中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点

第一篇：中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点

《 中 药 制 剂 分 析 》 课 程 论 文

中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则及 其在《中国药典》(2015年版 中的应用

药学(药物分析方向 2012级 指导教师:高晓霞 2015 年 11月

摘要:中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题,鉴于传统基原鉴定、性 状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性,为保证中药材临床应用安全、准确、有效, 有必要增加中药材 DNA 条形码分子鉴定法。如今分子生物学技术在中药材鉴定领域的应用已 逐步深入。《中国药典》 2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的 DNA 分子鉴 定方法,而《中国药典》 2015年版收载了“中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则” , DNA 条形码分子鉴定法是利用公认的相对较短的 DNA 序列来进行物种假定的一种分子生物学技 术, 是传统形态鉴别方法的有效补充。这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国 家标准的应用层面。

关键词:中药材;DNA;鉴定;指导原则

一、中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 [1] 1.1定义及原理

该鉴定方法主要适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片 及基原物种的鉴 定。DNA 条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的 DNA 序列来进行物种鉴 定的一种分子生物学技术, 是传统形态鉴别方法的有效补充。由于 DNA 序列是由腺嘌呤(A、鸟嘌呤(G、胞嘧啶(C、胸腺嘧啶(T 4种碱基以不同顺序排列组成,因此一定长度 DNA 序列能够区分不同物种。

中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行 DNA 条形码分子鉴定研 究, 建立以 ITS2为核心, psbA-trnH 为辅的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系和以 COI 为主、ITS2为辅的动物类药材 DNA 条形码鉴定体系。

1.2方法与步骤

中药材 DNA 条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA 提取、PCR 扩增、测序、序列 拼接及结果判定,以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。

1.2.1 供试品处理 除特殊标明外, 药材使用 75%乙醇擦洗表面后晾干, 称取 10~100 Mg 2+备用。

1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎细胞壁、释放 DNA , DNA 的分离和纯化, DNA 的浓 缩、沉淀与洗涤等基本步骤, 目前常用试剂盒法, 包括植物基因组 DNA 提取试剂盒和动物组 织 /细胞基因组 DNA 提取试剂盒。

由于植物类中药材种类繁多, 可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进。植 物细胞内含有大量次生代谢产物,如多糖、多酚等,这些物质在提取 DNA 的过程中与 DNA 共沉淀, 形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变, 严重影响 DNA 提取的产量与质量, 以及后

续的 PCR 扩增实验。EDTA(乙二胺四乙酸螯合 Mg 2+2+或 Mn 2+,抑制 DNase(DNA 酶活性;CTAB(十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子表面活性剂,可溶解细胞膜, 与 DNA 形成复合 物溶于高盐溶液, 降低溶液盐浓度至一定程度, 则从溶液中沉淀, 经离心即可将 CTAB 与 DNA 复合物同蛋白质、多糖类物质分开。三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl(pH 8.0提供一个 缓冲环境,防止 DNA 被破坏。β-巯基乙醇是抗氧化剂,在提取 DNA 过程中加入 β-巯基乙 醇,可以抑制氧化反应,避免褐化。PVP(聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成 一种不溶的络合物质, 有效去除多酚, 减少 DNA 提取过程中多酚的污染;同时它也能和多糖 结合,有效去除多糖。因此将 PVP 和 β-巯基乙醇配合使用,能够有效地防止 DNA 提取过程 中多酚及多糖的污染。

在提取根、根茎、茎木类、皮类的 DNA 时,一定要注意多糖、多酚的去除;提取叶、花、全 草的 DNA 时要适当增加水浴时间, 并可将水浴温度降低;对于果实、种子类以及动物药材类 的 DNA 提取可以参考《中国药典》。

1.2.3 PCR 扩增 植物类中药材及其基原物种扩增 ITS2或 psbA-trnH 序列,动物类中药 材及其基原物种扩增 COI 序列,通用引物及扩增条件如下,具体如有改变见各药材项下。ITS2序列扩增正向引物 ITS2F :5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′;反向引物 ITS3R : 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH 序列扩增正向引物 psbAF : 5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′;反向引物 trnHR :5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI 序列扩增正向引物 HCO2198:5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′;反向引物 LCO1490: 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。

