东海原甲藻Prorocentrum donghaiense Lu生物学研究进展

第一篇：东海原甲藻Prorocentrum donghaiense Lu生物学研究进展

生态环境 2007, 16(3): 1053-1057

http://www.xiexiebang.comia closterium)适温范围为10~20 ℃[15]。东海原甲藻生长的最适温度为22 ℃，22 ℃以下时，东海原甲藻的生长率随温度增高而增加，温度低于13 ℃和16 ℃时，藻类的生长和存活能力明显下降。25 ℃时，藻的生长率稍有下降[16-18]，但最近有文献报道东海原甲藻生长的最适温度为19 ℃[19]。

关于盐度影响藻类生长的机制，报道不多。对于藻细胞而言，在高盐度下生长需要更多能量，作为细胞内储存物质的脂肪的含量相应增加。而当盐度适当降至其原环境的盐度2/3时，对其生长有明显的促进作用[20]。盐度对东海原甲藻的影响表现为在低盐度18下生长能力较弱;盐度22和35.7时，其生长能力相当;最适盐度为25~31[16，19]。东海原甲藻的最适温度和盐度范围与现场赤潮区的温、盐数值一致，从温、盐上看长江口至舟山群岛这一海区在5和6月份正适合东海原甲藻的生长[16]。2.2 东海原甲藻对氮源和磷源的利用

氮、磷在海洋环境中的含量、形态构成、数量变动不仅影响着赤潮生物的生理、生化组成，还决定了赤潮形成的规模和程度。因而，氮、磷营养盐成为了长江口富营养化过程中人们关注的焦点。藻

类通常优先利用铵盐[21]，因为NH4-N可直接被藻类利用。其他形式的无机态的N（如NO3-、NO2-）都是间接被利用的。NH4-N 在被同化为氨基酸时并不需要被降解，而NO3-N 却需要先被还原才能被利用。东海原甲藻均能利用铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐，并且也是优先利用铵盐[22]。最适生长的w(N)/w(P)比范围在8~20之间[23，24]。东海原甲藻对甘氨酸和L2丙氨酸利用程度不高，当以这两种物质作为氮源时，生长素率和生物量均下降，高浓度时有明显的抑制作用[23]。资料显示：长江口邻近海域溶解无机氮秋季以NO3-N为主，春季则以NH4-N 为主[25]，这样该区域溶解无机氮为东海原甲藻高密度赤潮的爆发和维持提供了氮源。

东海原甲藻可以吸收无机磷NaH2PO4，又可以利用3种小分子有机磷ATP、葡萄糖-6-磷酸和甘油磷酸钠，这说明东海原甲藻在自然海水中可以利用的磷源比较广泛，从而可以为东海原甲藻赤潮形成提供丰富的磷源[26]。

东海原甲藻细胞在N限制和P 限制下的生长没有明显的差异，2 种营养盐环境下藻细胞具有相似的生长过程，但在P限制下藻细胞密度要高于在N限制下的藻细胞密度[17]。与中肋骨条藻相比东海原甲藻能够忍受低营养盐环境，在低营养盐环境下具有较强的竞争能力。这一结果与东海原甲藻赤潮爆发现场的环境调查结果基本一致，可以作为解释东海原甲藻赤潮形成原因的依据之一[17，18]。

N、P限制条件下塔玛亚历山大藻的藻液对东海原甲藻生长有显著的抑制作用，这种作用远高于营养丰富条件下的情况。由此可以推测，塔玛亚历山大藻对东海原甲藻可能存在化感作用，营养盐限制可促进塔玛亚历山大藻化感物质的产生和分泌。在东海原甲藻赤潮后期，水体中营养盐将耗竭，此时，为竞争有限的营养盐，塔玛亚历山大藻释放出大量的化感物质从而抑制东海原甲藻的生长，使东海原甲藻赤潮迅速消亡[27，28]

