散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析开题报告

第一篇：散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析开题报告

散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析

一、选题依据

1、论文题目及研究领域

论文题目：散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析。

研究领域：林木病理学。

2、论文研究的理论意义和应用价值

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病，该病害对整个林业生态工程建设、产业化发展造成了严重影响，该研究主要为林木病害的防治和对散斑壳属病菌的进一步研究、利用提供理论依据。

3、目前研究的概况和发展趋势

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病害，寄主包括多种松树，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落叶松Larix等属22个种3个变种和1个栽培变种[1]。该病害从幼树到大树均可侵染，在幼树龄中严重发病时，引起松叶提前脱落，引向树木生长，甚至导致树木死亡，曹成严重的经济损失，这类病在我国也普遍发生，且历史悠久，但长期以来该病害只是被当作一般性的也部病害来对待，没有受到应有的重视，也少有深入细致的研究[2]。但从70年代才有了较系统的研究，目前对该病的研究已有160多年的历史。它隶属于子囊菌亚门Ascomycotina ,盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]。散斑壳属是1826年正式建立的，现已成为斑痣盘菌科中的第一大属，全球共有103余种被报道[4]。该病在Minter(1981)记载松树上有散斑壳l6个种，其中Lophodermium Seditiosum 引起二、三针松落针病。我国曾记载引起樟子松落针病的病原菌为橙针散斑壳茸Lophodervnium pinas，何秉章(1985)报道了在大兴安岭引起樟子松苗木落针病病原菌为扰乱散斑壳菌I ．seditiosum，其无性阶段为Leptostroma rostrupil，同时对该病的症状、侵染循环、流行规律进行了研究，筛选出以7j 百菌清可湿性粉剂防治效果最好[5]。至目前为止，其无性阶段是否有侵染作用在国内外还没有一致结论，尚有待进一步研究。1981年，Minter对松树上的散斑壳(LD D，mim Chev．)进行了较系统的分类研究，共承认16个种。近年Minter＆Sharma(1982)、Cannon＆Minter(1986)分别报道了库曼散斑壳(L．kumaunicum Minter＆M．P．Sharma)和喜马拉雅散斑壳(Lhimalayense P．F．Cannon＆Minter)。在我国戴芳澜(1979)、何秉章等(1985，l986),林英任、唐燕平(1988)、曹支敏等(1990)先后记载国内松树上有松针散斑壳(L．pinas sri(Schrad．)Chev)、大散斑壳(L．maximum B．Z．He et Yang)、安徽散斑壳(L．anhuiense Y，R．Lin)和L．toolitori s Minter等14个种。我国对散斑壳属的分类研究始于80年代，陆续发表9个新种11个新记录，使我国散斑壳属的种数达到21个。到目前为止．国外共报道18个种。目前对该病的研究已经发展到分子生水平上[4]。

二、论文研究的内容

1、论文重点解决的问题

1.1散斑壳属真菌的培养及DNA提取

1.2散斑壳属不同种RDNA基因ITS区PCR扩增片断的克隆 1.3克隆片断的DNA序列测定及分析

2、论文拟开展以下四个方面的内容 2.1 散斑壳属的分类、致病性、生活史

2.2 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增

2.3 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增片断的克隆 2.4 克隆片断的DNA序列测定及分析

3、论文拟得出的主要结论

获得出不同种散斑壳属RDNA基因ITS区的PCR扩增片断克隆的序列并构建系统发育树。

三、论文拟采用的研究方法

1、实验材料及仪器 1.1 实验菌株

散斑壳属的不同菌株由四川农业大学都江堰分校资源与环境系微生物实验室保存。1.2实验药品和试剂 1.2.1 常规药品和化学试剂 液氮、提取液（100mMTris-Hcl、PH9.0，40mMEDTA，PH8.0），缓冲液A(SDS-EB，PH8.0)缓冲液B(8MKOAc，PH4.2)，3M NaAc，10%SDS，TE(10m MTris-Hcl，1mMEDTA，ph8.0)，5×TBE缓冲液（Tris-硼酸，0.5MEDTA，PH8.0）饱和酚（PH8.0）异丙醇70%的乙醇等。1.2.2 培养基

