水葫芦论文：水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物学特性

第一篇：水葫芦论文：水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物学特性

水葫芦论文：水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物学特性

【中文摘要】水葫芦(Eichhornia crassipes)的蔓延在几十个国家和地区造成了严重的环境问题,如何有效治理水葫芦受到全球范围内的广泛关注。其中,利用水葫芦致病真菌进行治理,是一种备受重视的途径。本文从福建省福州市郊区采集到被致病真菌强烈感染的水葫芦植株,从叶片上分离得到了具有强致病性的真菌菌株FJ24。在对其致病性能进行试验的基础上,对其生物学特性进行了研究。通过形态学鉴定,初步认为FJ24属于尾孢属。进一步地在分子生物学水平上,对其ITS区、EF-1区、β-Tub区、His-H3区序列进行PCR扩增,通过测序,对比Genebank中已经登录的尾孢属相应序列,构建系统发育树,分析其分类地位。结果如下:证实其在7天内能够使试验水葫芦植株达到100%的发病率,3天、7天、14天、21天、28天病情指数分别达到了23.33%、44.17%、78.33%、92.50%、100%。FJ24菌株在PDA培养基上菌落呈灰白色、边缘呈淡红色,簇状分布。菌丝大部分侵入培养基,边缘清晰。分生孢子梗单生或2~12根簇生,不分枝,浅褐色,宽度较规则、直立或略有弯曲,63.4~247.6×2.5~5.5μm。分生孢子单生,无色至浅褐色,有多个横隔,略有弯曲或无弯曲,线形、鞭型或蠕虫型,56.0~312.2×2.0~7.8μm。初步鉴定其为尾孢属。在PDA培养基上,FJ24菌株在全黑暗和光暗交替条件下生长速度较快,该菌在30°C下表现出最快生长速度,而且能长期保持,最适宜的PH条件为

中性偏碱性,在不同培养基上菌落形态存在一定差别,最适宜的培养基为MMA、MSDA、PDAY,该菌最适合利用的碳源和氮源分别为淀粉和乙酸铵。根据ITS区、EF-1区、β-Tub区、His-H3区序列的测序结果,构建系统发育树,结果表明Cercospora sp.FJ24菌株与Cercospora piaropi的多个水葫芦致病菌株存在着极高的同源性,序列相似度均达到了99%以上。生物学特性实验和分子生物学分析均表明,基本可以认为Cercospora sp.FJ24是属于Cercospora piaropi的。综上所述,本文分离得到的Cercospora sp.FJ24具有开发成为水葫芦生防制剂的潜力,同时由于该菌分离自我国本土,具有较高的安全性,因此对于水葫芦的生物防治具有一定的参考价值。

【英文摘要】Spread of Water Hyacinth(Eichhornia crassipes)caused serious environmental problems in lots of countries and regions.The importance of controlling it was recognized throughout the world.Currently, controlling Water Hyacinth with pathogens gained more and more attention.A strain FJ24, with high pathogenicity against Water Hyacinth was isolated from heavily diseased Water Hyacinth collected from Fujian province.On the basis of determining the pathogenicity of FJ24 against Water Hyacinth, biological characteristics of the strain were studied.Using morphological identification , the strain was preliminarily considered as Cercospora.The strain was further analysed at the molecular level.Four

representative sequences of Cercospora sp.FJ24 including the ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region were sequenced and blasted with other signed Cercospora species on Genbank.Phylogenetic dendrogram were constructed to analyse the taxonomic position of Cercospora sp.FJ24.The results were as follows: The diseaed ratings of Cercospora sp.FJ24 reached 100% in 7 days;the diseased indexes were 23.33%,44.17%,78.33%,92.50% and 100% after 3 days ,7 days, 14 days, 21 days and 28 days respectively.Colony of Cercospora sp.FJ24 on PDA culture was hoar and its edge was light red, growing in cluster.Hypha almost invaded into the culture with clear edge.Conidiophores of Cercospora sp.FJ24 borne singly or in fascicles of 2 to 12, were light brown, septate, width regular, straight or lightly curved and no branched , measuring 63.4 to 247.6μm long and 2.5 to 5.5μm wide.Conidia developed singly , colourless or light brown with many transverse, measured 56.0 to 312.2μm long and 2.0 to 7.8μm wide.Preliminarily identify it as Cercospora.The colony of Cercospora sp.FJ24 grew best on PDA under the dark treatment of alternation illumination and darkness while the colony growed better on PDA under all darkness.The optimum temperature for colony longtime growth was found to be 30℃.The best colony growth was obtained at the condition of neutral pH or alkalescence.The fitting carbon and nitrogen source were amylum and ammonium acetate respectively.Cercospora sp.FJ24 presented varying morphological characteristics on different media tested, and the colonies grew best on MMA, PDAY and MSDA.Four phylogenetic trees were generated from the aligned ITS region,EF-1 region,β-Tub region and His-H3 region sequences.The treeing analyses showed that Cercospora sp.FJ24 presented highly homologous with many kinds of pathogenic strain in Cercospora piaropi.And the sequence similarities were above 99%.Biological characteristics of Cercospora sp.FJ24 and phylogenetic tree analyses indicated that Cercospora sp.FJ24 could be basically identified as Cercospora piaropi.The results listed above indicated that Cercospora sp.FJ24, isolated from this study, possessed the great potential to be developed into the fungal herbicide against Water Hyacinth.This research had positive significances for the biological control of exotic plants.【关键词】水葫芦 生防菌 Cercospora piaropi FJ24 鉴定 【英文关键词】Water Hyacinth Pathogenic strain Cercospora piaropi FJ24 Identification 【目录】水葫芦生防菌Cercosporasp.FJ24的分离、鉴定与生物

学特性12-2312-15摘要5-7ABSTRACT7-9第一章 前言1.1 水葫芦的生态学特性、分布和危害1.1.1 水葫芦的生态学特性12-1

31.1.3 我国水葫芦的危害情况

1.2.1 水葫芦的物理

1.3 1.1.2 水葫芦的分布13-1414-151.2 水葫芦的防治15-21化学防治15-161.2.2 水葫芦的生物防治16-21水葫芦的综合防治2121-23材料23准备2323-2

