1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鉴定

第一篇：1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鉴定

1株侵染蓖麻的葡萄座腔菌菌株鉴定

摘要：从江苏盐城地区种植的蓖麻上采集分离到1株编号为YDJ08的病原菌。通过形态学观察和分子生物学研究对其进行鉴定，结果显示：在PDA培养基上，真菌菌落形态为圆形，菌落初期为白色，后转变为黑色，分生孢子呈梭形、薄壁、外壁光滑、无色；病原菌在蓖麻植株上接种后表现为木质部变黑；ITS和β-tubulin序列分析表明该菌株与GenBank中葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的序列相似性分别高达100%和99%。综合形态学和序列比对分析推断该菌株为葡萄座腔菌。这是首次报道侵染蓖麻的葡萄座腔菌，该菌株的ITS和β-tubulin序列的GenBank登录号为KJ530706、KJ530707。

关键词：蓖麻；葡萄座腔菌；侵染；ITS-rDNA；β-tubulin；序列分析

中图分类号： S432.4+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0319-04

收稿日期：2014-04-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：30971898）。

作者简介：姜晓龙（1989―），男，江苏常州人，硕士研究生，从事植物病毒和真菌病毒研究。E-mail：jiang773507166@126.com。

通信作者：陈集双，教授，博士生导师，从事植物真菌病毒、植物反应器、秸秆资源化和产业化利用等研究。E-mail：biochenjs@163.com。葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）真菌属于子囊菌（Ascomycota）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）[葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）]，是一类重要的植物病原真菌。这类真菌分布广泛，种类繁多，其寄主主要为具有经济价值的树种，如苹果树、梨树、栗子树、桉树等。葡萄座腔菌科真菌既能作为植物病原菌引起树木溃疡病，又能作为内生真菌寄生于植物组织内部，同时还能作为腐生真菌存活于某些死亡的植物组织上[1-3]。笔者从江苏盐城地区种植的疑似溃疡病的蓖麻植株上采集、分离到1株病原真菌，命名为YDJ08。基于DNA的分子生物学研究方法发展至今已经广泛应用于葡萄座腔菌属的鉴定[4-7]，本试验对该菌株进行了形态学研究和分子生物学研究。通过ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析，证实该真菌为葡萄座腔菌，为葡萄座腔菌与蓖麻的侵染关系及其可能对蓖麻种植产生的影响研究提供基础理论依据。

1材料与方法

1.1试样采集

2012年9月于江苏海洋产业研究院采集疑病蓖麻植株，置于4 ℃保存。

1.2病原真菌的分离和纯化

参考方中达的方法[8]，切取5 mm病健交界处的组织，先用75%乙醇处理15～20 s，然后用0.1% HgCl2处理15～20 s，最后用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干后，置于PDA培养基平板上，28 ℃黑暗培养5 d，用接种针挑取菌落边缘菌丝转接至新鲜的PDA培养基上，纯化后制成斜面，4 ℃ 保存。

1.3病原菌的形态学观察

取斜面保存的纯化菌转接至PDA培养基上活化培养，28 ℃ 培养15 d，观察其生长状态并拍照记录以下特征：菌落的生长速度、形状、表面和边缘特征、大小、色泽、菌落质地、颜色以及产孢能力。用插片法制片观察菌丝显微形态。如果不产孢采用诱导的方式获得孢子：取健康的马尾松针或者蓖麻秸秆，剪成5 cm的小段，灭菌。配制水琼脂培养基，待培养基凝固后，在表面放置3段松针或蓖麻秸秆，接入培养4～5 d的YDJ08菌株PDA培养物，28 ℃暗培养20 d后，置于室温下继续光照培养40 d，观察真菌子实体的形成，再挑取子实体进行镜检孢子。

1.4病原菌的致病性测定

在实验室进行盆栽蓖麻接种试验，供试品种为淄蓖5号。致病性测定采用菌丝饼接种法：将分离纯化后的真菌接种至PDA上培养7 d，用灭菌打孔器在菌落边缘取直径为 4 mm 的菌饼。用无菌刀片将蓖麻主枝刮伤，将菌饼紧贴伤口处，用蘸有无菌水的脱脂棉和塑料膜进行包裹，每天喷雾保湿。刮伤接种3株，空白的PDA培养基块对照3株。每天观察发病情况，取发病部位进行显微观察以及发病植株重新分离病原菌并鉴定。

1.5真菌的分子生物学鉴定

1.5.1真菌基因组的提取将纯化的菌丝接种于PD液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇床培养3 d。过滤收集菌丝体，冷冻干燥，通过改良的CTAB法提取真菌基因组DNA[9]，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取结果，DNA置于-20 ℃保存备用。