PDA液体培养基：称马铃薯400g，去皮切成小块，煮沸30分钟，用纱布过滤，加葡萄糖40g，用蒸馏水定容到2000ml，调PH7.0。

LB液体培基：Trypton(OXOID)1g YeastExtract(OXOID)0.5g NaCl1g，加双蒸水40ml，调PH值至7.0，定容到100ml。121℃ 高压蒸汽灭菌20min。1.2.3分子生物学试剂

真菌通用引物、TaqplusDNA SacI HindIII RNAase 酶，IPTG（异丙基硫代—B—D半乳糖）X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D半乳糖苷）DNTP UItraPure质粒DNA小量提取试剂盒 小量胶回收试剂盒 连接试剂盒，氨苄青霉素 DNA分子标准DL2000 琼脂糖。1.3主要设备仪器

Eppendorf5804R冷冻离心机、Eppendorf Authorized Thermal cycler PCR仪、DYY-12型三恒多用电泳仪、BIO-RAD凝胶成像系统、G-560E涡旋混合仪、H.HS11-2型电热恒温水浴锅、HZQ-F型全温震荡培养相、微量移液器等。2实验方法

2.1散斑壳属真菌细胞总DNA的提取 2.1.1不同种散斑壳菌的获得

在超静工作台中将PDA斜面上已经培养好的不同种散斑壳的菌丝体刮下，接种于PDA的液体培养基中，在25下培养一周左右，离心收集菌丝体。2.1.2用改良二次沉淀法提取DNA 离心收集菌丝体，用灭菌双蒸水冲洗2-3次，尽量吸干水分。将菌丝体转移到冷冻过的研钵里，加液氮2-3次研磨成粉，将菌丝体迅速移入20mL离心管内，加入10mLBufferA(0.2％SDS—EB，pH 8.0)，在涡旋混合器上振荡混匀，静止至室温。将混合液置于65～68℃ 水浴20min，然后在室温下10000 r／min离15min。取上清液移至另一离心管，加入0.5mLBuferB(8mol／L KOAC，pH4.2)，混匀后冰浴45 min，然后4℃下10000r／min离心20 min。取上清液移至另一离心管，加入等体积的室温异丙醇，小心颠倒混合均匀。可以看到沉淀出现。在室温下10000r／min离心2 min。让其自然干燥后溶于50ulTE中，长期保存于一20℃冰箱中,备用。

2.2散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增 2.2.1 扩增引物

采用真菌通用引物ITS1和ITS4，起序列如下： ITS1（5-3）：TCCGTAGGTGAACCTGCGG（19bp）ITS4（5-3）：TCCTCCGCTTATTGATATGC（20bp）2.2.2 PCR扩增的反应体系：

试剂 加样量 工作浓度

DNA模板 1.0ul 约500ng DNTP 1.0 ul 20uM ITS1 1.0 ul 0.4uM ITS4 1.0 ul 0.4uM Taqplus酶 0.5 ul 2.5uM 10×baffer 5.0 ul 超纯水 38.5 ul 反应总体积 50.0 ul 反应混合物加28ul的矿物油覆盖。

2.2.3 PCR扩增的反应循环

95℃ 预变性3min 95℃变性1min 55℃退1min 72℃ 延伸1 min 72℃延伸3min 4℃保存（30个循环）2.2.4 PCR产物电泳检测

PCR反应结束后，尽量吸除矿物油，取5反应液做1.2%琼脂糖电泳检测分析。

2.3 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增片断的克隆 2.3.1 PCR扩增DNA片断纯化和回收 采用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒，按使用说明对PCR扩增产物进行纯化。具体步骤如下: 1)样品用琼脂糖凝胶电泳后，在紫外投射仪上用刀片小心的割下含目的DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5ML离心管中。

