自身连接
②在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5′端的磷酸
五、T4多核苷酸激酶
①前向反应
②交换反应
六、核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分其主要作用：①除去的粘性末端以产生平末端②除去cDNA合成时形成的发夹结构③分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况 功能：水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体中的单链部分
载体（vector）: 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA.制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达 载体包括克隆载体和表达载体
在常用的克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件（DNA序列）即为表达载体 –不仅可携带外源基因片段进入宿主细胞 –而且可在宿主细胞中表达外源基因 载体应具备的特征
①能自我复制并具较高的拷贝数。分子量一般< 10Kb。②带有遗传筛选标记。
③有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。
多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：载体上具有多个限制性内切酶的单一位点（即在载体的其它部位无这些酶的相同位点），以供外源DNA插入。
一、克隆载体能将载体外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体
（一）质粒载体
质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息质粒克隆载体的主要用途：
①用于保存和扩增< 2Kb目的DNA ②构建cDNA文库 ③目的DNA的测序
④作为核酸杂交时的探针来源
表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。
启动子是一段位于结构基因5‘端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。转录单元(transcription unit)–一段从启动子开始至终止子(terminator)结束的DNA序列
一个基因的3′末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能，此序列称为终止子 分子克隆的基本步骤“分、切、接、转、增、检”
一、目的基因的获取和载体的选择
一、目的基因的获取
１从基因文库中获取２逆转录法３人工合成DNA片段４直接从染色体DNA中分离目的基因
二、目的基因和载体分别被酶切与连接
三、目的基因与载体连接
四、重组DNA导入受体细胞
五、重组体的克隆
六、重组体的筛选和鉴定
基因组文库（genomic library，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群 构建基因组文库的步骤
–先将原核或真核细胞染色体DNA提纯
–通过机械或酶切使之成为一定大小的片段 –将其与适当的载体（一般为λ噬菌体）相连接 –经体外包装、转染细菌
–得到一组含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒
–这个文库中含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组全部序列的信息库，故称为G-文库
如以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套cDNA建库，则称为C-文库。细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competent cell)
某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ’基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶。该酶能催化指示剂底物X-gal 形成蓝色菌落。当外源基因插入lacZ’基因中MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选实验 基因工程的基本原理
（1）利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高其宏观表达水平
（2）筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子等基因的转录调控原件，并将这些原件与外源基因精细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平
（3）选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程 涉及到基因表达调控的分子生物学原理
（4）基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌（细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源表达产物产量的主要环节涉及生物化学工程学的基本理论体系