2.3 东海原甲藻是一种喜长光照的赤潮藻类

东海原甲藻对光周期变化的反应敏感，孙岁寒等[29]发现：随着光周期的延长东海原甲藻的细胞密度、叶绿素a和蛋白质含量等指标均增加。如培养第14 d的细胞密度，光周期1 h处理的为4.2×103个·mL-1，光周期23 h处理的则达到1.4×105个·mL-1，前者只相

当于后者的3%。同时孙岁寒等[29]

发现东海原甲藻对光周期处理的适应程度不同。光周期在6 h以下为不适区间，8~18 h为亚适区间，20 h以上为最适区间。可以推测，在日照时间长、持续光照的条件下，东海原甲藻容易迅速大量繁殖，形成赤潮。东海原甲藻的分子生物学研究

3.1 分子识别与系统发育学研究

随着分子生物学的迅猛发展，人们对东海原甲张秀芳等：东海原甲藻Prorocentrum donghaiense Lu生物学研究进展

1055 藻的识别、分类及其与其它甲藻的亲缘关系开始逐渐转向基因水平的研究。28S nrDNA、18S nrDNA和ITS 序列为最常用的分子标记。东海原甲藻和CCMP1517具齿原甲藻的nrDNA ITS序列特征一致，总长度为552 bp，两者的仅有1个碱基的差异，碱基差异值仅为0.002[9，11，30]，而与其他种的差异为0.089~0.286。在真菌和藻类中种间ITS核苷酸差异值一般大于14%，尤其单细胞藻类的差异值一般较大。由于选择压力小，变异速度快，ITS序列适宜属级及种级、甚至种下水平差异的比较。根据nrDNA ITS 序列，东海原甲藻和美国国家海洋藻种保藏中心的具齿原甲藻应为同一个种，是世界分布海域的不同而形成的东海的一个地理生态型种群[9，11]。根据东海原甲藻及CCMP1517线粒体Cob 基因序列得到同样的结果[31]。东海原甲藻及CCMP1517具齿原甲藻nrDNA 18S序列的碱基差异值为0.000 [11，12]。王鹏等2003）采用PCR技术扩增我国东海原甲藻和来自美国Biglow海洋研究所海洋浮游植物培养中心(CCMP)的具齿原甲藻的核糖体大亚基(LSU rDNA)基因的D1~D3区，并将同源序列进行比较分析，结果表明；两者710bp的LSU rDNA同源序列中仅存在7个碱基的差异，遗传相似度高达99.01%，遗传差异为0.99%。他们并将东海原甲藻、具齿原甲藻(CCMP)与Genebank中的Prorocentrum mexicanum、P.micans和Prorocentrum minimum 3种原甲藻的同源序列进行比较，发现其他3种原甲藻两两间的种间遗传相似度在91.1%~95.5%之间，P.micans和P.minimum 种内不同株系的遗传相似度为99.4%~99.9%，均为99%以上。因此他们认为：东海原甲藻和具齿原甲藻（CCMP）当属异名同种，两者的亲缘关系属于种内不同藻株的关系[10]。

根据其ITS 序列(含5.8S 区域)发现该物种与微小原甲藻的亲缘关系较近[32]。此结果与张秀芳等用该藻的线粒体Cob基因和CoxI基因片断的序列的研究结果相似(个人通讯)。根据线粒体Cob基因序列得到同样的结果[31]。3.2 表达序列标签分析

表达序列标签分析就是cDNA 克隆大规模单方向测序，是快速分离功能基因的重要工具。一些重要的模式动植物和经济动植物已进行了大规模的EST研究，包括海藻中的紫菜、龙须菜等。尽管EST 分析规模(分析的标签数)对分离低丰度表达的基因有巨大影响，但在特定物种中进行EST 分析，总能鉴定出大量的功能基因，尤其是特定物种的首次EST 分析。另外，EST也是分子标记研制的重要基础数据。

大规模鉴定和分离功能基因对研究东海原甲藻的生物学和认识相关赤潮形成机理具有重要意义，而缺乏EST数据已成为对东海原甲藻进行深入研究的限制之一。为此，我们构建了对数生长期东

