水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

第一篇：水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

Molecular cloning and function analysis of the stay greengene in rice 前言

水稻持绿色突变体(stay green rice,sgr)，由新疆农业科学院梁乃亭等人通过对日本水稻“花之舞”品种的干种子经过γ射线处理后,在M2代群体中选育出的，主要表现为在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量，叶片保持可见的绿色。

对持绿基因进行定位并克隆，此后可将该基因导入蔬菜、烟草、花草、树木等植物，培育永绿色蔬菜、观赏性花草树木新品种。

但要与绿色超级稻的概念相区别。绿色超级稻：由中国科学院院士、华中农业大学生命科学技术学院院长张启发教授提出的水稻新概念，即水稻基本不打农药、少施化肥、节水抗旱的水稻。

持绿突变体的类型：功能型突变体（A型：衰老开始较晚，以正常速率结束；B型：衰老开始正常但结束相对缓慢）；非功能型突变体（C型：由于霜冻或干旱，持绿最终导致叶片死亡。D型：由于对叶绿素降解机制不起作用，叶绿素可以无限期的存在，衰老过程与野生型相同；E型：保持很高的叶绿素含量，光合作用不增加。）水稻持绿基因的分子克隆 2.1 分离持绿色突变体

图1籽粒灌浆期后 图2 黑暗条件下

持绿色表现型在F1群体中不表达，在回交F2群体中野生型与持绿型出现3：1的分离比，表明持绿色突变是由单个隐性核基因控制。

突变体净光合速率（Pn）相对于野生型没有明显的提高,光化学效率(Fv/Fm)没有明显的改变。

SGR突变阻碍了叶绿素降解,使叶片呈现出持绿色表型,但在植物衰老过程中不能维持其光合效率。因此它属于非功能C型突变体。

2.2 克隆持绿基因

在1880株F2突变群体中通过图位克隆和DNA序列分析（STS)精确定位，突变基因是位于水稻第九个基因的长臂上,是一个单核苷酸突变（A251突变为G251）（如下图）。

2.3 SGR过表达载体转基因植株

为了研究SGR转录是怎样影响叶片衰老，利用花椰菜花叶病毒35S为启动子把SGR转入到野生型水稻中，形成两个独立的转基因家系。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

GUS基因（又称报告基因）的组织化学法检测即具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。SGR的过表达可以通过此法看出表达情况。（筛选重组子）如下左图

由半定量RT-PCR（逆转录酶PCR）分析可测定叶片中目的基因SGR的表达量增加或减少。(表达的量)如上右图

水稻持绿基因功能分析 3.1 SGR的表达和调控

通过Rt-PCR表达结果分析表明：SGR不仅可以在叶子中存在，也存在于萌发的种子和根中。如下图

在营养液中分别培养离体叶片，结果如图所示，野生型水稻中，ABA加速了叶绿体分解，促进叶片黄化；而6-BA抑制叶绿体分解，延缓叶片黄化。而在突变体中ABA、6-BA影响不是很明显。如下图

由下图可以看出：在野生型和突变体暗诱导衰老过程中SGR和PaO都处于上调状态。在ABA的作用下，增加了它们的上调程度，而6-BA减少了上调的程度。

通过Western Blot(蛋白质印迹)分析表明：水稻叶片中SGR蛋白水平随着SGR表达的增加而增加。经ABA处理后SGR蛋白表现出明显的增加，而6-BA处理后SGR蛋白比正常生长叶片中SGR蛋白更少。

3.2 叶绿体色素的变化

在正常的光照下水稻野生型和突变体的Chl,Carotenoids,Chla/b没有明显不同而SGR过表达载体转基因植株的叶片Chl相对于野生型低30%,而Chla/b高10%；

在黑暗条件下，野生型和突变体的叶绿素总含量分别下降了80%、90%，Chl a/ b也明显下降，而突变体保留了75%的Chl，Chl a/b也增加了。

3.3 蛋白质的变化

在黑暗条件下，野生型和突变体中可溶性蛋白(主要为Rubisco)和膜蛋白（主要为捕光蛋白）都在下降，但突变体较野生型更稳定。

但在突变体中可溶性蛋白明显下降也解释了突变体在衰老过程中不能保持光合作用的原因。

结论

4.1 SGR突变在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量,叶片保持可见的绿色。但突变体净光合作用速率（Pn）、光化学效率(Fv/Fm)相对于野生型没有明显的提高。因此,水稻持绿色突变体属于非功能C型永绿色突变体。

4.2 SGR的表达受脱落酸（ABA）促进，但被6-BA(一种细胞分裂素)抑制。

4.3 SGR突变能够在叶片衰老过程中阻滞叶绿体内类囊体解体、叶绿素降解和部分蛋白质的降解。随着sgr转录的增加也提高了水稻叶绿体的破坏。4.4 在水稻中叶绿素降解需要一系列叶绿素降解酶的作用。在叶片衰老过程中,突变体具有较高的Chla/Chlb值，SGR可能参与PaO活性的调控。