原癌基因是细胞内与细胞增殖相关的正常基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守 原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤 原癌基因的特点: 1广泛存在于生物界中； 2基因序列高度保守； 3作用通过其产物蛋白质来体现 4正常情况下表达水平很低;
5被激活后，形成致癌性的细胞转化基因
原癌基因的分类
1、src 家族氨基酸序列具有较高同源性和酪氨酸蛋白激酶活 性以及同细胞膜结合的性质，定位于 胞膜内侧或 跨膜 分布。
2、ras 家族 : 包括 类密切相关的成员 ras 3,虽其核苷酸序列的同源性较少但编码蛋白质，能结合 GTP，GTP 酶活性，并参与细胞内 cAMP 水平的调节
3myc 家族 :包括 myc myc myc fos c-等基因 其表达产物定位于 细胞核内 DNA 结合 蛋白类 , 或为转录调控中的反式作用因子 有直接的 调节其他基因转录的作用
4sis 家族 : 目前认为 sis 基因仅有一个成员。其表达产物与血小板源生长因子，可促进间叶组织的细胞增
5、erb 家族 : trk 等基因 其表达产物是生长因子和蛋白激酶，6、myb 家族 : 其表达产物为 核内 转录调节因子，能与 DNA 结合 原癌基因产物：
1.生长因子 2.生长因子受体 3.信号转导组分 4.细胞周期蛋白 5.细胞凋亡调节蛋白
6.转录因子 原癌基因的激活机理
1.DNA重排插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达负调控区的失活或丢失 2.基因放大3.点突变4.其它调控的异常
抑癌基因(tumor suppressor gene)/隐性癌基因：存在于正常细胞中，是一种抑制细胞生长和肿瘤形成的基因,其编码产物能抑制细胞生长、增殖的一组结构基因
确定抑癌基因在理论上需要满足的三个基本条件
1、在恶性肿瘤相应的正常组织该基因必须正常表达
2、在恶性肿瘤中，该基因有功能失活或结构改变或表达缺陷
3、将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞中，可部分或/完全改变其恶性表现 抑癌基因与原癌基因在生物学上有以下几点差异：
①在功能上，抑癌基因起负调控作用，而原癌基因起正调控作用；
②在遗传方式上，原癌基因是显性的，而抑癌基因在细胞水平上是隐性的，③在突变发生的细胞类型上，抑癌基因突变可以发生在体细胞中，也可能发生在生殖细胞中并通过生殖细胞得到遗传。原癌基因突变只发生在体细胞中。抑癌基因主要功能
(1)诱导终末分化(2)维持基因稳定(3)触发衰老，诱导细胞程序性死亡(4)调节细胞生长(5)抑制蛋白激酶活性
(6)改变DNA甲基化酶活性(7)调节组织蛋白酶活性(8)调节血管形成(9)促进细胞间联系 “二次突变”假说的意义
1、为解决遗传性和体细胞突变通过何种机制在肿瘤发生过程中起作用提供了思路
2、肿瘤细胞发生过程中隐性遗传性决定因素与体细胞表型连接起来 P53蛋白的生物学功能
①转录调节及抑制细胞生长的作用P53蛋白促进WAF1/CIP1基因表达产生一种分子量为21kD的蛋白质（p21WAF1/CIP1），诱导细胞生长停滞于G1期
②抑制DNA复制P53蛋白可与复制蛋白A(RPA)结合，而RPR与解链状态的DNA单链的结合可能是DNA复制的起始步骤，P53蛋白与RPA结合后可抑制RPA与单链DNA的结合，从而抑制了RPA与DNA复制起始点的结合，阻止细胞进入S期。P53蛋白还可通过抑制解链酶的活性，以抑制DNA复制。
③参与程序性细胞凋亡P53 蛋使损伤细胞停留在G1期，以便使DNA损伤修复后再进入细胞周期。若损伤不能修复，则启动细胞进入程序性凋亡（细胞自杀）
基因诊断的概念 ◆狭义的概念对疾病或与致病相关的核酸片段（DNA 或RNA）的确定及核苷酸序列的测定◆广义的概念(分子诊断)对疾病或与致病相关的基因（DNA）的表达产物（mRNA、蛋白质）的确定和序列测定，即从疾病基因或与致病相关的基因及其表达产物的水平上进行检测，因此实现了疾病的早期诊断
常见的基因诊断技术核酸分子杂交（hybridization）聚合酶链反应（PCR）DNA测序技术（DNA Sequencing）DHPLC DNA芯片技术 1.核酸分子杂交技术（hybridization）
•分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究中一项最基本的基因诊断技术
•杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）
•杂交双链可以在DNA与DNA链之间形成，也可在RNA与DNA链之间形成
分子杂交的概念两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交（molecular hybridization）分子杂交的本质
•杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性
•利用探针（probe）与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列
•探针：探针是指带有某些标记物（如放射性同位素32P，荧光物质异硫氰酸荧光素等）的特异性核酸序列片段
•核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子•因此应用核酸探针就可以检测待检核酸样品中特定基因序列 核酸探针的类型
•基因组DNA探针
•cDNA探针
•RNA探针
•寡核苷酸探针 核酸探针的设计原则
最基本的原则---具有高度特异性
◆探针的来源是否方便和制备探针的难易程度 ◆探针长度：一般要求在10～50bp ◆G／C含量为40％6％