海原甲藻的cDNA文库，并进行了小规模尝试性EST 分析，以期为在东海原甲藻中开展相关研究建立方法学基础[30，33]。我们用对数生长期的藻细胞构建了cDNA文库，从随机选择的700个克隆中获得了565个可用的序列。排除那些对应于核糖体RNA的序列后，其余的序列可分成308个EST组，包括272个单一序列和36个重叠群。以EST组提交数据，这些序列的获取号码为DQ336341，336342，DW520905~DW521210。有42条(约7.8%)ESTs与22个参与代谢、细胞形态建成、基因表达、信号传导和蛋白质合成的已知功能基因相匹配。重要的是我们发现有两组EST分别与两个细胞程序化死亡的关键蛋白同缘，它们分别是半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶和分裂细胞核抗体。这一基因将有助于我们理解东海原甲藻细胞的凋亡过程。

过去把浮游植物的消失归结为动物哺食和沉降，后来又归结为细胞外部的病毒感染。近年来，细胞程序化死亡被认为是浮游植物细胞消失的又一个原因[34，35]。从细胞形态学角度(这一角度细胞程序化死亡称为apoptosis)，细胞程序化死亡已经在一个绿藻和一个硅藻中观察到[36]。细胞程序化死亡是一个多种蛋白相互作用的级联系统。在这一系统的末端，半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶选择性地降解蛋白质，使细胞进行程序化死亡[37]。半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶的鉴定初步证明了东海原甲藻存在细胞程序化死亡过程，也为东海原甲藻的繁殖和死亡研究，以及它形成的赤潮的爆发和消亡机制研究打下了一定的基础。另外，该蛋白的表达还有可能成为一个生理标记，用在东海原甲藻赤潮的监测以及影响赤潮形成的环境因子研究上。

被同时鉴定出来的还有一组代表分裂细胞核抗体蛋白（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的EST。这一组EST在进行BLASTN比对时，与甲藻Pyrocystis lunula的PCNA具有非常高的同源性，其E值为6E-93。如果没有该蛋白或者其浓度特别低，细胞就会进入程序化死亡[38]。PCNA与细胞的分裂活动联系在一起，特别是与细胞周期的S期密切相关。因此，PCNA可以作为预测肿瘤的一个分子标记。由于同样的原因，PCNA成为研究浮游植物生长速率的一个分子标记[38]。同样，它的鉴定也有助于我们理解东海原甲藻赤潮形成的机制。

有一些真核微藻的基因组序列已经测定出来了[39]，这些全基因组序列具有不可替代的作用，因为只有有了这些序列，我们才能发现基因，摸清对应生物的代谢途径。同时，大量的包括甲藻的表达序列标签也在不断地积累[40]。ESTs数据是有用的，特别是对于像东海原甲藻这种没有进行整个基因组测序的物种。（1056

生态环境

第16卷第3期（2007年5月）展望

由于东海原甲藻赤潮已严重威胁到我国的海产养殖业和人民健康，因此它已经成为我国海洋学界密切关注的一个赤潮种。我国的科技工作者在研究该藻的形态、生理、生态和分类(包括分子分类)都取得了一定的成果。但对它的快速增殖和死亡的分子基础研究还比较少，我们认为：应加强对东海原甲藻赤潮的监测、繁殖和死亡及影响东海原甲藻赤潮形成的环境因子研究。从基因表达及调控角度研究东海原甲藻赤潮的形成与消亡机制并阐明其与环境因子的关系是必要且具有显著科学和实际意义。