PCR 反应体系以 25 μL 为参照, 包括 1× PCR 缓冲液(不含 Mg 2+Cl 2 , 2.0 mmol·L-1Mg 2+Cl 2, 0.2 mmol·L-1 dNTPs,0.1 mmol·L-1引物对,模板 DNA , 1.0 U Taq DNA聚合酶,加灭菌双 蒸水至 25 μL。设置未加模板 DNA 的 PCR 反应为阴性对照。

ITS2序列扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s , 56 ℃ 30 s , 72 ℃ 45 s , 40个循环;72 ℃ 10 min。psbA-trnH 序列扩增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min , 55 ℃ 1 min , 72 ℃ 1.5 min , 30个循环;72 ℃ 7 min。COI 序列扩增程序:94 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min , 45 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1.5 min, 5个循环;94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1 min, 35个 循环;72 ℃ 5 min。

1.2.4 PCR 产物检测 采取琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR 产物。电泳后, PCR 产物应在相 应的 DNA 条形码序列长度位置出现一条目的条带,阴性对照应无条带。

1.2.5 测序 有 PCR 扩增条带的样品送测序公司进行 DNA 序列测定。使用 DNA 测序仪对

目的条带进行双向测序, PCR 扩增引物作为测序引物,测序原理同 Sanger 测序法。

1.2.6 中药材 DNA 条形码序列获得 主要包括序列拼接和序列质量与方向 2个方面的内 容。对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接, 去除引物区,获得相应的 DNA 序列。为确 保 DNA 条形码序列的可靠性, 需对测序质量进行评估, 去除测序结果两端的低质量序列。序 列方向应与 PCR 扩增正向引物方向一致。

1.2.7 结果判定 将获得的序列在中药材 DNA 条形码鉴定系统(http : //www.xiexiebang.com/。2011年,中国植物条形码工作组(Chinese Plant BOL Group 对来自 42目 75科 141属 1 757物种的 6 286样本的 rbcL , matK , psbA-trnH , ITS 序列进行研究, 其结果进一步验证了 ITS2的鉴定能力, 建议 ITS/ITS2应成为种子植物的核 心条形码,当 ITS 难以扩增和测序时, ITS2可以有效地弥补该缺陷 [5]。陈士林等 [6]提出建立 以 ITS2为核心、psbA-trnH 为补充序列的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系。

1.4.2动物类中药材 COI 和 ITS2条形码的选择依据 在动物界, Herbert 等于 2003年首 次提出将一段长度约为 650 bp的 COI 基因序列作为动物条形码鉴定的基础片段 [7]。同年, Herbert 等 [8]对 11门 13 320个物种的线粒体细胞色素 c 氧化酶亚基 I(cytochrome c oxidase subunit I , COI基因序列进行比较分析,结果表明所研究物种的种间遗传距离在 0.0%~