第二篇：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

附件2

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

and GH3-8)resulted in decrease of rice fertility.This result suggested that auxin plays a critical role in regulating flower development.The detection of the auxin distribution in panicle development showed that auxin is affinitive relation with panicle development.The transgenic plants with repressed expression of OsDR8 showed reduced resistance or susceptibility to Xanthomonas oryzae pv.oryzae and Magnaporthe grisea causing bacterial blight and blast, respectively.The putative product of OsDR8 was highly homologous to an enzyme involved in the biosynthesis of the thiazole precursor of thiamine.Exogenous application of thiamine could complement the compromised defense of the OsDR8-silenced plants.The expression level of several defense-responsive genes including the earlier functional genes of defense transduction pathway, OsPOX and OsPAL, and the downstream genes of the pathway, OsPR1a, OsPR1b, OsPR4, OsPR5 and OsPR10, was also decreased in the OsDR8-silenced plants.These results suggest that the impact of OsDR8 on disease resistance in rice may be through the regulation of expression of other defense-responsive genes and the site of OsDR8 function is on the upstream of the signal transduction pathway.In addition, the accumulation of thiamine may be essential for bacterial blight resistance and blast resistance.We found a mutant with lesion mimics on the leaves through selecting a T-DNA insertional rice pool.The inserted T-DNA was inserted into the open reading frame(ORF)of a gene named OsDR9.The predicted encoding product of OsDR9 consists of 180 amino acids that is an unknown functional protein.OsDR9 had very low expression level in the stem and young panicle but higher level in seedling, flag leaf, sheath and callus;no OsDR9 expression was detected in the root.In addition, OsDR9 had higher expression level in old leaf than young leaf.The mutant was highly resistance to Magnaporthe grisea causing fungal blast disease and bipolaris oryzae causing Cochliobolus miyabeanus disease in field.Histochemical detection and DNA fragmentation of the leaves developed lesion mimics showed that the cell death had the same features of apoptosis.In addition, the expression of pathogenesis related(PR)proteins genes PR4 and PR8 as well as a blast resistance related gene AOS2 was upregulated in the mutant.The mutant also accumulated autofluorescent materials, salicylic acid and phytoalexins(both momilactone A and sakuranetin).The mutant contained elevated levels of superoxide and H2O2.A 10.5-kb fragment harboring the OsDR9 gene from rice variety Nipponbare was transferred into the mutant.Lesion mimic phenotype was disappeared in the transgenic plants, indicating that knockout of OsDR9 by T-DNA insertion caused the lesion mimic mutant phenotype.These results suggest that OsDR9 is a negative regulator in rice disease resistance and apoptosis.Key words: Oryza sativa;bacterial blight;fungal blast;auxin;salicylic acid(SA);jasmonic acid(JA);basal resistance;development;expansin;GH3;thiamine;lesion mimic mutant(LMM);apoptosis;phytoalexin;reactive oxygen species(ROS)

第三篇：大豆热激转录因子基因GmHsfA1的克隆、结构分析及功能鉴定

大豆热激转录因子基因GmHsfA1的克隆、结构分析及功能鉴定

热激转录因子(heat shock transcription factor, HSF)在调节植物对逆境胁迫(特别是热胁迫)应答和相关基因表达方面起重要作用。我们采用生物信息学和比较基因组学方法结合RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术，从大豆基因组中克隆到一个热激转录因子基因GmHsfA1，其cDNA全长1781bp，编码一段由510个氨基酸组成的多肽(accession number:AY458843)。序列比对和结构分析显示，GmHSFA1与番茄热激转录因子LpHSFA1之间的同源性最高，二者间的氨基酸序列相似性达到52.46%。GmHSFA1包含4个重要功能域，即DNA结合域DBD（DNA binding domain）、寡聚域OD（oligmerization domain）、核定位信号NLS（nuclear location signal）和C端激活域CTAD（C-terminal activation domain）。

通过定量PCR和RT-PCR分析显示，GmHsfA1在大豆不同组织和不同发育时期都有稳定表达（组成型表达模式），高温和高盐诱导能加强其表达，而NAA、GA和ABA等外源激素处理可降低其表达。遗传转化和Northern杂交结果表明，在常温(28℃)下，转基因大豆植株中GmHsfA1的表达量比非转基因对照植株明显增加，而在高温(45℃)诱导下，含有35S-GmHsfA1的转基因植株的热激蛋白基因(GmHSP70)表达量比非转基因植株高出8倍以上。热诱导实验表明，转基因植株的耐热温度高达52℃，比非转基因植株（仅耐42℃）提高了10℃。这说明GmHSFA1具有激活或上调GmHSP70基因表达的功能，其过量表达能够明显增强转基因大豆的耐热能力，而且还具有一定的耐旱能力。上述结果证明GmHSFA1是一个新的、有功能的大豆热激转录因子，对于研究耐逆相关基因的调控机理和培育耐逆性强的基因工程大豆等作物新品种具有重要意义。

关键词： 大豆 热激转录因子 基因克隆 遗传转化 过量表达 耐热性