参考文献：

[1] 王金辉, 黄秀清.具齿原甲藻的生态特征及赤潮成浅析[J].应用生态学报, 2003, 14(7): 1065-1069.WANG Jinhui, HUANG Xiuqing.Ecological characteristics of Proro-centrum dentatum and the cause of harmful algal bloom formation in China Sea[J].China Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1065-1069.[2] 周名江, 颜天, 邹景忠.长江口邻近海域赤潮发生区基本特征初探[J].应用生态学报, 2003, 14(7): 1031-1038.ZHOU Mingjiang, YAN Tian, ZOU Jingzhong.Preliminary analysis of the characteristics of red tide areas in Changjiang River estuary and its adjacent Sea[J].China Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1031-1038.[3] 周伟华, 殷克东, 朱德第.舟山海域春季浮游植物生物量及东海原甲藻赤潮频发机制初探[J].应用生态学报, 2006, 17(5): 887-93.Zhou Weihua, Yin Kedong, Zhu Dedi.Phytoplankton biomass and high frequency of Prorocentrum donghaiense harmful algal bloom in Zhoushan sea area in spring[J].China Journal of Applied Ecology, 2006, 17(5):887-893.[4] TANG D L, Di B P, WEI G F, et al.Spatial, seasonal and species variations of harmful algal blooms in the South Yellow Sea and East China Sea[J].Hydrobiologia, 2006, 568(1): 245-253.[5] Lu D D, Goebel J.Five red tide species in genus Prorocentrum in-cluding the description of Prorocentrum donghaiense Lu sp.nov.from the East China Sea [J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2001, 19(4): 337-344.[6] 陆斗定, 齐雨藻, Jeanette Goebel, 等.东海原甲藻修订及与相关原甲藻的分类学比较[J].应用生态学报, 2003, 14(7): 1060-1064.LU Douding, QI Yuzao, Goebel J, et al.Redescription of Prorocen-trum donghaiense Lu and comparison with relevant Prorocentrum species[J].China Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1060-1064.[7] 吕颂辉, 张玉宇, 陈菊芳.东海具齿原甲藻的扫描电子显微结构[J].应用生态学报, 2003, 14(7): 1070-1072.LÜ Songhui, ZHANG Yuyu, CHEN Jufang.Scanning electronmi-croscopic study on Prorocentrum dentatum from the East China Sea[J].China Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1070-1072.[8] 齐雨藻, 王艳.我国东海原甲藻应属哪种？[J].应用生态学报, 2003, 14(7): 1188-1190.QI Yuzao, WANG Yan.What the Prorocentrum species should be? —A review on identif ication of a Prorocentrum species from the East China Sea [J].China Journal of Applied Ecology, 2003, 14(7): 1188-1190.[9] LU D D, GOEBE J, QI Y Z, et al.Morphological and genetic study of Prorocentrum donghaiense Lu from the East China Sea, and compari-son with some related Prorocentrum species[J].Harmful Algae, 2005, 4: 493-505.[10] 王鹏, 梁君荣, 高亚辉, 等.基于核糖体DNA大亚基片断序列探讨中国东海海域赤潮原甲藻的分子分类[J].厦门大学学报(自然科学版), 2005, 44(3): 437-440.WANG Peng, LIANG Junrong, GAO Yahui, et al.Identif ication of Prorocen trum dongha iense in Genus Prorocentrum from the East China Sea Based on Partial LSU rDNA [J].Journal of Xiamen Uni-versity(Natural Science), 2005, 44(3): 437-440.[11] 罗立明, 胡鸿钧, 李夜光, 等.东海原甲藻的分子鉴定[J].海洋学

报, 2006, 28(1): 127-131.LUO Liming, HU Hongjun, LI Yeguang, QI Yuzao, et al.Molecular identification on Prorocentrum donghaiense [J].Acta oceanologica Sinica, 2006, 28(1): 127-131.[12] 王波, 米铁柱, 吕颂辉, 等.五种/株原甲藻核糖体小亚基(18S

rRNA)基因克隆及序列分析[J].海洋与湖沼, 2006, 37(5): 450-456.WANG Bo, MI Tiezhu, LÜ Songhui, et al.Clonging and sequences analysis of 18s rRNA gene of five Prorocentrum species/strains[J].Oceanologia et Limnologia Sinica, 2006, 37(5): 450-456.[13] 王金辉.东海赤潮生物具齿原甲藻及其特征[J].浙江海洋学院学