◆探针分子中应避免互补序列
◆避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-◆借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较核酸探针的标记 一个理想的探针标记物应具有以下特性： ◆灵敏度高 ◆标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值 ◆检测方法要灵敏、特异、稳定、简便
◆标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉 ◆标记物对检测方法无干扰
融解温度(melting-temperature，Tm)在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度。由于这一现象和结晶的融解过程相似，又称为融解温度
固相杂交的优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用
分子杂交技术过程
☆探针制备及标记（同位素或非同位素）
☆待测核酸样品制备（分离，纯化）☆杂交（液相，固相，原位杂交）
☆杂交后处理（去掉非特异杂交分子）☆显示结果（显色，发光，放射自显影）☆结果分析
核酸分子杂交技术类型杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
（四）原位杂交（In situ hybridization）是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法 材料
石蜡包埋组织切片 冰冻切片 细胞涂片 培养细胞爬片 类型细胞内原位杂交组织切片内原位杂交
荧光原位杂交（fluorescence in-situ hybridization,FISH）
•荧光原位杂交是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术
PCR及其义：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction 简称PCR）又称体外酶促基因扩增•定义：体外模拟DNA的复制。（它是模拟DNA体内复制过程，在DNA聚合酶作用下，进行特DNA片段的体外复制）生物体DNA复制和条件
•细胞分裂：在细胞分裂前，作为遗传信息载体的DNA 要进行复制分三步完成：
–1.在细胞内有关因子参与下，1条双螺旋结构的DNA松散成2条单链。
–2.引物酶合成DNA引物，引物与单链碱基互补配对，形成引物---单链复合物。
–3.在DNA聚合酶作用下，按照碱基配对原则，按照一定方向，逐一将互补的dNTP链接上去，形成一条新的DNA双链。（半保留复制）
•根据体内DNA复制的条件，PCR也分三步完成：
1.高温变性：将反应体系加热到90度以上，1条双链模板变成2条单链模板。
2.低温退火（复性）：将反应体系降温到50度左右，人工合成的特异寡核苷酸引物，按照碱基配对原则，与单链模板DNA结合。
3.中温延伸：在耐热DNA聚合酶作用下，在引物引导下，逐一将人工合成的dNTP连接上去，一条单链形成双链。•PCR技术实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应 •PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成 PCR反应五要素
（一）模板（template）
（二）引物（primers）
（三）DNA 聚合酶（DNA polymerase）
（四）dNTP
（五）PCR缓冲液（PCR buffer）SDS的主要功能是：
•溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜 •解离细胞中的核蛋白
•与蛋白质结合而使蛋白质沉淀
蛋白酶K作用：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白 设计引物应遵循以下原则
•①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右
•②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段
•③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列
•④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带 •⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 •⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
•⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
•退火温度是影响PCR特异性的较重要因素：变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合 •退火温度与时间，取决于：
–引物的长度 –碱基组成及其浓度 –靶基序列的长度
•20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度的起点较为理想
•引物的复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度，合适的复性温度= Tm值-（5～10℃）•在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 •复性时间一般为30 ～60 sec，足以使引物与模板之间完全结合 •TaqDNA聚合酶的生物学活性：