2)按照每100mg琼脂糖加入300uLS;液(溶胶液)的比例加入S1液，置55℃水 浴7min，使其完全溶化，每2min颠倒混匀一次。

3)将溶化后的琼脂糖溶液移入吸附柱，离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

4)在吸附柱中加入500UlW1液(洗涤液)，离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，离心I min，再用W1，液重复洗涤一次，离心I min。5)将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入3011LT,洗 脱)液，静置I min后，离心I min，离心后管中的液体即为回收的DNA溶液。2.3.2 JM109载体菌感受态细胞的制备。

采用氯化钙法制备新鲜的JM109大肠杆菌感受态细胞。从平板上挑取新活化的大肠杆菌菌落，转入10mlLB培养基中37℃振荡培养16-18hr;按1-2%接种量转至50mlLB中37℃振荡培养3hr至OD=0.6;冰浴10 min，使培养物冷却至O℃，转入10mL离心管中;4 0C , 4000转离心IOmin;弃去上清，以l OmL冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀，冰上放置15-30 min;40C, 4000转离心l Omin;弃去上清，每50tnL初始培养物用2mL冰预冷的0.1 moUL CaCl:重悬细胞沉淀;分装成200 u L的小份，4℃可保存数天(或加终浓度为15%的甘油一80℃保存)。

2.3.3 回收的DNA片段与PUCM-T载体的连接

连接反应体系：

纯化回收后的PCR产物4.5ul pUCM一T载体0.5 ul Solution 5.0 ul Total Volume 10 ul。

将上述试剂冰浴加入0.5ml的EP管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接4小时。

2.3.4 重组质粒的转入JM109感受态细胞 从-80取出200ul感受态细胞，室温下解冻，解冻后立即置于冰片上，加入重组质粒10 轻轻摇匀，冰上放置30min，42℃ 水浴热击90S，不要动试管，快速转移至冰浴1-2min，向管中加入800LB培养液，混匀后37℃震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长，将上述菌液摇匀后取200涂布于Amp抗性LB平板（X-gal/IPTG）上，正面向上放30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置，37℃培养过夜。

2.3.5 阳性克隆的筛选和鉴定

目的片断定向插入PUCm-T载体多克隆位点，使位于多克隆位点区编码B-半乳糖苷酶氨基端的一个片断失活，在含有IPTG、X—Gal、AMP的LB培养基上，阳性克隆菌株将形成白色菌落，而未转入PUCm-T载体质粒和转化入PUCm-T载体质粒但不含有插入片断的阴性克隆菌株将形成蓝色菌落。

用无菌牙签从含氨苄青霉素并涂布有IPTG和X—Gal的LB培养基平板上筛选白色菌落，转入10ml AMP的LB培养液中，在37下震荡培养过夜。2.3.6

阳性克隆菌株的酶切鉴定 1)质粒的提取

采用UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒。

(1)将3-5mL培养过夜的含高拷贝质粒的菌液13, 000rpm离心I min，收集沉淀；

(2)倒掉上清，把沉淀完全悬浮于250ul悬浮液(溶液1)中;(3)加入250ul裂解液(溶液II)，室温下轻轻摇匀，放置5分钟;(4)加入350ul中和液(溶液111),室温下轻轻混匀3分钟;(5)13000 rpm离心l Omin，将上清液转入一个新的1.5mL离心管中，(6)加入0.8mL纯化树脂(使用前摇匀)，混匀3分钟:取0.8mL混合液盛于离心纯化柱中，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;(7)再取剩下的混合液盛于离心纯化柱中，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;加入600ul80%异丙醇(或乙醇)，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;(8)重复上述第七步骤两次，最后一次13000rpm离心3分钟，尽量将异丙醇(或乙醇)去除干净;（9）取出离心纯化柱，将其套入一个千净的1.5mL离心管中，加入50ulTL于纯化树脂上，不能粘在管壁上。室温下放置5min.13OOOrpm离心lmin;(10)离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取2UL电泳检。