报: 自然科学版, 2003, 22(2): 128-131.WANG Jinhui.The HAB Spacies Prorocentrum dentatum and its Characteristics in East China Sea[J].Journal of Zhejiang Ocean University: Nature Science Edition, 2003, 22(2): 128-131.[14] 王方正, 张庆, 吕海燕.温度、盐度、光照强度和PH值对海洋原甲

藻增长的效应[J].海洋与湖沼, 2001, 32(1):15-18.WANG Fangzheng, ZHANG Qing, LÜ Haiyan.Effectic of Temper-ature Salinity Light and pH on the Growth of red tide Organisms Prorocentrum micans[J].Oceanologia et Limnologia Sinica, 2001, 32(1):15-18.[15] 周洪琪, Renaud S M, Parry D L.温度对新月菱形藻、铲状菱形藻

和巴夫藻的生长、总脂肪含量以及脂肪酸组成的影响[J].水产学报, 1996, 20(3):235-240.ZHOU Hongqi, Renaud S M, Parry D L.Effect of Temperature on Growh, total lipid Content and fatty acid Composition of the Micro-algae, nitzschia clostorium, nitzschia paleacea and pavlova sp.[J].Journal of Fisheries of China, 1996, 20(3): 235-240.[16] 陈炳章, 王宗灵, 朱明远, 等.温度、盐度对具齿原甲藻生长的影

响及其与中肋骨条藻的比较[J].海洋科学进展, 2005, 23(1): 60-64.CHEN Bingzhang, WANG Zongling, ZHU Mingyuan, et al.Effects of Temperature and Salinity on Growth of Prorocentrum dentatum and Comparisons Between Growths of Prorocentrum dentatum and Skeletonema costatum [J].Advances in marine science, 2005, 23(1): 60-64.[17] 王宗灵, 李瑞香,朱明远等.半连续培养下东海原甲藻和中肋骨条

藻种群生长过程与种间竞争研究[J].海洋科学进展, 2006,24(4): 495-503.WANG Zongling, LI Ruixiang, ZHU Mingyuan, et al.Study on Population Growth Processes and Interspecific Competition of Pro-rocentrum donghaiense and Skeletonema costatum in Semi-continuous Dilution Experiments[J].Advances in marine science, 2006, 24(4)495-503.[18] 由希华,王宗灵,郝彦菊, 等.东海原甲藻与塔玛亚历山大藻种群增

长过程与种间竞争研究[J].海洋科学进展, 2006, 24(4):504-510.YOU Xihua, WANG Zongling, HAO Yanju, et al.Study on Popula-tion Growth Process and Interspecific Competition of Prorocentrum donghaiense and Alexandrium tamarense[J].Advances in marine science, 2006, 24(4)504-510.[19] 陈翰林,吕颂辉,张传松, 等.2004 年东海原甲藻赤潮爆发的现场

调查和分析[J].生态科学, 2006, 25(3): 226-230.CHEN Han-lin, LU Song-hui, ZHANG Chuan-song, ZHU De-di.A Survey on the red tide of Prorocentrum donghaiense in East China Sea, 2004[J].Ecologic Science, 2006, 25(3):226-230.[20] Kuwada Y, Ohta Y.Effect of salinity on hydrogen productionand

growth of Lyngbya sp.[J].Joural of the Faculty of Applied Biological Science, 1994, 30(1): 13-18.[21] 蒋汉明, 高坤山.氮源及其浓度对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的影响[J].水生生物学报, 2004, 28(5): 545-551.JIANG Hanming, GAO Kunshan.Effects of Nitrogen sources and concentrations on the growth and fatty acid composition of phaeo-da-ctylum tricornutum[J].Acta hydrobiologica Sinica, 2004, 28(5): 545-551.[22] 欧美珊, 吕颂辉.不同无机氮源对东海原甲藻生长的影响[J].生

态科学, 2006, 25(1): 28-31.OU Meishan, LÜ Songhui.Effects of different inorganic nitrogen sources on the growth of Prorocentrum donghaiense[J].Ecology science, 2006, 25(1): 28-31.[23] 吕颂辉, 欧美珊.不同N源及N/P 对东海原甲藻生长的影响[J].