–70～80℃150核苷酸/S/酶分子 –70℃60核苷酸/S/酶分子
–55℃24核苷酸/S/酶分子 –高于90℃时，DNA合成几乎不能进行 •延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃ •延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定 –一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的 –3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min •延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现 •对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 •循环次数决定PCR扩增程度
•PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多
PCR反应条件的选择
•PCR反应条件为温度、时间和循环次数
•温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法
–90 ～95℃变性 –40 ～60℃退火 –70 ～75℃延伸 •扩增100～300bp片段，可采用二温度点法 –94℃变性
–65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的 催化活性）
PCR仪工作参数的设置
•94℃30~60sec•55℃30~60sec•72℃30~60sec •循环30次，最后72℃延伸1～10min PCR扩增产物的检测方法
(一)凝胶电泳
•1．琼脂糖凝胶电泳法
•不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法
•基本原理是–在电泳过程中，凝胶中的溴乙锭(EB)嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光–该法最大的缺点是不能鉴定PCR产物的序列，而且存在溴乙锭污染
•2．聚丙烯酰胺凝胶电泳法不同浓度的丙烯酰胺浓度分离DNA的有效范围不同
•特点：–分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；
–回收的DNA纯度高；–采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。
•用途：•PCR扩增指纹图•多重PCR
•PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）
★影响迁移率的因素：①核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③DNADNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。④电压，不大于5V/cm5V/cm
•特点：–分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开； –上样量远大于琼脂糖凝胶；–回收的DNA纯度高；
–采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。•用途：•PCR扩增指纹图•多重PCR
•PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）
•据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。
•用途：–传染病病原体基因分型–人类基因的变异性研究。
限制性片段长度多态
RFLPRFLP）
﹡DNA多态性：群体中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性
﹡RFLP:DNA序列的多态性如果发生在限制性内切酶的识别位点上，就会造成酶切位点的缺失或新位点的出现，酶切后DNA片段长度发生变化
﹡RFLP产生的类型：单个碱基的突变引起的酶切位点的变化，DNA序列的较大变化 限制性片段长度多态性 RFLPRFLP）
﹡DNA多态性：群体中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性
﹡RFLP:DNA序列的多态性如果发生在限制性内切酶的识别位点上，就会造成酶切位点的缺失或新位点的出现，酶切后DNA片段长度发生变化
﹡RFLP产生的类型：单个碱基的突变引起的酶切位点的变化，DNA序列的较大变化
(四)PCR产物测序•对PCR产物进行测序是检测PCR产物特异性最可靠的方法，可将PCR产物克隆到载体上进行测序，也可对直接PCR产物进行测序。测序常用的方法为双脱氧核苷酸链末端终止法和化学裂解法。
（一）巢式PCR（nested PCR）巢式PCR是用两对引物，一对引物序列在模板的外侧，另一对引物序列在模板内侧（相对于第一对引物）
（二）逆转录PCR（reverse transcription，RT-PCR）•原理是先将RNA用逆转录酶逆转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与其他常见PCR方法类似。
（三）多重PCR（multiplex PCR）该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。DNA测序技术
