PCR_引物或者产物的磷酸化反应和平端连接的经验

第一篇：PCR_引物或者产物的磷酸化反应和平端连接的经验

T4 多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase)该酶能够催化磷酸在ATP的γ-位和寡核苷酸链（双链或单链DNA或RNA）的5'-羟基末端的磷酸化，以便进行连接反应。

它的缓冲液为:70 mM Tris-HCl(pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT,在液中加入终浓度为1 mM的ATP，37°C温育1 小时。

该酶在新鲜缓冲液中表现最适酶活力（在旧缓冲液中，由于DTT氧化而造成的实际DTT含量减少会降低酶活力）。

要提高5'平滑末端或5'凹陷末端的磷酸化效率，可在加T4多聚核苷酸激酶前，先将DNA溶液于70°C加热5分钟，然后冰上冷却，或者加入5%(W/V)的PEG-8,000。由于T4多聚核苷酸激酶可被铵离子所抑制，所以磷酸化步骤前，DNA不要在含铵离子的溶液中沉淀。

热失活条件: 65°C 加热20分钟。

平末端连接构建载体的一些个人经验-2006/08/20 21:331、载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。

2、载体务必去磷酸化处理(许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP(点击进入产品页面)

3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶(如PFU)，必须磷酸化5'末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏(请参考T4PNK(点击进入产品介绍)。普通Taq酶PCR以后可以补平再做连接，但是仍然需要磷酸化，当然如果是PCR以后再酶切成平端那和普通酶切片段是一样的。

4、按照分子克隆第三版介绍，如果线性化载体时所用的内切酶在插入片段序列内没有位点，酶切和连接可以在一个反应体系内同时完成(相关内容请查阅分子克隆III)，但是我的实验证明这个方法效率并不高。我建议采用下面方法：酶切载体->分离片段->CIP->插入片段磷酸化->纯化片段->按照正常连接反应，体系内加入线性化载体所用内切酶，按照酶切1/10浓度加入。这样基本上可以完全阻断载体自连接(因为凡是载体自连都将被酶切再次线性化，而插入片段形成新质粒则不会被酶切)，提高连接效率。

5、连接酶用量也要适当增加，建议用高浓度连接酶T4 DNA ligase(点击连接产品页面)，不要用快速连接方法。

6、连接体系是否加入PEG，好象没有显著差别，另外PEG分子量也没有特殊要求，PEG4000到PEG8000都曾经出现在公司药合里面。

------------PCR 引物或者产物的磷酸化反应：

Primer(oligo 5-10 pmol/ul, use 2-4 ul in PCR mix)or PCR product-------40ul T4 PNK Buffer----------6ul T4 PNK-------------------3ul(30U)0.1M ATP-------------0.6ul H2O-------------------10.4ul 37度30min 连接效率我还真是不太懂，而且离开具体的实验条件谈连接效率我觉得 也没有多大意义，因为最终的转化子数和期望重组子比例受太多因素影响，（质粒自连反应的影响因素较少，倒是可以以此为实验模型讨论）而不仅仅是连接温度和时间。不过还望stone网友给出有出处的定义。对于连接反应，实验条件早有定论。一般都是采用公司产品目录

上的推荐条件，37C时 T4DNA连接酶的活性一般最高.但因为粘端的互补 氢键结合容易因分子热运动脱开。所以折衷为16C 反应，还有人建议用 PCR仪作连接，低温粘端退火，然后高温连接（没有实验数据，但还讲 得出道理）。

平端连接的推荐温度是22C，分子克隆为20C，酶量要加大100倍，反应 液中加入PEG和六氯高钴合氨等可以刺激连接。

至于反应时间，一般是16小时，不过也有公司产品目录上说2－3小时。因此，我的体会是如果做常规克隆，如Phdlifei网友所言，只要其他 的操作没问题的话，连接条件可以比较随意。我一般就是粘端室温

2-3h，平端22C 16小时。如果结果不好的话，应该是其他操作造成的。TA克隆更偏向于粘端连接, 生工的产品目录上的反应条件就是16C 2小时 到过夜。

“PCR产物和载体进行连接时都需要磷酸化吗？” 如果载体没有经过去磷酸化处理，PCR产物就没必要磷酸化。一般PCR产物克隆到T载体，显然我们不会对T载体去磷酸化处理，所以就不需要磷酸化处理。“如果PCR产物和载体都是经过双酶切的应该就不用磷酸化了吧？” PCR产物和载体都是经过双酶切后，都有磷酸基了，不需要再磷酸化。“如果是PCR产物直接与T载体进行连接需要磷酸化吗？” 如上，载体有磷酸基，“载体去磷酸化什么情况要做呢？”

为了减少载体的自连，采用去磷酸化。比如单切后克隆片段，一般载体去磷酸化可以减少假阳性。还有用高保真酶扩增的片段与平末端酶切的载体（如用EcoRV)的链接，为了减少自连载体一般去磷酸化，那么扩增的片段就要磷酸化。我们一般合成的引物两端都是0H基，这种情况就要磷酸化，或要求生物技术公司在合成引物时引物磷酸化，价格有点高，02年大概要300RMB,现在的行情不太清楚。