酶切体系：

10×M Buffer 1.0 ul HindⅢ(10U／L)0.5 ul SacI(10U／L)0.5 ul 质粒DNA5.0 ul 用双蒸水补足至10 ul,混匀，37℃保温过夜。将10止酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶上80V电泳45min，于凝胶成像系统中检测并拍照。2.4 克隆片段的DNA测序测定及分析

将经PCR鉴定和酶切鉴定为阳性克隆的白色菌落做成穿刺管，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行可隆片段的DNA序列测定。

2.5 拟采用的论文技术路线或设计参数技术路线：采用二次改良沉淀法提取散斑壳属的总DNA进行PCR、并回收产物与pUCM一T载体进行连接转入到JM109感受态细胞中，经过筛选进行酶切鉴定、测序、分析。3 论文进度计划

时间 内容 完成情况 2006年9月—2006年10月初 从专业书刊、图书馆、互联网等

媒体收集并整理资料，确定论文题目。已完成 2006年10月中——2006年10底 试验前的准备 已完成 2006年10月——2007年1月 试验 进行 2007年2月——2007年3月 试验分析 待完成 2007年4月——2007年5月 论文撰写 待完成

四、文献综述（附后页）

散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析

摘要：本文以松落针病病原菌散斑壳为对象，采用二次改良沉淀法，获得散斑壳菌基因组的DNA。采用真菌通用引物ITS1和ITS4，对这些散斑壳菌的rRNA基因ITS区进行PCR扩增，并回收产物，然后将PCR扩增产物定向克隆到pUCm-T质粒的多克隆区，并转化到大肠杆菌JM109载体菌中，筛选获得阳性克隆菌株，对阳性克隆质粒中的外源DNA片段进行序列测定，并作出分析。关键词: 散斑壳菌 ITS区 PCR 克隆 序列测定

1.引言

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病，该病害对整个林业生态工程建设、产业化发展造成了严重影响，寄主包括多种松树，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落叶松Larix等属22个种3个变种和1个栽培变种[1]。该病害从幼树到大树均可侵染，在幼树龄中严重发病时，引起松叶提前脱落，引向树木生长，甚至导致树木死亡，曹成严重的经济损失，这类病在我国也普遍发生，且历史悠久，但长期以来该病害只是被当作一般性的也部病害来对待，没有受到应有的重视，也少有深入细致的研究[2]。但从70年代才有了较系统的研究，目前对该病的研究已有160多年的历史。它隶属于子囊菌亚门Ascomycotina ,盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]。散斑壳属是1826年正式建立的，现已成为斑痣盘菌科中的第一大属，全球共有103余种被报道[4]。该病在Minter(1981)记载松树上有散斑壳l6个种

2． 散斑壳属真菌的分类和研究状况

2.1 散斑壳属的分类和研究概况

散斑壳属真菌是菌物资源中的重要组成部分，属于子囊菌亚门Ascomycotina盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌目Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]，这个属是由Chevallie于1826年建立的。它们广泛分布于世界的大部分温带和热带地区，寄主除针叶树外，还包括被子植物及蕨类植物，它们中的相当一部分为植物病原真菌，其引起病害通常为漆斑病或黑痣病，也可细分为枝枯病，叶斑病、梢枯病、果斑病等[5]，Darker(1932, 1967)承认21个种[6]。Minter(1981)在前人研究的基础上，对松树上的散斑壳进行了详细的分类研究，根据子囊果的外部形态以及在子囊果中点作横切片时在寄主组织内埋藏的深度，盾状壳开裂区唇细胞的有无和着色深浅，分生抱子器的有无和大小以在基物中的埋藏深度，针叶上横线纹的有无、颜色和宽度以及生态特征进行分种，共承认16个种[7]，随后Minter等人(1982)和Cannon等人又发表2个新种。我国对该病的研究始于20世纪20年代。朱凤美1927年首次报道我国湖北马尾松上由松针散斑壳L.pinastri引起的落针病[4]。此后对我国多种松树上发现的散斑壳菌都沿用这一种名。直到80年代由于病原菌的分类研究取得突破性进展，从而促进了病理学的深入研究，并取得一系列的新进展，其中最大的特点是新种不断被发现，新记录迅速增加。直至目前，陆续发表了21个新种14个新记录[4]。