41.4 本研究的选题依据、目的和意义

2.1 实验第二章 实验仪器、材料与方法23-342.1.1 水葫芦病样采集232.1.3 菌株来源2

32.1.2 供试植株的2.2 主要仪器设备

2.3.1 基

2.3.3 2.3 固体培养基及其制备方法24-27

2.3.2 不同pH 值固体培养基24-25础培养基24不同C、N 源固体培养基2525-27272.4 方法27-342.4.2 接种试验27

2.3.4 其它种类固体培养基2.4.1 病原真菌的分离2.4.3 柯赫氏法则（Koch’s

2.4.5 Rule）验证27-28致病性测定2828-2929

2.4.4 植物病害统计方法282.4.6 影响菌落生长的因素2.4.7 DNA 提取292.4.8 ITS 区序列扩增

2.4.10 系统发育3.1 水葫芦病原

3.1.2 2.4.9 参考基因序列扩增29-30

第三章 结果与分析34-57分析30-34真菌FJ24 的分离34-36致病症状34-35

3.1.1 病原菌的分离34

3.1.3 柯赫氏法则验证353.1.4 致病

性测定35-3636-37征36-3737-47

3.2 水葫芦病原真菌FJ24 的形态学特征

3.2.2 分生孢子形态特3.2.1 菌落形态特征363.3 影响FJ24 菌落生长的因素研究3.3.1 光照对FJ24 菌落生长的影响37

3.3.2 不同光照条件下FJ24 生长曲线的测定37-38FJ24 菌落生长的影响38-39线的测定39-4040-4141-42

3.3.3 温度对

3.3.4 不同温度下FJ24 生长曲

3.3.5 PH 对FJ24 菌落生长的影响3.3.6 不同初始PH 下FJ24 生长曲线的测定3.3.7 碳源对FJ24 菌落生长的影响42

3.3.8 不同碳源下FJ24 生长曲线的测定42-43菌落生长的影响43-44测定4444-4545-4747-5750-52列54-57

3.3.9 氮源对FJ24

3.3.10 不同氮源下FJ24 生长曲线的3.3.11 不同培养基对FJ24 菌落生长的影响3.3.12 不同培养基中FJ24 生长曲线的测定3.4 Cercospora sp.FJ24 的分子生物学鉴定3.4.1 ITS 序列47-503.4.3 β-Tub 序列52-54第四章 讨论57-62

3.4.2 EF-1 序列3.4.4 His-H3 区序4.1 关于Cercospora sp.FJ24 的鉴定574.2 关于Cercospora sp.FJ24 的生物学

4.3 Cercospora

4.4 关于特性及其对实际应用的指导意义57-59sp.FJ24 菌株作为真菌除草剂的开发前景59-60Cercospora sp.FJ24 菌株的安全性60-61草剂的开发前景61-62

4.5 水葫芦真菌除

参考文献

第五章 结论62-63

63-68附录68-70致谢70-71攻读硕士学位期间发表的论文71

第二篇：药用植物内生放线菌的分离和生物学特性

药用植物内生放线菌的分离和生物学特性

摘要:【目的】探索药用植物内生环境可培养放线菌的分离、培养方法，总结药用植物内生放线菌的生物学特

性，探讨其物种多样性，挖掘新的微生物资源。【方法】采用 10 种分离培养基对 37 个新鲜的药用植物样品

进行内生放线菌的分离;通过比较，选择适合植物内生放线菌生长的培养条件;根据菌落形态和细胞特征观 察结果，选择其中 174 株菌测定 16S rRNA 基因序列，分析药用植物内生放线菌的多样性;应用 Biolog GEN III 微孔培养、API 50CH 以及 API ZYM 试剂条测试 27 株代表菌株的生理生 化特性。【结 果】分 离 得到 940 株植物内生菌，分属于 47 个属，30 个科，其中放线菌 600 余株，分属于 34 个属，共发现潜在的新分类单元有 个;本研究中药用植物内生放线菌的培养条件是:PYG 培养基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株间的生物学特性的

差异与菌株系统进化关系呈正相关关系;不同环境植物的内生菌菌株的生物学特性差异较大，相同环境的不

同植物内生菌的生物学特性差异较小。【结论】药用植物内生放线菌物种丰富多样;药用植物内生放线菌在 唯一碳源利用、发酵碳源产酸及酶学活性等生理生化特性方面没有表现出和宿主植物的直接相关性，而是呈

现出和宿主植物的地理分布有一定的相关性。

关键词:药用植物，内生放线菌，生物学特性，多样性

中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2013)01-0015-09 药用植物有着独特的药理活性，特别是在治疗

一些疑难病症上有着不可替代的作用。如茵陈主治

黄疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治结核、气喘等，还具有抗肿瘤的作用。药用植物的有效成

分的提取和研究一直是国内的热门课题。1993 年，美国蒙大拿州立大学的 Stierle 研究小组首次从短叶

紫杉(Taxus breviforlia)中分离得到一株能合成抗癌

物 质 紫 杉 醇 的 内 生 真 菌 新 种 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并证明内生菌具有合成

与宿主植物相同或相似的活性成分的功能。由此掀

起了对药用植物内生菌研究的热潮。《微生物学通

报》编辑部的郝荣乔于 2009 年初对 2008 年的 点评中报道“植物内生菌成为我国当前微生物研究

领域的热点” ［2］

。的确，药用植物内生菌的研究和 有效开发对药用植物资源、特别是濒危植物资源的

保护具有重要的意义。

本研究选取采集自北京、贵州、云南和西藏等地 的药用植物样品 37 份，经过表面消毒处理后，应用

放线菌分离培养技术从中分离放线菌菌株;根据菌

株的 16S rRNA 基因序列信息以及系统进化关系，探讨药用植物内生放线菌的物种多样性;通过生理

生化实验测定，揭示药用植物内生放线菌的生物学 杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)进行分析，构

建表型数值分类聚类图，分析实验菌株的生物学特 性。2 结果

2.1 菌种分离结果

从 37 份药用植物中共分离、纯化得到 940 株纯

培养物(表 1)。从云南、贵州和西藏来源的植物样

品中分离得到的放线菌的比例稍高于北京的植物样

品;来源于植物根、茎、叶的菌株数量基本相当，没有

明显差异;和其它 9 种分离培养基相比较，丙酸钠分

离培养基(M7)分离得到的放线菌数量占显著优势。

表 1 药用植物内生菌分离结果统计

Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19

通过菌落形态以及菌株细胞显微形态的初步观

察结果以及菌株来源，选择 174 株代表菌株进行

16S rRNA 基 因 序 列 测 定 和 比 对，结 果 显 示，174 株

分离菌株隶属于 30 个科、47 个属，其中的放线菌 139 株，分属于 34 个属(图 1)。以菌株的16S rRNA

基因序列与 NCBI 数据库中有效描述菌种相似性 ＜

98.2% 作 为 操 作 分 类 单 元(taxanomic operational

units，OTU)的划分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表

了 7 个新的操作分类单元。

2.2 药用植物内生菌的生物学特性

为了比较研究药用植物内生放线菌的生物学特

性，选择了 27 株分离菌株进行了生长温度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源产酸以及酶学特性测试，其

中包含了 2 株药用植物内生细菌。来源于韩国菌种

保藏中心的 3 个典型培养物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T

和 KCTC 19037 T

(分离自不同土壤环境)同时 做了平行对照实验(表 2)。起初，分离菌株在对应的原始分离培养基和继

代培养基 PYG 上生长良好，但是随着传代次数的增

加，部分内生菌生长变弱，甚至无法继续传代，而 3 株来源于土壤样品的对照菌的生长状态则几乎不受

传代次数的影响。内生菌菌株的温度生长范围是

10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生长 较 好;多 数 菌 株 在

pH 6.0 － 10 范围 内 都 能 生长，在 pH 中 性 至 弱 碱 性 条件下生长最佳。

本实验中 27 株植物内生菌对碳源的利用呈现

以下趋势:菌株对二糖和多糖类的利用率最高，接下

来依次是单糖，脂类，氨基酸及衍生物。27 株植物

内生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作为

唯一碳源和能量来源:亚碲酸钾，丁酸钠，甘露醇，纤

维二糖，葡萄糖，麦芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻

糖，蔗糖，水 杨 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分类学研究 时，用 来 源于 土壤 环境 的近源

菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作为参比进行

了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 产 酸 和 API ZYM 酶学特性测定和比较分析。植物内 生 菌 I10A-

01402 以及其 它 26 株 内 生 菌 都 能 够利用 Biolog 微

孔板中葡聚糖和 D-麦芽糖，但是，来源于土壤环境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T

和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T

等 3 株类诺

卡氏菌属的菌株都不能利用这两种糖;I10A-01402

不能利用 N-乙酰类化合物，其它 26 株内生菌也都

不能或很少利用此类化合物，而这 3 株土壤来源的

菌株则全部能利用 N-乙酰类化合物作为唯一碳源

和能量来源。27 株药用植物内生菌和 3 株土壤来

源的参比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并产酸的情

况以及酶学特性上也表现出较大的差异。本实验中 株药用植物内生细菌和 28 株 放线菌 相 比较，细菌

能够更多地利用 Biolog GenⅢ中列举的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中单个碳源并产酸实验的阳性 率也高一些，但在 API ZYM 酶学特性测试结果中没 有明显差异。

16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分

生理生化特性也趋于相近。例如，草药菌属菌株

(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 药 菌 属 菌 株

(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 药 菌 属 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 杆 菌 属 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 植物样品:玉竹、黄精、知母、蒙古黄芪、肥皂

草、藿香、薄荷、金银花、仙鹤草、樱桃、大叶玉竹、白

芷、紫苏、喷瓜、金银木(橘色果实)、红色果实金银

木、虎杖、薯蓣和穿龙薯蓣等 19 份植物样品采集自

北京(编号 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黄瑞香、藏茵陈和云南重楼等 6 份采自云南(P22 － P27)，贵 州重 楼 和 三 七 采 自 贵 州(P28，P29)，绵

头雪莲(P20)、包叶雪莲(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共计 37 份药用植物样 品。

1.1.2 培养基:(1)内生菌分离培养基: 使用了 10 种分离培养基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培养基是

本实验室在红树植物内生放线菌研究中使用的 8 种

内生放线菌分离培养基 ［3］，M9 和 M10 的组成如下: M9(g / L): 柠檬酸 0.12，柠檬 酸 铁 铵 0.12，硝

酸钠 1.5，磷 酸 氢 二 钾 0.4，硫 酸 镁 0.1g，碳 酸 钙

0.05，碳酸钠 0.2，琼脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝

酸钾 0.1，海洋微量盐 微量，复合维生素 微量，琼

脂 12，pH 7.2。

(2)菌种纯化和继代培养培养基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜碱 1.25，丙酮酸 钠 1.25，复合维生素 微量，琼脂 12，pH 7.2。

1.1.3 抑制剂:抑制真菌和革兰氏阴性细菌的抑制

剂的种类和剂量参见文献［3］。

1.1.4 菌 株: 参 比 菌 株 人 参 地 类 诺 卡 氏 菌

(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韩国类

诺卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐

碱类 诺 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T

来源于韩国典型培养物保藏中心(KCTC);其它实验菌均为本研究的分离菌株。

1.1.5 主要试剂:硫 代 硫 酸 钠、次 氯 酸 钠、碳 酸 钠、萘啶酮酸、制霉菌素、重铬酸钾等化学试剂均为国产

分析纯试剂;PCR 扩增相关试剂和引物测序均来源

于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基

础培养液购于美国 BIOLOG 中国代理，API 50CH 和

ZYM 试剂条及相关试剂购于生物梅里埃公司。

1.2 菌种分离和保藏 具体方法参见文献［3］。

1.3 菌种初步鉴定和多样性分析 菌种初步鉴定参照徐丽华等主编的《放线菌系 统学》 ［4］

相关方法操作。根据菌落和菌丝形态初步 观察排除重复菌株，选择代表 性菌 株测 定 其 16S

rRNA 基 因 序 列，并 将 结 果 提 交 EzTaxon 网 站

(http:/ /www.xiexiebang.comparative studies of nucleotide sequences． Journal of Molecular Evolution，1980，16: 111-120．

［8］ Kimura M． The Neutral Theory of Molecular Evolution．

Cambridge: Cambridge University Press，1983． ［9］ Saitou N，Nei M． The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees． Molecular Biology and Evolution，1987，4: 406-425． ［10］ Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S． MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0． Molecular Biology and Evolution，2007，24: 1596-1599．

［11］ Chen HH，Li WJ，Zhang YQ，Wang D，Tang SK． Study on isolation and systematic taxonomy of strains of genus Nesterenkonia． Acta Microbiologica Sinica，2004，44(6): 811-815．(in Chinese)陈华红，李文均，张玉琴，王栋，唐蜀昆． 涅斯捷连科 氏菌属 菌 株 的 分 离 及 系 统 学 研 究． 微 生 物 学 报． 2004，44(6): 811-815．

［12］ Keswani J，Whitman WB． Relationship of 16S rRNA

sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes．

International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology，2001，51(2): 667-678． ［13］ Stackebrandt E，Ebers J． Taxonomic parameters

revisited: tarnished gold standards． Microbiol Today，2006，33，152-155． ［14］ Indananda C，Matsumoto A，Inahashi Y，Takahashi Y，Duangmal K，Thamchaipenet A． Actinophytocola oryzae gen． nov．，sp． nov．，isolated from the roots of Thai

glutinous rice plants，a new member of the family

Pseudonocardiaceae． International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology，2010，60(5): 1141-1146． ［15］ Behrendt U，Schumann P，Hamada M，Suzuki KI，Sprer C，Ulrich A． Reclassification of Leifsonia ginsengi

(Qiu et al． 2007)as Herbiconiux ginsengi gen． nov．，comb． nov． and description of Herbiconiux solani sp．

nov．，an actinobacterium associated with the

phyllosphere of Solanum tuberosum L． International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61(3):1039-1047．

［16］ Tao TS，Yue YY，Chen WX，Chen WF． Proposal of Nakamurella gen． nov． as a substitute for the bacterial genus Microsphaera Yoshimi et al． 1996 and Nakamurellaceae fam． nov． as a substitute for the illegitimate bacterial family Microsphaeraceae Rainey et al． 1997． International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54: 999-1000．

［17］ Cho KM，Hong SY，Lee SM，Kim YH，Kahng GG，Lim YP，Kim H，Yun HD． Endophytic bacterial communities in ginseng and their antifungal activity against pathogens．

Microbial Ecology，2007，54(2): 341-351． ［18］ Amann RI，Ludwig W，Scheidler KH． Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation． Microbiological Reviews，1995，59(1): 143-169．