•核酸是生命的遗传载体，其结构从根本上决定了基因的表达及其功能。核酸序列的改变意味着生物学含义的改变
•测定并分析核酸的序列，是研究其结构、功能及其关系的前提，是分子生物学最基本的课题，并为临床疾病的基因诊断提供最为精确的判定依据
（一）双脱氧终止法
Sanger法DNA测序的试剂
引物 模板 DNA dNTP放射性（荧光）标记的ddNTP •DNA 测序反应与PCR反应类似
•反应体系中包含：模板DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物 •反应过程：变性－复性－延伸－终止
ddNTP是链反应终止剂•DNA聚合酶I能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′磷酸二酯键。通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA从5′→3′不断延伸。ddNTP是链反应终止剂
•ddNTP只比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′三磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，使该链的延伸终止于这个异常的核苷酸处
在4组独立的酶反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP／ddNTP的浓度，链的持续延伸就将与随机但特异发生的链终止反应展开竞争
结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置上的一系列长度的核苷酸链通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出DNA上的核苷酸顺序
• •在自动测序中ddNTPs用4种荧光染料中的1种标记（每种荧光染料被激光照射时可发出特定波长的光）。•ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。•反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs 化学测序法原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片 段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序 图谱
第三篇：分子生物名词解释
分子生物学
名词解释：
1.基因组（genome）：指生物体或细胞中，一套完整单体的所有遗传物质的总和；或指原核生物染色体、质粒，真核生物的单倍染色体组、细胞器，病毒中所含有的一整套基因组。2.顺式作用元件(cis-acting element)：具有调节功能的特定DNA序列只能影响同一分子中的相关基因，发生在一个序列中的突变不会改变其他染色体上等位基因的表达，这样的序列称为顺式作用元件。3.反式作用因子（trans-acting factor）：与顺式作用元件相反的调节蛋白，可通过扩散结合于细胞内的多个靶位点，当发生突变后将同时影响不同染色体上等位基因的表达，表现出反式作用的调节蛋白。4.可读框（ORF）：指从起始密码子到终止密码子的一般连续的密码子区域，或DNA序列测定中，由计算机辨认出的可能的编码区域。
5.癌基因：其基因产物具有转化真核细胞的能力，使之与肿瘤细胞相同的方式生长。即一类与癌的生成有关的基因。控制细胞分裂的基因由于突变或肿瘤病毒的入侵而失去调节功能，原癌基因转变为癌基因。
6.核酶（ribozyme）：泛指一类具有催化功能的RNA分子，一般指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。7.管家基因（house-keeping genes）：为组成型基因，指在各种细胞中都能表达的一类基因，其产物是维持细胞基本生命活动所需的物质。8.ESTS（表达序列标签）：从一个随机选择的cDNA克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分。在数据库其尺度从20~7000bp不等。9.GMO（Genetcallly Modified Organisms）：基因修饰生物，在不导入外源基因的情况下，通过对生物体本身遗传物质的加工、敲除、屏蔽等方法以改变生物体的遗传特性，得到人们希望得到的性状。10.Terminator（终止子）：是DNA分子中决定转录产物3’-OH端酶分子停止聚合，释放出已合成的RNA分子的位点。
11.Zinc Finger region（锌指结构）：是一种常出现在DNA结合蛋白中的结构。由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个His配位的Zn构成，结构似指状。它有一个α-螺旋和一个β-螺旋，与DNA双螺旋的大沟结合影响转录。12.rho factor（P因子）：为一种单体分子质量为46Kda的蛋白质，通常以同源大聚体的活性形式存在，分子质量约为275Kda。它是RNA聚合酶的一种重要的蛋白质辅助因子，只在转录的终止过程中发挥作用。