2.2 散斑壳属真菌的致病性

在国内处许多关于散斑壳属真菌研究的文献中,存在着许多矛盾和分歧,其中最突出的是对该属真菌致病性的看法不同.陈守常、彭旭东、张锡津[8]经过调查研究后认为川东地区华山松落针枯死与病原真菌的侵染无关，而低温是其枯死的主要因素菜。而对于散斑壳属中的松针散斑壳，Hanso和Reindi将这种真菌看作是引起松树落针病的主要病原。面Boyce则认为此菌是弱寄生物或无害的腐生物[9]。林英任[10]经过多年的调查研究后发现，松针散斑壳在由不良因子或其他真菌致死的针叶上腐生的现象确实存在，然而在大多数情况下该菌能危害2、3年生针叶，有时也能侵染球果和长势较差的幼龄针叶。另外，松针散斑壳分布范围甚广，危害树种亦多。因此他认为：松针散斑壳寄生性和致病性的存在无可非议，是松落针病的主要病原。

2.3 散班壳菌的生活史 散斑壳属真菌引起的松落针病是一类比较复杂的病害。由于病原菌种类的不同，寄主松树的生物学特性和各地区自然生态环境等方面的差异，使得不同地区，不同松枝发生的落针病在病原、流行规律有方面均不尽相同[4]。林英任[11]经过研究认为，在安徽、江苏等地的26种（包括22个种、3个变种、1个栽培变种）松树上至少存在散斑壳属病原菌7种，其中松针散斑壳L.pinastri(Schrad)Chev为优势种，可侵染18种不同的松树。主要为害幼、中龄松树的2、3年生针叶，有时也能为害老球果或1年生针叶，严重时造成针叶大量死并脱落，树木长势衰退。何秉章、邓兴林、杨殿清等[11]研究认为，引起大兴安岭樟子松落针病的病原菌为扰乱散斑壳菌L.seditiosum Minter,Stalay et Miller。1年生苗木受害后并不死亡，影响茎、高生长，2、3年生苗木因连年得病受害，病情逐渐加重，生长衰弱以致枯死。原戈、贾云、齐乐贤等等研究认为，引起辽宁东部山区人工红松林落针病的病原菌为大散斑壳L.maximum He et Yang。染病的红松针叶于每年4月中旬、下旬开始显露症状，5月中旬开始落叶，5月下旬至6月上旬为落叶盛期，枝梢光秃。在通常情况下，散斑壳病菌以菌丝或子囊果在松针上越冬，次年春季在松针上产生大量的分生孢子器和子囊果。在阴雨天或潮湿的条件下，子囊果和分生孢子器（部分种缺）吸水膨胀而张开，溢出乳白色的内含物，即子囊孢子和分生孢子，它们借雨滴反溅作用和气流传播。孢子萌发产生的芽管由气孔侵入，也可由微伤侵入。潜育期一个月左右，繁殖期2-4个月。每年6-8月释放子囊孢子，以7月的放散是最多。分生孢子于5-9月放散，但以6-7月的放散量最多[12]。

2.4 散斑壳真菌的分离培养

国外早在上世纪70年代开始就对散斑壳司真菌进行了分离培养的研究，并认为所得到的不同培养类型是由于种内遗传变异所导致

[13]

。刘应高等]对云南

[14松针上的4种散斑壳——L.sichuanense,L.conigenum,l.pinatei,L.indianum进行了单孢分离，获得了各个菌株的培养类型。Johnson[15]在1988年的研究中认为小散斑壳可以在琼脂培养基上形成有形态。许早时[16]对来自国内的21种散斑壳按照组织分离法获得了7株培养物，并筛选了其最适生长培养基，认为MA培养基最适宜于该类菌物的营养生长以及有利于产生分生孢子器和分生孢子，所有菌种在培养60天后均不产生子囊果。