［19］ Xu HS，Roberts N，Singleton FL，Singleton R，Attwell W，Grimes DJ，Colwell RR． Survival and viability of nonculturable Esherichia coli and Vibro cholerae in the estuarine and marine envoroment． Microbial Ecology，1982，8(4): 313-323．

杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation

conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells

of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal

plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog

GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30

families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth

of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．

Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences

were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．

［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the

endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of

carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．

Keywords: medicinal plants，endophytic actinobacteria，physiological characteristics，diversity

第三篇：猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

唐先春1, 吴 斌1*, 索绪峰2, 王大林2 ,陈焕春1, 尹争艳1

（1.华中农业大学动物病原微生物实验室, 武汉

430070）

（2.海口市美兰区罗牛山兽医站, 海南

571133）

摘要: 用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurela multocida, Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PCR检测为T+Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T+Pm的进一步鉴定，也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T+Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。关键词: 多杀性巴氏杆菌； 产毒多杀性巴氏杆菌；PCR；分型；药敏试验

中图分类号: S852.61+2

文献标识码: A

文章编号: 0366-6964(2005)0

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）是一种重要的病原，可以导致猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。产毒多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm）是猪进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)的主要病原菌。该病是养猪业的一种重要传染病，其主要表现为：慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩或由于经常打喷嚏而造成鼻出血。哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔变形、萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓、饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。育肥猪感染本病后，呼吸道的正常结构和功能遭到损害，致使机体抵抗力降低，极易感染其它病原，诸如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流

～感病毒、猪生殖—呼吸道综合征病毒等，引起猪呼吸道综合征，增加猪的死亡率 [14]。

多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A、B、D、E、F 5个血清型。研究表明，T+Pm主要是D型Pm，而且T+Pm主要分离于具有严重PAR症状的猪，从有肺炎症状猪分离的Pm一般是不产毒素的[5, 6]。

T+Pm与T-Pm在形态特征及生化反应特性上没有区别。与PAR密切相关的T+Pm产生一种约145kDa的皮肤坏死毒素（Dermonecrotic toxin, DNT），该毒素由toxA基因编码。一

～般认为T-Pm不会导致PAR，而提纯的DNT可以导致PAR的发生[79]。所以，DNT是诊断及控制PAR的关键，也是区分T+Pm与T-Pm的关键。

基于DNT的特性，已经建立了一些检测方法，以区分T+Pm与T-Pm，如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验[10]、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验[11]、ELISA[5]。但这些毒素检测方法，无论是动物试验还是细胞培养，操作繁琐，费时费力，在临床上的应用都有很大的局限性[5]。随着T+Pm毒素基因的分子生物学研究，以及近年来PCR检测方法的广泛应用，使T+Pm的检测越来越简便、灵敏和完善。材料与方法

1.1酶及主要试剂

收稿日期：2004-04-05 基金项目：国家自然科学基金项目资助（30471292）

作者简介：唐先春（1978-），男，汉，湖北十堰人，硕士，主要从事产毒素多杀性巴氏杆菌方面研究，E-mail:xianchuntang@tom.com。*通讯作者 Tel:027-87288629 Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa；生化鉴定管及药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌的分离

病料来源于海南、湖北、湖南、广东、广西、上海等十多个省市。对于有明显鼻萎缩症状的猪，鼻盘消毒后采其鼻拭子；部分病料是送检的无鼻萎缩症状的猪以及病肺，无菌采其肺组织。将采集的病料划线接种于胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）平皿，37℃培养18～24h后观察，挑取直径1～2mm、透明、光滑、湿润的菌落进行革兰氏及瑞氏染色。革兰氏染色呈红色的细小球杆菌，瑞氏染色呈两极浓染的细菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化及PCR鉴定。1.3 生化鉴定

对于纯化好的可疑菌落按使用说明做以下生化实验：葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR、VP、硝酸盐还原，并接种于麦康凯培养基。1.4 药敏试验

已纯化好的Pm，挑取单菌落接种与脑心浸液（Brain and Heart Infusion, BHI）培养基，培养14h。比浊法记数后，用BHI稀释菌液至终浓度为3.0亿/mL。用灭菌棉拭子在TSA平皿上均匀涂布，待菌液吸收后，贴药敏纸片，37℃培养16～20h,记录结果。1.5 PCR鉴定

1.5.1 本试验所用PCR引物见表1：

表1 本试验所用PCR引物

Table1 PCR primers used in this experiment 引物用途 鉴定Pm 鉴定A型Pm 鉴定B型Pm 鉴定D型Pm 鉴定E型Pm 鉴定F型Pm 鉴定T+Pm 引物编号 KMT1 KMT2 PmA1 PmA2 PmB1 PmB2 PmD1 PmD2 PmE1 PmE2 PmF1 PmF2 TA1 TA2

引物序列（5'—3'）

ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC GAT GCC AAA ATC GCA GTC AG TGT TGC CAT CAT TGT CAG TG CAT TTA TCC AAG CTC CAC C GCC CGA GAG TTT CAA TCC

TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG TCC GCA GAA AAT TAT TGA CTC GCT TGC TGC TTG ATT TTG TC TCG GAG AAC GCA GAA ATC AG TTC CGC CGT CAA TTA CTC TG CTT AGA TGA GCG ACA AGG GAA TGC CAC ACC TCT ATA G

PCR产物/bp

457 1048 758 647 512 852 864 注：以上引物参照文献[12～15]及NCBI上发布的序列设计，由上海生工合成。

Note: All these primers were designed referred to the references of 12～15 and gene sequences published on NCBI.All primers were synthesized by Shanghai Sangon.1.5.2 PCR模板 用接种环挑取单菌落，悬浮于含50µL无菌水的离心管中，100℃水浴中煮5～10min，然后迅速置于冰上冷却5min，10 000r/min离心2min，上清即为PCR模板。1.5.3 PCR反应体系（25µL）10×Taq Buffer2.5µL，25mmol/1MgCl2 0.5µL，2µmol/LdNTPs 0.5µL，20µmol/L上、下游引物各0.5µL，TaqDNA聚合酶0.5µL，无菌水10µL，模板10µL。1.5.4 PCR反应条件 94℃变性4min，然后进入30个循环：94℃30s、56℃30s、72℃40s，最后72℃延伸10min，PCR产物8℃短时保存。1.5.5 PCR结果观察 取PCR扩增反应产物10µL和5µL分子量标准，加到含EB的0.8%琼脂糖胶中，在80V电压下电泳30min，然后在紫外线灯下观察。1.6 DNT的动物试验检测

1.6.1 豚鼠皮肤坏死试验 待检菌株接种于BHI培养18h，然后12 000r/min离心10min，上清用0.2µm的滤膜过滤。滤液0.2mL注射于体重350～400g健康豚鼠的剃毛背部，观察72h。注射部位皮肤坏死区直径≥5mm为DNT阳性；＜5mm疑似，需复试；无反应或仅轻微红肿者为阴性[6, 10]。