13.nucleosome（核小体）：核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位。由组蛋白核心和盘旋其上的DNA共同构成的紧密结构形成。（4种组蛋白（H2A, H2B, H3 和 H4）以八聚体的形式形成核心颗粒，DNA缠绕在颗粒表面形成核小体）。14.Hybridization（分子杂交）：利用双螺旋结构的各种性质在DNA复性后可以得到恢复加持性，可以将两个不同来源的互补序列退火形成双链的过程叫分子杂交。15.Composite transpasons（复合型转座子）：一类除了有转座酶基因外，还带有抗药性基因标志，其两末端由相同的IS序列或末端由38bp的反向重复序列组成的结构。大而复杂的转座子。16.冈崎片段（Okazaki fragment）：指在半不连续复制中，新合成链方向为3’→5’端，实际上是由许多5’→3’方向合成的DNA片段连接起来的，首先沿5’→3’方向合成的较短的DNA片段，随后被连接成完整的方向为3’→5’DNA的新链。17.TM（解链温度）：DNA发生变性时，使DNA双螺旋链结构解开一半或e（P）吸收值到最高值的一半时的温度。melting temperature。
18.Pribnow box：又称-10序列，细菌启动子起始点上游约-10处找到的6bp的保守序列TATAAT，是转录的解链区。
19.SSR（简单序列重复）：也称微卫星DNA，一种简单串联重复DNA序列，其重复单位为1~6个核苷酸，由10~50个变性单位串联组成，在整个基因组中分布且密度高，在遗传图和物理图的研究中有重要作用。
20.antisemseRNA（反义RNA）：通过碱基互补配对与特定mRNA上包括SD序列、起始密码子AUG及部分N端密码子的序列结合，抑制mRNA翻译的一类RNA。21.replion（复制子、复制单位）：基因组中能独立进行复制的单位。包括复制起始点到终止点的一段DNA序列。
22.SDS reaction（应急反应）：由许多能造成DNA损伤或抑制DNA复制的过程引起的一系列复杂的诱导效应，这种效应称为应急效应。23.promoter（启动子）：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列位点，不被转录。24.Operon（操纵子）：是原核生物在分子水平上基因表达调控的单位，与功能相关的基因相连，由同一控制区控制转录，这些基因包括结构基因、操纵子基因、启动调节基因几部分。25.Enhancer（增强子）：是指能使和它连锁的基因转录效率明显增加的DNA序列。26.SD sequence（SD序列）：mRNA上位于起始密码子AUG序列上游10个碱基左右的区域能与16S核糖体RNA3’端反SD序列7个嘧啶碱基互补识别，以帮助从起始AUG处开始翻译的一段富含嘌呤碱基的序列。27.cDNA和cccDNA：
cDNA：加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA。
cccDNA：独立于细菌及某些真核细胞染色体外的共价闭合环状DNA。
28.RNA剪接：基因的外显子和内含子都转录在一条原初转录本RNA分子中。在加工过程中切除内含子、连接外显子产生成熟RNA分子的过程叫RNA splicing。29.ITS（内转录间隔区）：真核生物基因组中编码核糖体的基因，包括28SrDNA，5SrDNA，18SrDNA和5.8SrDNA四种。它们在染色体上头尾相连，串联排列，相互间由间隔区分开。30.gratuitous inducer（安慰诱导物）：能够诱导酶合成，但又不能被所诱导酶分解的分子。31.triplet codons（三联体密码子）：mRNA链上决定一个特定的氨基酸的三个连续的核苷酸序列。（mRNA上特定的核苷酸序列对应蛋白质链上特定的氨基酸序列）32.STS（序列标签位点）：基因组物理图谱中起标识作用的位置已知的独特的小段单拷贝DNA序列。长度一般为300~500bp。在染色体上有一定的位置。33.intron and exon（内含子、外显子）： 内含子：不连续基因中无编码功能的区段，或者说，在初始转录产物hnRNA加工产生成熟的mRNA时，被切除的非编码序列。
外显子：在不连续基因中有编码功能的区段，与mRNA的序列行对应。34.sence strand（有义链）：在体内DNA的两条链仅有一条用于转录，或某些区段以这条链转录，这时，不用于转录的链称为非模板链，又称有义链。非模板链与合成的RNA产物链从一个方向阅读时，序列完全相同，所以又称编码链。35.衰减子（弱化子）：attenuator：对色氨酸操纵子的转录水平进行微调DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列。
36.CAP蛋白超级调控因子：CAP是E.coli分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递给许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可利用其他碳源。
第四篇：分子生物实验室应该配备的仪器耗材
分子生物实验室应该配备的仪器耗材
分子生物学作为基因工程的上游技能，其试验的效果和准确性将决议下流一切的进程和结尾的试验成果。因而构建一个设备齐全的分子生物学试验室是十分重要的，这里小编给大家介绍构建一个分子生物学试验室需求哪些仪器设备。
1.冰箱：依据药品、试剂及多种生物制剂保管的需求，有必要具有不一样控温等级的冰箱，最常运用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。4℃合适贮存某些溶液、试剂、药品等。-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。-80℃合适某些长时间低温保管的样品、大肠杆菌菌种、纯化的样品、特别的低温处置消化液等的保管。0-10℃的层析冷柜合适低温条件下的电泳、层析、透析等试验。
2.培育箱：37℃恒温箱用于细菌的平板培育及分子生物学试验。
3.恒温培育摇床：用于大肠杆菌等生物工程菌种的扩增。