3． 核酸序列分析在真菌系统学中的应用

3.1 rRNA基因ITS区序列分析在真菌系统学中的应用

真菌核酸分子水平的研究, 集中在对基因组DNA 和RNA。基因组DNA 是指有机体在单倍体状态下的DNA 全部含量。广义的基因组也指某一体系(如核或细胞器)中的DNA , 它包括编码或细胞中固有的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(m tDNA)、tRNA 基因及其它RNA 编码。同时也包含了一些非编码基因, 如信号序列、间隔序列(内含子基因)、无功能序列(假基因)。真菌的这些基因在结构、功能和变异程度上差别很大, 是真菌在分子各级水平上研究的良好区段。rDNA 是基因组DNA 中的中等重复、并有转录活性的基因家族(gene fam ily), 重复次数在103～ 105。在不同种类真菌中, 由于rDNA 不转录内含子的存在, rDNA 在染色体上的拷贝数不同, 但相差不大[17、18、19 ]。rDNA 一般由转录区和非转录区构成, 转录区包括5S, 5.8S, 17～18S, 25～ 28S rDNA 基因, 这些基因由两个内转录间隔区(in ternal t ran scribed space, ITS)分开。转录区编码rDNA 前体, 在转录后被加工形成5S, 5.8S, 17～ 18S, 25～ 28S rDNA , 其余RNA 在成熟过程中被降解。此外在18S rDNA 基因上游还有外转录间隔区(ex ternalt ran scrib led space, ETS)。ITS 和ETS 包含有rDNA 前体加工的信息。非转录区又称基因间隔区(in tergen ic space, IGS), 它将相邻的两个重复单位隔开, 在转录时有启动和识别作用。它实质上包含ETS 区。广义上把ITS 区和非转录区统称为基因间隔区(IGR: in ternal generegion, 有的又简称IGS)。比较特殊的是ETS 常出现在RNA 前体上, 他在重复块中的位置受5S 位置的影响。在不同真菌种中, 5S 的转录方向不同, 也会导致IGS 的区域的不同[20]。在进化速率上, 编码区比较保守, 可在属、科、目水平上用于不同生物种的比较, 在其中的高度保守区, 所有的异源基因几乎都能与之强烈杂交。18S 和28S rDNA 基因的3p端是高度保守的, 即使在原核与真核生物之间也能建立位点同源性。其中, 18S 比28S 基因更保守, 5.8S基因比18S 基因进化稍快些。18S 和28S rDNA 基因是在系统发育中, 种级以上阶元的良好标记。真菌核糖体基因及间隔区有不同的进化程度，有的序列比较保守，有的序列进化较快，因此可以根据他们的序列，将真菌鉴定到属及属以下种、亚种、变种、甚至菌株的水平[21，22，23]。

核糖体不同序列分类等级表

核糖体序列 适合分类水平5 S rDNA 科（family）及科类以上 5.8S rDNA 属genus）18S rDNA 属、种（species）28S rDNA 属、种、变种(variety)ITS 种、亚种（sister species）、变种、菌株 IGS 种、变种、菌株

利用通用引物对rRNA基因的ITS区段进行PCR扩增并进行序列分析目前已经广泛用于真菌的分类鉴定。ITS区之所以成为系统与进化研究中的重要分子标记，主要是因为：作为18S-28S rDNA的一个组成部分（如图1）[24]，它在核基因组中是高度重复的，通过不等交换和基因交换，这些重复单位间可以发生位点内或位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或一致，这为PCR拉增产物的测序奠定了理论基础；而且ITS区的序列较短又非常保守，因此可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR拉增和测序。目前研究中广泛使用的引物是Wihteetal.（1990）设计并通用于真核生物。4.结束语

参考文献

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