1.6.2 小鼠致死试验 待检菌株接种于TSA培养24h，用灭菌PBS洗脱菌苔并稀释至1010cfu/mL，菌液置于冰浴中超声破碎3次，每次10s。裂解物12 000r/min离心30min，上清依次用0.45µm和0.22µm过滤，0.5mL滤液腹腔接种于20g左右的BALB/C小鼠。每株菌接种4只小鼠，72h内全部死亡者为DNT阳性，部分死亡者需复试[10]。结 果

2.1 多杀性巴氏杆菌生化鉴定

凡是麦康凯上不能生长，发酵葡萄糖、果糖、甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸盐还原试验阳性，MR、VP试验阴性者判为多杀性巴氏杆菌。结果共分离出66株多杀性巴氏杆菌，其中24株分离于肺脏，42株分离于鼻拭子。2.2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱

表2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱 Table 2 Medicine sensitivity of 66 isolates to 12 antibiotics 抗

生

素

判 定 标 准 / mm

耐 药

φ<12 φ<12 φ<10 φ<10 φ<12 φ<12 φ<10 φ<12 φ<12 φ<12 φ<12 φ<10

中

敏 12≤φ12≤φ10≤φ10≤φ12≤φ12≤φ10≤φ13≤φ12≤φ12≤φ13≤φ10≤φ

≤16 ≤16 ≤14 ≤17 ≤16 ≤16 ≤12 ≤14 ≤16 ≤16 ≤14 ≤17

高 敏 φφφφφφφφφφφφ>16 >16 >14 >17 >16 >16 >12 >14 >16 >16 >14 >17

高 敏 9(13.7%)52(78.8%)32(48.5%)59(89.4%)30(45.5%)41(62.1%)20(30.3%)35(53.0%)21(31.8%)46(69.7%)27(40.9%)19(28.8%)

试

验

结

果

中 敏 29(43.9%)9(13.6%)12(18.2%)4(6.1%)13(19.7%)13(19.7%)14(21.2%)12(18.2%)27(40.9%)12(18.2%)24(36.4%)32(48.5%)

耐 药 28(42.4%)5(7.6%)22(33.3%)3(4.5%)23(34.8%)12(18.2%)32(48.5%)19(28.8%)18(27.3%)8(12.1%)15(22.7%)15(22.7%)1 强力霉素 2 先锋霉素 3 四 环 素 4 氯 霉 素 5 氨苄青霉素 6 氟 哌 酸 7 青 霉 素 8 庆大霉素 9 痢 特 灵 10环丙沙星 11卡那霉素 12红 霉 素

2.3 多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定

在Pm分离过程中用检测Pm的引物KMT1-KMT2配合生化鉴定，结果表明凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm标准，而阴性者都不完全符合。而且我们对分出的第一株阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的7个Kmt基因序列对比，同源性都在97.6%～99.8%（测序结果略）。2.4 多杀性巴氏杆菌的PCR分型

对分离的66株Pm分别用各型的引物扩增，结果有46株为D型，18株为A型，1株为B型，1株无法定型，没有E、F型。其中46株D型有28株分离于鼻拭子，18株分离于肺脏。18株A型有14株分离于鼻拭子，4株分离于肺脏。B型1株分离于肺脏。1株未定型者分离于肺脏。2.5 产毒多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定

对分离的66株Pm用检测toxA基因的引物TA1-TA2扩增，结果有8株扩增为阳性，这8株都分离于有PAR症状猪的鼻拭子。对其中一阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的4个toxA基因全序列对比，与其中3个序列同源性100%，与另一序列同源性99.7%(658/660)，可见该引物所扩增序列相当保守（测序结果略）。

图1 PCR检测Pm、T+Pm及对A、B、D型Pm分型电泳图谱 Fig 1 The result of testing Pm, T+Pm and typing Pm of serogroup A, B, D by PCR showing on the agarose gel electrophoresis

1:多杀性巴氏杆菌(KMT1-2为引物)；2: A型多杀性巴氏杆菌(PmA1-2为引物)；3: B型多杀性巴氏杆菌(PmB1-2为引物)；4: D型多杀性巴氏杆菌(PmD1-2为引物)；5: 产毒素多杀性巴氏杆菌(TA1-2为引物)；M: DL2000

1: Pm(KMT1-2 was primers);2: Pm of serogrope A(PmA1-2);3: Pm of serogrope B(PmB1-2);4: Pm of serogrope D(PmD1-2);5: T+Pm(TA1-2);M: DL2 000

2.6 多杀性巴氏杆菌毒素的检测

对8株PCR检测为阳性的T+Pm做了豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验。豚鼠皮肤坏死试验8株全为阳性，大多数菌株坏死区直径为7～12mm，其中两株坏死区直径达到16mm，坏死区呈红紫色至黑色。小鼠致死试验有6组（6株菌）小鼠72h内全部死亡，2组在初试时4只小鼠各有1只没死，但复试时4只全死。小鼠死亡时间大多在20～48h内。讨 论

在Pm分离过程中我们采用了PCR方法，由于引物KMT1-KMT2具有很强的灵敏度及特异性，大大降低了分菌工作的难度。敏感性试验表明该引物可以检测低到103个cfu的模板量，而且用呼吸系统常见菌如：胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、链球菌及大肠杆菌做模板都不能扩出特异带型。一般在第一代平皿上挑菌做PCR，若为阳性，都能分出Pm，若为阴性很难分出Pm。而且PCR结果与生化结果完全吻合，即凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm标准，而阴性者都不完全符合，可见该引物具有很强的特异性。

药敏试验结果表明，所分离的66株Pm对氯霉素、先锋霉素、环丙沙星表现较高的敏感性。但氯霉素已禁用，临床上可首选其他两种药物。

各方面报道表明T+Pm主要是D型Pm，极少数A型Pm也产毒素，而且T+Pm主要分离于具有严重PAR的猪，从肺炎症状猪的肺脏分离的Pm一般是不产毒素的，而且多为A型[5, 6, 15]。我们对分离的66株Pm进行PCR分型，结果有69.7%(46/66)为D型，27.3%(18/66)为A型，仅1.5%(1/66)为B型，没有分出E和F型。单从来源于肺脏的Pm来看，16.7%（4/24）为A型，75%（18/24）为D型，4.2%（1/24）为B型。然而，C Pijoan报道从肺脏分离的Pm有87.5%为A型，12.5%为D型[6]。L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm75%为A型，13%为D型；从有PAR症状猪分离的Pm有29.4%为A型，70.6%为D型[15]。我们所用的分型方法与L Robert的方法相同，但结果差异较大，这可能是因为我国血清型流行与国外不同；也可能是因为我国血清流行的区域性，这还需进一步广泛分菌调查。不过单从有PAR症状的猪来看，有66.7%(28/42)为D型，这与L Robert报道的70.6%为D型接近。在PCR定型过程中，有1株Pm用引物KMT1-KMT2扩增为阳性，生化结果也完全符合Pm标准，但用5对分型引物都没有扩出特异性的带，无法定型，这可能是因为该菌株变异较大。L Robert所分离的158株Pm也有2株无法用该PCR方法定型。