4.水浴锅：用于保温并进行各类试验。25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反响等试验的保温。低温的水浴槽能够用于分子生物学的质粒与基因片段的衔接等试验及用于42度的大肠杆菌感受态的热激。
5.烘箱：主用于烘干试验器皿，有些需求温度高些，有些需求温度低些。用于RNA方面的试验用具，需求在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤箱中进行烘干。
6.超纯水机：跟着分子生物学的飞速发展，许多试验对水纯度的需求越来越高，用自来水、蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵效果使水循环。用于PCR、PCR氨基酸剖析、DNA测序、酶反响、安排和细胞培育等。
7.蒸汽消毒锅：分子生物学所用大多数试剂，并且试验用具都应严厉消毒灭菌。用于小批量物品的随时消毒。大批试验物品、试剂、培养基可运用大型消毒且守时进行消毒。
8.滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其处菌。
9.各种天平：台秤、精细电子剖析天平，用于准确称量各类试剂。
10.液体体积的衡量：量筒、移液管、微量取液器、刻度试管、烧杯、锥形瓶 等。
11.pH计：测定溶液中H+的直接电位的仪器，首要经过一对电极，在不一样的pH溶液中发生不一样的电动势用pH值表示出来;
pH试纸：只适用于培育液、酚饱满液、缓冲液或其它试剂溶液的pH值的大略估量。而大多数试剂的制作需求严厉的pH值，需准确度高(小数点后两位)的pH计。
12.分光光度计：光密度、分光光度计是运用物质在可见光和紫外线区域中的吸收光谱来判定该物质的性质及其含量的一种仪器。它是由光源、单色器、吸收池、接收器、丈量外表或显现屏幕所组成。OD值是许多溶液中溶质定量的便利目标之一，经过所发生的单色光而测定某一溶液对该单色光的吸收值，运用它可进行核酸溶液定量和纯度的初步判断。OD值也能够作为菌浓的检测目标。
13.高速离心机：最大转速25000 r/m，最大离心力89000g。有冷冻和常温两种，多用于制备和手搜集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸铵沉淀物以及免疫沉淀物等。
14.超净作业台：内有紫外灯、照明灯、还应有酒精灯火焰、75%乙醇等灭菌的设备，是一种供给部分洁净度的设备。其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，经过作业台面，使试验操作区域变成无菌的环境。
15.电泳体系：电泳技能是检测、判定各种生物大分子的纯度、含量及描绘它们的特征，乃至仍是别离、纯化、收回和浓缩样品的东西之一。
电泳体系分为电源和电泳槽，电源需经稳流经过稳压器，既能供给安稳的直流电，又能输出安稳的电压;水平式电泳槽：通常分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽。
16.PCR仪：Polymerase Chain Reaction仪，也称DNA热循环仪，基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两边，然后酶促组成拷贝数百万倍的靶序列DNA基因片段，它的每一循环包含在三种不一样温度进行的DNA变性，引物复性，DNA聚合酶催化的延伸反响三个进程。需求阐明的是，有些试验室能够还需求梯度PCR仪或实事定量荧光PCR仪来进行一些特别的分子生物学试验。
第五篇：实验报告
《体育测量与评价》实验报告模板
课程名称：体育测量与评价
实验名称：ISAK全套人体测量指标(共39项)测试
一、预习报告
1.实验目的①通过实验强化体格及身体成分测量的有关知识和操作技能，培养系统的积累有关数据资料，树立求真务实的风气，培养严谨的科学研究工作能力和协作精神。
②通过实际测量，准确掌握测试点的定位，正确使用测量仪器，准确读数；提高学习兴趣，培养动手能力，理论联系实际，将基本理论知识联系到体育教学、运动训练和科研的实际中去，培养对实际问题的分析处理能力，进而为体育运动实践提供科学指导。
2.实验内容
量度：体重（1项）
长度：身高、坐高、上臂、前臂、手长、髂前上棘高、大转子高、大腿、小腿、胫骨长（10项）
宽度：肩宽、髂嵴、足长、胸宽、胸厚、肱骨、股骨（7项）
围度：头围、颈围、上臂放松、紧张围、前臂、手腕、胸围、腰围、臀围、大腿、大腿中、小腿、踝围（13项）身体成分：肱
三、肩胛、肱
二、髂嵴、髂前、腹部、、大腿前、小腿内（8项）
3.实验条件
量度测量：杠杆式体重秤
长度测量：身高/坐高仪，长、短钢直尺，两米以上的卷尺，足长测量计
宽度测量：测径规
围度测量：带状软尺
体成分测量：皮褶厚度计
二、实验操作与结果
1.实验方法、步骤
①学习ISAK全套人体测量指标(共39项)测试的相关理论知识；测量方法、相关仪器使用方法、读数、产生误差的原因等。
②测量上述指标，3人一组（被测人、测量员、记录员）相互测量，完成3次测量，并将测量的结果填写在表格中，计算出平均值或取中间值记录，检查准确无误后，再填写电子版，打印后贴在实验报告的实验数据处。
③讨论交流测试各项指标的心得体会，为自己或同学制定个人锻炼计划、体质健康增强方案等提供参考数据。
2.实验现象、数据及观察结果
见附表（要求将测试数据输入表格后打印粘贴）
3.分析讨论
围绕受试者各项指标的测量结果，根据以往学习基础，参考《国家学生体质健康标准》，分析其目前体格和身体成分状况，提出制定个人锻炼计划的设想或个人增强体质健康的重点方向。
针对出现较多或较大误差的测试项目，探寻原因，提出改进措施。
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