53.7%，物种种间遗传距离平均可达到 11.3%，79%的物种种间遗传距离均大于 8%。以上研究 结果进一步支撑了前期的结论。随后，COI 基因特定片段的鉴定能力在鸟类、鱼类、节肢动 物、哺乳动物等具体动物类群的鉴定研究中均获得了印证，因此研究者一致建议将 COI 序列 作为动物的通用条形码。基于大量前期研究结果，中药材 DNA 条形码分子鉴定法选用 ITS2 和 psbA-trnH 作为植 物类药材的核心条形码，COI 和 ITS2 作为动物类中药材的核心条形码。1.5 中药材 DNA 提取方法的确定 1.5.1 植物基因组 DNA 提取方法的确定依据 植物基因组 DNA 提取方法较多，常用基于 CTAB 原理的试剂盒法和改良的 CTAB 法。应用不同公司植物基因组 DNA 提取试剂盒等提取 中药材基因组 DNA，结果表明试剂盒法适用于中药材基因组 DNA 的提取。由于中药材所含成 分复杂，可针对不同入药部位改进 DNA 提取试剂盒方法 [10] [9]。针对根及根茎、花、果实、种子和皮类等药材质地，确定各自合适的样品量。通过对 2 373 份药材样品的 DNA 提取实验，叶类、花类药材取样量约 10～20 Mg，根类、果实类、种 子类、皮类药材约 20～40 Mg。某些药材需要增加样品量，如沉香药材 DNA 提取时取样量 为 80 Mg。因此，通过对大量样品 DNA 提取的研究，确定中药材 DNA 条形码鉴定法取样量 为 10～100 Mg。通过对不同入药部位实验不同水浴时间梯度（20，30，40，50，60 min，3 h 及水浴过 夜），发现叶类药材水浴时间一般在 20～40 min，根类药材在 60 min～3 h，一些质地坚硬 的药材可 56 ℃水浴过夜。1.5.2 动物类药材 DNA 提取方法的确定依据 动物基因组 DNA 的提取采用血液/细胞、组 织基因组 DNA 提取试剂盒。采用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞、组织基因组 DNA 提取试剂盒（基于 SDS 法原理）提取动物药材的 DNA，结果表明试剂盒法适用于动物基 因组 DNA 的提取，根据动物药材药用部位的不同（肌肉、角甲、壳类），选用不用的 DNA 提 取试剂盒。动物类药材 DNA 提取前，应针对不同取样部位对样品进行不同的前期处理。肌肉类动物 药材需进行紫外杀菌处理并充分捣碎；骨甲类药材由于 DNA 含量稍少，应适量增加取样量，并充分研磨粉碎； 含有脂类较多的动物内脏器官可先用不含蛋白酶 K 和 SDS 的缓冲液浸泡药 材，并试剂盒消化缓冲液中适量增加 SDS，以利于脱去脂类；分泌物类动物药材（如胆汁），在消化前同样需进行必要的处理。如干蛇胆用双蒸水浸泡 6 h，其间更换水数次，使

其软化 并洗去表面污染物；乙醇浸泡蛇胆，用流水浸泡 1 d，以除去乙醇及表面污染物 [11] 2+ 2+ 2+ 2+。目前多

选用试剂盒法提取 DNA，方法相对简洁、易控，而且在大多数动物药材中都获得了较为理想 的结果。1.6 确定可靠的 DNA 条形码鉴定数据库 DNA 条形码数据库的可靠性是中药材 DNA 条形码鉴定的关键。目前已有的公共数据库，如 GenBank，EMBL 等，由世界各地的研究者进行独立提交，缺乏相互之间的验证，数据质量 参差不齐，中药材 DNA 序列数据的系统性和代表性尚显不足。为保证中药材 DNA 条形码数据库的可靠性，首先需要在基原上保证物种鉴定的可靠性，然后采用严格的序列校对机制确保获得序列和基原样品的一致性，最后规范管理数据库，确 保数据库的安全维护和有序增减。二．中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则在《中国药典》（2015 年版）中的应用 2.1 蕲蛇饮片的鉴别（聚合酶链式反应法）2.1.1 模板 DNA 提取 取本品 0.5g，置乳钵中，加液氮适量，充分研磨使成粉末，取 O.lg，置 1.5ml 离心管中，加人消化液 275m1[细胞核裂解液 200μ l,0.5mol/L 乙二胺四醋酸二钠 溶液 50ml，蛋白酶 K(20mg/ml20μ l，RNA 酶溶液 5μ l]，在 55°C 水浴保温 1 小时，加人 裂解缓冲液 250μ 1，混匀，加到 D N A 纯化柱中，离心（转速为每分钟 10000 转）3 分钟； 弃去过滤液，加入洗脱液 8OOμ l[5mol/l 醋酸钾溶液 26μ l, 1mol/LTris-盐酸溶液（pH7.518ml,0.5mol/L 乙二胺四醋酸二钠溶液(pH8.030，无水乙醇 480μ 1，灭菌双蒸水 273μ l]，离心（转速为每分钟 10000 转）1 分钟； 弃去过滤液，用上述洗脱液反复洗脱 3 次，每次离心（转速为每分钟 10000 转）1 分钟;弃去过滤液，再离心 2 分钟，将 DN A 纯化柱转 移人另一离心管中，加入无菌双蒸水 100μ l，室温放置 2 分钟后，离心（转速为每分钟 10 000 转）2 分钟，取上清液，作为供试品溶液，置零下 20°C 保存备用。另取蕲蛇对照药材 0.5g，同法制成对照药材模板 DNA 溶液.2.1.2 PCR 反应鉴别 引物：5' GGCAATTCACTACACAGCCAA-CACAACT 3’,和 5' CCATA GTCAGGTGGTTAGTGATAC 3’。PCR 反应体系：在 200μ l 离心管中进行，反应总体积为 25m1，反应体系包括 10*PCR 缓冲液 2.5μ l，dNTP(2.5mmol/L2μ 1，鉴别引物（10μ mol/L各 0.5μ 1，高保真 TaqDNA 聚合酶(5U/μ 10.2μ 1，模板 0.5 士无菌双蒸水 18.8μ 1。将离心管 置 PCR 仪，PCR 反应参数： 95°C 预变性 5 分钟，循环反应 3 0 次(95°C30 秒，63°C45 秒），延伸（72°C5 分钟。2.1.3 电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法方法 2(通则 0541，胶浓度为 1 %，胶中加入核 酸凝胶染色剂 GelRed;供试品与对照药材 PCR 反应溶液的上样量分别为 8μ 1，DNA 分子量标