据报道，目前国内畜禽流行的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型主要是A、B和D型，没有E型。猪肺疫由A、B型Pm引起，D型菌株引起AR，禽霍乱由A型Pm引起[16, 17]。苑士祥等自患AR猪分离93株Pm经间接血凝试验鉴定86株为D型（92.5%），6株为A型（6.5%），1株未定型（1%）[18]。彭发泉等报道1985-1988共分离74株Pm，有7株A型，67株D型。均为不产毒素菌株[19]。杨留战等报道从临床有萎缩性鼻炎的猪场分离到A型Pm 20株（5株T+Pm），D型85株（76株T+Pm）。产毒素菌株占总分离株的77.1%（81/105）。从临床无萎缩性鼻炎的猪场分离到A型Pm1株，D型5株（1株T+Pm）[20]。本研究与国内有关报道基本一致。

我们所分离的66株Pm只有8株为产毒素菌株，所占比例仅为12.1%(8/66)，而且这8株T+Pm均分离于有PAR症状猪的鼻拭子，均为D型。这与国外报道的T+Pm分离比例有所差异，C Pijoan报道仅从肺脏分离的Pm就有22.8%产毒素（12.8%为A型，10%为D型）[6]，L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm仅有1.8%产毒素（0.9%为A型，0.9%为D型），从有PAR症状猪分离的Pm也有52.9%为T+Pm（11.7%为A型，41.2%为D型）[13]。而我们从肺脏分离的24株Pm均不产毒素，从有PAR症状的猪所分离的T+Pm也只占19%(8/42)。看来在我国，PAR的发生更主要的也许还是环境方面因素影响。不过，杨留战等报道所分离的111株Pm有82株T+Pm（占73.9%）。他们用的是豚鼠皮肤坏死试验检测毒素，我们用的是PCR方法，综合国内外研究表明，动物试验检测毒素所得T+Pm比例都偏高，可见 PCR方法特异性更强，相信也更可靠。

豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验检测DNT结果与PCR检测toxA基因结果一致，即PCR检测为阳性的菌株，豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验也为阳性。虽然有2株T+Pm在第一次小鼠致死试验时4只小鼠各有1只没死，但在复试时攻毒小鼠全被致死。这可能与小鼠个体差异有关，也可能是这2株菌本身产毒素能力较弱。我想，PCR从基因水平检测T+Pm比动物试验更简便、灵敏，也更有说服力。而且对PCR产物测序结果表明引物TA1-TA2所扩增序列相当保守，这进一步确立了该PCR检测方法的可靠性。结 论

PAR是规模化猪场的一种重要传染病，严重影响猪群健康状况及饲料利用率。当前对该病的控制主要还是靠免疫接种和药物治疗。然而，虽然几乎所有猪场都在用萎鼻疫苗及抗生素防治，但各猪场仍时有PAR的发生，药物治疗效果也不明显。对T+Pm的分离鉴定，为该病的快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定了基础。同时，对各血清型的多杀性巴氏杆菌在我国猪场流行情况以及对药物敏感情况做了初步探讨，有利于对猪巴氏杆菌病的防治。

参考文献：

[1] 斯特劳.猪病学[M].赵德明, 张中秋, 沈建忠, 译(第8版).北京: 中国农业大学出版社, 2000.369~406.[2] 陈焕春.规模化猪场疫病控制与净化[M].北京: 中国农业出版社, 2000.260-265, 276~279.[3] 唐先春, 吴斌, 陈焕春.猪产毒素多杀性巴氏杆菌研究进展[J], 动物医学进展, 2003, 10(5): 14-17.[4] 吴斌, 陈焕春, 何启盖.应用乳胶凝集实验进行猪传染性萎缩性鼻炎血清流行病学调查[J].中国兽医科技, 2001, 31(6): 21~22.[5] Foged N T, Nielsen J P, Pederson K B.Differention of toxigenic Pasteurella multocida

from nontoxigenic isolates of Pasteurella multocida by Enzyme-linked Immunosorbent Assay[J].J Clin Microbiol, 1988, 26(7): 1419~1420.[6] Pijoan C, Lastra A, Ramorez C, et al.Isolation of toxigenic strain of Pasteurella multocida from lungs of pneumonic swine[J].JAMVA, 1984, 185(5): 533~523.[7] Nakai T, Sawata A, Masayoshi, et al.Characterization of dermonecrotic toxin produced by serotype D strains of Pasteurella multocida[J].Am J Vet Res, 1984, 45(11): 2410~2413.[8] Dominick M A, Rimler R B.Turbinate atrophy in gnotobiotic pigs intranasally inoculated with protein toxin isolated from type D Pasteurella multocida[J].Am J Vet Res, 1986, 47(7): 1532~1536.[9] Pauline M, Marten F, Vries G et al.Intranasal administration of Pasteurella multocida

toxin in a challenge-exposure model used to induce subclinical signs of atrophic rhinitis in pigs[J].Am J Vet Res, 1994, 55(1): 49~54.[10] Rutter J M.Verulence of Pasteurella multocida in atrophic rhinis of gnotobiotic pigs infected with Bordetella brochiseptica[J].Res Vet Sci, 1983, 34: 287~295.[11] Rutter J M, Luther P D.Cell culture assay for toxigenic Pasteurella multocida from atrophic rhinitis of pigs[J].Vet Rec, 1984, 114: 393~396.[12] Nagai S, Spmeno S, Yagihashi T.Differention of toxigenic Pasteurella multocida from nontoxigenic isolates of Pasteurella multocida by PCR[J].J Clin Microbiol, 1994, 32:1004~1010.[13] Robert L D, Roslyn M, Susan B, et al.Charaterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].Journal of Medical Microbiology, 2003, 52: 59-67 [14] Townsend K M, Frost A J, Lee C W, et al.Development of PCR Assays for Species-and Type-Specific Identification of Pasteurella multocida Isolates[J].J Clin Microbiol, 1998, 36(4): 1096~1100.[15] Townsend K M, Boyce J D, Chung J Y, et al.Genetic Organization of Pasteurella multocida cap Loci and Development of a Multiplex Capsular PCR Typing System[J].J Clin Microbiol, 2001, 39(3): 924~929.[16] 吴范庚, 钱心元.我国多杀性巴氏杆菌耐热抗原血清型.中国兽医杂志, 1987, 13(12): 2~4 [17] 吴范庚.我国多杀性巴氏杆菌血清学鉴定及交互免疫试验.中国兽医杂志, 1997, 23(8): 14~15 [18] 苑士祥, 张树成, 杨留战,等.自猪鼻腔分离的多杀性巴氏杆菌荚膜型鉴定.中国畜禽传染病, 1991, 5(60): 1~3.[19] 彭发泉, 苑士祥, 杨留战,等.由我国传染性萎缩性鼻炎猪群猪鼻腔分离多杀性巴氏杆菌的初步报告.中国畜禽传染病, 1991, 1(56): 4~7.[20] 杨留战, 苑士祥, 张树成,等.产毒素多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌在猪萎缩性鼻炎中的流行病学研究.中国兽医科技, 1992, 7(22): 3~5.The Isolation, Identification and Biological Characteristics Research of Swine Pasteurella multocida

