大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3的鉴定及抑菌活性产物分析

第一篇：大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3的鉴定及抑菌活性产物分析

大叶山楝拮抗内生真菌DYSJ3的鉴定及抑菌活性产物分析

摘要：从大叶山楝体内分离得到1株内生真菌DYSJ3，发现其对香蕉炭疽病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌和芒果炭疽病菌具有较强的拮抗作用，皿内抑制率分别为61.9%、57.9%、55.3%和65.9%。通过形态学观察结合ITS序列分析，初步将菌株DYSJ3鉴定为杂色曲霉（Aspergillus versicolor）。对菌株DYSJ3产生的抑菌活性物质进行了初步分析，发现菌株DYSJ3的抑菌活性物质集中于菌丝体中，其菌丝体乙酸乙酯浸提物对多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性，且热稳定性较好，100 μg/mL浸提物对香蕉炭疽病菌及苹果轮纹病菌具有明显抑制活性，抑制率分别为 72.7% 和62.0%。当浓度为1 000 μg/mL时，浸提物对香蕉炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、橡胶炭疽病菌、小麦赤霉病菌的抑制率均大于90%。

关键词：大叶山楝；内生真菌；杂色曲霉；抑菌活性

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0181-03

大叶山楝（Aphanamixis grandifolia）为楝科（Meliaceae）山楝属（Aphanamixis）植物，主要分布于广东、广西、云南、海南等低海拔至中海拔山地沟谷密林或疏林地区，是一种传统的中药。《新华本草纲要》记载大叶山楝的根及叶具有祛风除湿、舒筋活络及通痹等功效，为祛风止痛药。据文献报道，大叶山楝中主要含有倍半萜、二萜、三萜等萜类成分和甾体等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[1-3]。Zeng等从大叶山楝中分离到四环三萜、倍半萜、木脂素、苯丙素、二肽类等化合物，并选出多个具有肿瘤细胞抑制活性的单体化合物[4]；黄淼等从大叶山楝根分离得到9 个化合物，发现多个化合物对慢性髓原白血病细胞K562和人胃癌细胞SGC-7901有生长抑制活性[5]。然而，目前关于大叶山楝内生真菌的研究鲜有报道。本研究从大叶山楝体内分离出1株内生真菌DYSJ3，发现其对多种植物病原菌具有较好的拮抗活性，通过形态观察结合ITS序列分析对该菌株进行鉴定，并对其产生的抗菌活性物质进行初步分析。

1材料与方法

1.1菌株

内生真菌DYSJ3从大叶山楝中经组织表面消毒分离获得。

供试真菌：香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp.cubense）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum sp.cucumerinum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana sp.piricola）由海南大学环境与植物保护学院提供。

1.2培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL。

CM培养基：胰化蛋白胨6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3菌种活化及平板拮抗试验

将内生真菌DYSJ3及植物病原真菌接种于PDA平板上，28 ℃培养5～7 d活化待用。用5 mm打孔器在培养5～7 d的供试内生真菌、病原真菌平板的菌落边缘取菌饼，将病原真菌置于PDA平板中央，菌株DYSJ3置于平板边缘，以只接种病原真菌的PDA平板为对照，每个处理3个重复，28 ℃培养5～7 d，测量菌落半径（mm），计算抑菌率。抑菌率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100%。

1.4菌株DYSJ3鉴定

将菌株DYSJ3接种于PDA培养基上，28 ℃培养3～7 d，从第3天开始每天挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜下观察气生菌丝、分生孢子等，拍照并描述特征。

菌株基因组DNA提取采用CTAB法[6]，利用ITS通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.25 μL，dNTPs 2 μL，ITS 1 0.5 μL，ITS 4 0.5 μL，dH2O 18.25 μL，模板1 μL，总体积 25 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸 30 min。将所得产物用纯化试剂盒回收，连接到pMD18-T Vector，由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将所测序列在GenBank 中（http：//www.xiexiebang.compounds and their influence on the susceptibility towards antibiotics of two clinically relevant bacterial strains[J].Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2011，723（1）：18-25.[4]Zeng Q，Guan B，Qin J J，et al.2，3-Seco-and 3，4-seco-tirucallane triterpenoid derivatives from the stems of Aphanamixis grandifolia Blume[J].Phytochemistry，2012，80：148-155.[5]黄淼，梅文莉，蔡彩虹，等.大叶山楝根化学成分与细胞毒活性的研究[J].热带亚热带植物学报，2015，23（3）：329-333.[6]易润华，朱西儒，周而勋.简化CTAB法快速微量提取丝状真菌DNA[J].湛江海洋大学学报，2003，23（6）：72-73.[7]刘冬梅，李理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J].食品研究与开发，2006，27（3）：110-111.[8]檀根甲，祝建平.杀菌剂生物测定计算方法及应用[J].安徽农学通报，1998，4（1）：28-29.[9]董世豪，巩婷，朱平.相似蜂海绵相关真菌杂色曲霉F62活性代谢产物研究[J].菌物学报，2011，30（4）：636-643.[10]巩婷，董世豪，朱平.海洋真菌杂色曲霉F62丁内酯类化合物研究[J].菌物学报，2014，33（3）：706-712.[11]赵彩桂.山楝、棒孢拟盘多毛孢和杂色曲霉化学成分研究[D].兰州：兰州大学，2014：65-79.[12]王香粉.五花血藤和海洋真菌杂色曲霉化学成分的研究[D].保定：河北大学，2014：55-56.刘健，张德咏，张松柏，等.湖南和福建辣椒上辣椒脉斑驳病毒的检测及系统发育分析[J].江苏农业科学，2016，44（5）：184-185.