记上样量为 2μ l(0.5μ g/μ l。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检 视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在 300〜400bp 应 有单一 D N A 条带。2.2 川贝母药材的鉴别（聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法）2.2.1 模板 D N A 提取取本品 0.lg,依次用 75 %乙醉 1ml、灭菌超纯水 1ml 淸洗，吸干表 面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取 20mg,置 1.5ml 离心管中，用新型广谱植物基因组 D N A 快速提取试剂盒提取 DNA [加人缓冲液 API 400μ 1 和 RNA 酶溶液（10mg/ml4μ l,涡漩振荡，65°C 水浴加热 10 分钟，加入缓冲液 AP2 130μ 1，充分混匀，冰浴冷却 5 分钟，离心（转 速为每分钟 14000 转）1 0 分钟；吸取上淸液转移入另一离心管中，加人 1.5 倍体积的缓冲 液 A P 3 / E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟 13000 转）1 分钟，弃去过滤液，加入漂洗液 700μ 1，离心（转速为每分钟 12000 转）30 秒，弃去过滤液;再加入溧洗液 500 μ 1，离心（转速为每分钟 12000 转30 秒，弃去过滤液;再离心（转速为每分钟 13000 转）2 分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入 50μ 1 洗脱缓冲液，室温放置 3〜5 分钟，离心(转速为每分钟 12000 转）1 分钟，将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置 2 分钟，离心（转速为每分钟 12000 转）1 分钟],取洗脱液，作为供试品溶液，置 4°C 冰箱中备用。另 取川贝母对照药材 O.lg，同法制成对照药材模板 DNA 溶液。2.2.2 PCR-RFLP 反应 鉴别引物：5' CGTAACAAGGTTT-CCGTAGGTGAA 3 ’和 5’ GCTA CGTTCTTCATCGAT 3 '。PCR 反应体系：在 200μ 1 离心管中进行，反应总体积为 30μ 1，反 应体系包括 10* P C R 缓冲液 3μ 1，二氧化镁（25mmol/L2.4μ l, dNTP(10mmol/L0.6μ l,鉴别引物（30μ mol/L各 0.5μ l，髙保真 Taq DAN 聚合酶（5U/μ l0.2μ l,模板 1μ l，无菌超纯水 21.8m1。将离心管置 PCR 仪，P C R 反应参数：95°C 预变性 4 分钟，循环反 应 3 0 次（95°C 3 0 秒，5 5〜58°C3 0 秒，72°C 3 0 秒），72℃延伸 5 分钟。取 PCR 反 应液，置 500μ l 离心管中，进行酶切反应，反应总体积为 20μ l，反应体系包括 10*酶切缓 冲液 2μ 1,PCR 反应液 6μ l，SmaI(10U/μ 10.5μ l，无菌超纯水 11.5μ l，酶切反应在 30° C 水浴反应 2 小时。另取无菌超纯水，同法上述 P C R-R F L P 反应操作，作为空白对照。2.2.3 电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法（通则 0541，胶浓度为 1.5 %，胶中加入核酸凝 胶染色剂 GelRed;供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为 8μ 1 ,DNA 分子量标记上 样量为 lμ l(0.5μ g/μ l。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在 100〜250bp 应有两 条 DNA 条带，空白对照无条带。

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