TANG Xian-chun1, WU Bin1, SUO Xu-feng2, WANG Da-lin2, CHEN Huan-chun1, YIN Zheng-yan1(1.Animal Pathogenic Microorganism Lab, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)(2.Luoniushan Veterinary Station, Meilan District, Haikou 571133)

Abstract: With PCR and biochemical reaction test, sixty-six strains of Pasteurella multocida(Pm)was isolated from the lung tissues of pneumonic swine or nasal swabs of swine suffering progressive atrophic rhinitis(PAR)swine.Their medicine sensitivity was then studied.PCR assay was used to type these Pm isolates, as well as test the toxA gene.Guinea pig skin test and mouse lethal test were used to study the toxigenic pasteurella muttocida(T+Pm).The results showed that all PCR positive strains were coincident with the biochemical reaction criteria of Pm.PCR typing assay indicated that forty-six strains were serogroup D, eighteen strains were serogroup A, one strain was serogroup B and one strain was untypable.And eight strains were identified as T+Pm by PCR method.Guinea pig skin test and mouse lethal test also confirm the eight isolates were T+Pm.All the eight T+Pm strains were serogroup D, and were isolated from the swine suffering severe PAR.Key words: Pm, T+Pm, PCR, typing, medicine sensitivity

第四篇：魔芋论文：岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探

魔芋论文：岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探

【中文摘要】本文主要是对陕西省安康市岚皋县蔺河乡光明村和立新村等不同自然村魔芋软腐病与白绢病病原微生物的分离纯化,致病性测试,生物学特性的研究,运用生理生化和分子生物学方法鉴定其病原微生物。通过室内特定条件对病原菌在不同温度、不同酸碱度、不同抗生素与不同药剂等条件下的生长状况及生物学特性表现的差异性进行试验,提出防控措施。对岚皋县分离得到的魔芋软腐病病原菌的形态特征,生物学特性,致病性等进行了初步研究,结果表明导致魔芋致病的病原菌最适生长温度25-30℃,40℃以上均不能生长;它可利用葡萄糖和乳糖,不能利用麦芽糖、蔗糖和淀粉。通过致病性试验发现此病菌主要以土壤传播和伤口感染为主。通过16S rDNA序列分析,初步确定该致病菌为Pectobacterium sp.,在系统发育地位上与胡萝卜软腐果胶菌胡萝卜(Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.)关系最近,相似性为98.64%。通过对种芋的处理以及温度,酸碱度等室内条件下试验,发现在种芋的处理上,对种芋处理的时间要把握好,最多不超过1小时。软腐病原菌最适宜生长的酸碱度范围为pH 5.0～8.0之间,其它范围较不适宜,尤其以强酸区表现更为明显。魔芋软腐病原菌最适生长的温度范围为25℃～30℃之间,不适生长的温度范围为6℃以下和38℃以上区间,其中停止生长的上、下限温度各为40℃和5℃。从安康市岚皋县魔芋中分离得到白

绢病病原菌,观察其形态特征和生物学特性,考察其致病性特点,并测定其ITS序列。白绢病菌丝最适生长温度为25-35℃,pH为6-9,可利用乳糖,半乳糖,葡萄糖,甘露醇,麦芽糖等为唯一碳源;利用甲硫氨酸、尿素、硝酸钾、硫酸铵和蛋白胨为唯一氮源;由ITS序列鉴定分离自岚皋县魔芋白绢病的病原菌为半知菌亚门,丝孢纲,无孢目,小核菌属的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)。通过ITS鉴定技术,准确鉴定出引起魔芋白绢病的致病菌种类,并研究了该致病菌的生物学特性,为实际种植防治该病提供了理论依据。生物防控方法研究中,主要选用了10种抗生素做药敏实验,氨苄青霉素的效果最好,其次是青霉素,氯霉素,井冈霉素。在拮抗菌的筛选中,其中J-1的拮抗效果最明显,拮抗机理需要再深入研究,为魔芋软腐病害的生物防治提供理论。

【英文摘要】This paper is mainly for soft rot and southern blight of konjac purification of pathogens, pathogenicity tests, biological characteristics, the use of biochemical and physiological identified by molecular methods of pathogenic microorganisms in different villages such as Guangming and LixinVillage, Langao County, Ankang City, Shaanxi Province.Specific conditions of the laboratory pathogens at different temperatures, different pH, different agents such as antibiotics, and under different growth conditions and differences in biological characteristics to test the

performance of proposed control measures.The pathogenicity, morphological character and biological character of soft rot-causing bacteria, which isolated from Amorphalluskon jac growing in Langao county, Shaanxi province, were determined firstly.The results showed that the optimum temperature for these isolates were 25-30℃, but can’t grow beyond 40℃.They can utilize glucose and lactose, but not maltose or starch or maltose.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.16S rDNA sequence analysis of strains showed that they belonged to Pectobacterium sp.and were very closely related to Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.with 98.64% sequence identity.From line treatment, by species and temperature, pH and other tests under laboratory conditions, found in the handling of species of taro, taro on the kinds of processing time to grasp, no more than 1 hour.The best optimum growth of soft rot bacteria’s pH range between pH5.0 ~ 8.0, other than the appropriate range of areas, particularly in the strong acid is more obvious.This bacteria of the original optimum growth temperature range between 25℃-30℃, the temperature range of above 38℃and below 6℃is not suitable, when the temperature below 5℃or above 40℃, the bacteria

stopped growing.The southern blight-causing bacteria were isolated from Amorphalluskon jac collected in Langao county.The becteria were identified by an almost complete ITS gene sequence analysis together with the morphological and biological properties..The results showed that the optimum temperature and pH for these isolates were 25 to 35℃and pH 4-7, respectively.They can utilize glucose, lactose, maltose, galactose and mannitol as solely carbon resource, and use methionine, unrea, potassium nitrate, ammonium sulfate and peptone as solely nitrogen.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.The analysis of ITS sequences of strains showed that they belonged to Sclerotium rolfsii Sacc., Agonomycetales, Hyphomycetes and Deuteromycotina.The pathogenic bacteria that cause sclerotium rolfsii disease have been determind by the ITS sequence analysis method.The results of this experiment will provide a theoretical basis for disease prevention.Prevention and control methods in biological research, mainly used to do 10 kinds of antibiotics susceptibility test, ampicillin was the best, followed by penicillin, chloramphenicol and Jinggangmycin.Screening of antagonistic bacteria in which the

antagonistic effect of J-1 the most significant antagonistic mechanism requires further in-depth research, to provide biological control of konjac soft rot damage theory.【关键词】魔芋 软腐病 白绢病 分离鉴定 生物防控

【英文关键词】Konjac Soft rot Southern Blight Isolation and Identification Biological control 【目录】岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探摘要5-6