1.5.2真菌ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析以基因组DNA为模板，采用核糖体基因组转录通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）进行ITS序列扩增[10]，用真菌微管蛋白基因序列通用引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）进行β-tubulin基因序列扩增[11]。ITS扩增反应体系包括：超纯水37.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，20 μmol/L ITS4和ITS5引物各1 μL，模板DNA（50 ng/μL）1 μL，2.5 μmol/L dNTP 4 μL，5 U/μL rTaq DNA 聚合酶 0.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，产物4 ℃保存；β-tubulin扩增条件同ITS扩增条件。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测拍照后，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（TaKaRa）进行回收纯化，具体步骤参见使用说明书。纯化后的产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测得序列在NCBI中使用Blast在线比对分析，使用 ClustalW 进行多重比对，NJ（Neighbour-Joining）进化树构建与分析使用MEGA 5.1软件。

葡萄座腔菌引起的蓖麻病害尚未见报道，本研究从发病蓖麻植株上分离得到1株真菌，采用ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析，结合菌株的形态学特征对葡萄座腔属真菌进行了准确的鉴定，同时作了致病力测定，发现其确实会对蓖麻产生病害，最终确定此植物病原菌为葡萄座腔菌。

参考文献：

[1]Pavlic D，Slippers B，Coutinho T A，et al.Botryosphaeriaceae occurring on native Syzygium cordatum in South Africa and their potential threat to eucalyptus[J].Plant Pathology，2007，56（4）：624-636.[2]Sandra D W，Taylor J E，Kang J C，et al.An overview of the taxonomic history of Botryosphaeria，and a re-evaluation of its anamorphs based on morphology and ITS rDNA phylogeny[J].Studies in Mycology，2000（45）：29-140.[3]Slippers B，Wingfield M J.Botryosphaeriaceae as endophytes and latent pathogens of woody plants：diversity，ecology and impact[J].Fungal Biology Reviews，2007，21（2）：90-106.[4]陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（13）：3785-3786，3792.[5]余仲东，赵官成，淡静雅，等.葡萄座腔菌属ITS-nrDNA的分子系统学分析[J].菌物学报，2010，29（2）：285-293.[6]Mohali S R，Slippers B，Wingfield M J.Identification of Botryosphaeriaceae from eucalyptus，acacia and pinus in Venezuela[J].Fungal Diversity，2007，25（25）：103-125.[7]Slippers B，Smit W A，Crous P W，et al.Taxonomy，phylogeny and identification of Botryosphaeriaceae associated with pome and stone fruit trees in South Africa and other regions of the world[J].Plant Pathology，2007，56（1）：128-139.[8]方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，1998：122-145.[9]Raeder U，Broda P.Rapid preparation of DNA from filamentous fungi[J].Letters in Applied Microbiology，1985，1（1）：17-20.[10]刘春来，文景芝，杨明秀，等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子检测中的应用[J].东北农业大学学报，2007，38（1）：101-106.[11]Slippers B，Crous P W，Denman S，et al.Combined multiple gene genealogies and phenotypiccharacters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J].Mycologia，2004（96）：83-101.[12]徐成楠，周宗山，迟福梅，等.越橘葡萄座腔菌枝枯病的病原菌鉴定[J].园艺学报，2013，40（2）：231-236.[13]赵杰.ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用[J].陕西农业科学，2004（4）：35-37.[14]张星耀，骆有庆，王鸿斌.中国森林重大生物灾害[M].北京：中国林业出版社，2003：93-139.[15]钟兆康.几种杨树溃疡病的识别与防治[J].林业科技通讯，1985（6）：28-31.[16]王云飞，郭勇，朱百忍.杨树溃疡病的发病症状及防治技术[J].现代农业科技，2007（21）：83.[17]王义勋，陈京元，蔡三山，等.杨树溃疡病研究进展[J].湖北林业科技，2008（3）：39-41，50.[18]李明桃.梨轮纹病的发生规律及防治技术[J].农业灾害研究，2013，3（4）：25-28.[19]何开平，张俊伟，吴楚.梨轮纹病研究进展[J].中国植保导刊，2013，33（6）：21-25.[20]田路明，周宗山，董星光，等.梨轮纹病研究进展[J].中国果树，2013（4）：74-77.[21]Slippers B，Fourie G，Crous P W，et al.Speciation and distribution of Botryosphaeria spp.on native and introduced eucalyptus trees in Australia and South Africa[J].Studies in Mycology，2004，50：343-358.[22]Denman S，Crous P W，Groenewald J Z，et al.Circumscription of Botryosphaeria species associated with proteaceae based on morphology and DNA sequence data[J].Mycologia，2003，95（2）：294-307.孙丹，支崇远，李娅.乌江上游毕节段溶洞地下水浮游硅藻及水质分析[J].江苏农业科学，2015，43（2）：323-326.