ABSTRACT6-7

10-11

第一章 文献综述1.2 魔芋研究进展12-15

1.3.1 魔芋软腐10-2011-121.1 引言1.3 魔芋病害研究进展

12-14病研究进展14-15

1.3.2 魔芋白绢病的研究进展

1.4 软腐病1.3.3 魔芋其他病害的研究进展

15-1816-17和白绢病综合防控措施的研究进展施措施15-1617-181.4.2 生物防控措施1.5 研究内容

1.4.1 农业防控措1.4.3 药剂防控

1.6 立题依据及研究意义18-20究20-32第二章 魔芋软腐病病原菌的分离鉴定与生物学特性研2.1 采样地概况2.2.1 主要试剂2.3 方法

2.2 材料20-2120-2121-22

2.2.2 主要培养基2.3.1 样品采集22

2.3.3 目的菌的形态

21-252.3.2 目的菌分离纯化

22-23观察与生物学特性的研究23

2.3.4 目的菌的致病性研究

23-25

2.4 结2.3.5 病原菌的16S rDNA 序列研究

果与分析25-2626-2825-302.4.1 分离株与致病性检测结果2.4.2 病原菌形态观察结果与生物学特性2.4.3 分子鉴定

28-30

2.5 讨论

30-32第三章 魔芋白绢病病原菌的分离鉴定与生物学特性研究32-4132-34测定343.1 材料与方法3.1.2 病原菌的分离与纯化

32-3634

3.1.1 采样3.1.3 致病性的3.1.4 病原菌丝体的形态观察及生物学特性测定3.1.5 病原菌的ITS 序列分析36-39

35-36

3.2 结果34-35与分析3636-39

3.2.1 病原菌分离与纯化与致病性3.2.2 病原菌形态观察与部分生物学特性3.3 讨论

3.4 结论

41-464143-4543-44参考文献致谢

39-41

第四章 魔芋软腐病生物防控研究初探41-4341-434344-4550-51544.1.1 试验材料4.2 结果与分析4.2.2 拮抗菌的抑菌率4.3 小结附录

45-46

4.1 材料与方法4.1.2 试验方法

4.2.1 分离菌4.2.3 药敏性实验46-50

缩略词作者简介

51-5353-54

第五篇：粗提技术论文：坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺与分析鉴定

粗提技术论文：坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺与分析鉴定

【中文摘要】藻红蛋白作为坛紫菜中的一种重要生理活性物质,已广泛应用到食品、轻工业、化妆和医药等行业,具有很高的经济价值。目前藻红蛋白主要是从红藻中分离提取获得,现已报道的分离纯化工艺多为破壁粗提,盐析沉淀粗分离再结合多步色谱层析纯化获得,这种工艺存在多种问题,比如细胞破碎不充分,提取效率较低、盐析沉淀操作步骤繁琐、多步柱层析成本较高等等,使得藻红蛋白生产难以工业化,高纯度藻红蛋白价格十分昂贵,极大限制了藻红蛋白的广泛应用。故本文针对坛紫菜R-藻红蛋白分离纯化存在的一系列问题,对比了多种破壁粗提技术并加以条件优化,结合两步色谱层析,建立了坛紫菜R-藻红蛋白分离纯化新工艺,为藻红蛋白大规模开发和利用提供了理论基础和科学依据。(1)坛紫菜R-藻红蛋白是胞内蛋白,破壁技术作为藻红蛋白提纯的第一步直接关系到原料的利用率和藻红蛋白的生产成本,具有十分重要的意义。故本研究比较了4种具有大规模提取应用前景的粗提技术——溶胀法、化学处理法、超声波法和搅切法对坛紫菜R-藻红蛋白的提取效果,以R-藻红蛋白提取得率、纯度和提取时间为参数,确定搅切法为最佳粗提技术,并对这种方法的物料比、搅切转速和搅切时间进行了优化,结果表明当物料比为1：...【英文摘要】As an important physiological active substance of Porphyra haitanensis, R-phycoerythrin is widespread applied

in food, cosmetics and pharmaceutical industry with a very high economic value.At present phycoerythrin is mainly separated from the red algae.There are many reports of the separation and purification about it at home and abroad.Conventional protein purification procedures involve three steps:pretreatment of the sample to allow the intracellular material to become liberated, making a crude extract...【关键词】粗提技术 离子交换色谱 凝胶过滤色谱 坛紫菜R-藻红蛋白 分离纯化

【英文关键词】Extraction and Purification Ion Exchange Chromatography Gel Filtration R-phycoerythrin Analysis 【目录】坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺与分析鉴定4-611-1212-17Abstract6-7

目录8-11

引言

摘要1 文献综述12-241.1 藻红蛋白的概论

12-13

1.1.2 藻红1.1.1 藻红蛋白与藻胆蛋白

13-15蛋白的结构与组成15-16

1.1.3 藻红蛋白的分类

16-17

1.2 藻红蛋1.1.4 藻红蛋白的理化性质白的应用17-1917-1818

1.2.1 在免疫荧光技术方面的应用1.2.2 在食品行业和精细化工方面的应用1.2.3 在医药保健药物开发方面的应用18-19

1.3.1 破壁粗提

1.4 藻红蛋白的分离纯

1.3 藻红蛋白的提取与粗分离19-2119-201.3.2 粗制方法20-21

化21-22221.4.1 吸附层析21-221.4.2 离子交换层析1.4.3 凝胶柱层析221.5 本文研究内容及技术路线22-2424-362424-252525-2729-3235-3636-553637-382 坛紫菜R-藻红蛋白的粗提技术的比较2.1 材料与方法24-25

2.1.1 材料与试剂2.1.3 细胞破碎方法2.1.2 仪器及设备242.1.4 坛紫菜R-藻红蛋白得率和纯度的计算2.2 结果与讨论25-352.2.2 化学处理法27-292.2.4 搅切法32-35

2.2.1 溶胀法

2.2.3 超声破碎法2.3 本章小结3 坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺的建立3.1 材料与方法36-383.1.2 仪器与装置36-373.2 结果与讨论38-53

3.1.1 材料与试剂3.1.3 实验方法3.2.1 离子交换介质种

3.2.3 类的选择39-40起始缓冲液pH的优化44-47化47-48

3.2.2 缓冲液种类的选择40-4242-44

3.2.4 洗脱液盐浓度的优化

3.2.6 洗脱流速的优

3.2.8 不3.2.5 上样体积的优化473.2.7 离子交换层析的放大48-49

49-50

3.2.9 凝胶过滤层析同孔径超滤膜的选择50-533.3 本章小结53-554 坛紫菜R-藻红蛋白的分

4.1.1 材料与试析鉴定55-65剂5555-58

4.1 材料与方法55-584.1.2 仪器与设备554.2 实验结果58-63

4.1.3 实验方法4.2.1 紫外可见吸收光谱

分析58-604.2.2 荧光光谱分析60-62

62-63

4.2.3 Native

结论和SDS-PAGE电泳分析与展望65-67

4.3 本章小结63-65

参考文献67-71

致谢72-73

攻读硕士学位期间发表学术论文情况71-72