宽阔水自然保护区3种类型土壤的真菌多样性

第一篇：宽阔水自然保护区3种类型土壤的真菌多样性

宽阔水自然保护区3种类型土壤的真菌多样性

摘要：利用稀释平板法和基于ITS rDNA基因序列的分析方法对宽阔水自然保护区3种类型的土壤进行真菌的分离鉴定，共分离得到353株真菌，归为34个不同的属。对土壤真菌多样性进行评估，结果表明：紫色土真菌优势属为酵母菌属（Saccharomyces），黄棕壤真菌优势属为酵母菌属（Saccharomyces）和被孢霉属（Mortierella），黄壤真菌优势属为青霉属（Penicillium）和木霉属（Trichoderma）。土壤真菌Margalef丰富度指数（R）最高的是黄壤，最低的是黄棕壤；Shannon-Wiener多样性指数（H′）最高的是紫色土；Pielou均匀度指数（J）黄棕壤最高；Jaccard相似性指数（Cj）为0444 ～0.536，表明3种类型土壤的真菌多样性均具有一定差异。

关键词：宽阔水；土壤真菌；多样性

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0458-03

收稿日期：2015-11-22

基金项目：国家科技基础性工作专项（编号：2014FY120100）。

作者简介：黄依蓝（1992―），女，硕士研究生，主要从事土壤真菌资源研究。E-mail：ylhuang77@163.com。

通信作者：周礼红，博士，副教授，主要从事微生物应用方向的研究。E-mail：lhzhou33@126.com。宽阔水自然保护区位于贵州省遵义市绥阳县境内，总面积26 231 km2，海拔在650～1 762 m之间，地形切割强烈，除中南部以中低山谷地为主的侵蚀地貌外，保护区东、西部及北部多为典型的喀斯特地貌。宽阔水保护区的森林植被主体为亮叶水青冈林与常绿阔叶树种构成落叶常绿阔叶混交林，林下土壤发育良好，具有较丰富的腐殖质积累[1]。由于特殊的气候及地质土壤条件，宽阔水自然保护区为森林野生动植物及微生物的生长繁育提供了有利的栖息场所，形成了复杂多样的生境类型。与动植物的分布类似，微生物的分布是确定性（环境）和随机性（扩散）的共同结果。由于微生物个体较小，可以通过孢子抵御长距离传播中的不良环境，在适宜条件下以多种繁殖方式存活下来，这种巨大的分散潜力和对小环境的敏感性，是微生物群落结构与大型生物群落结构之间的区别。土壤真菌作为微生物群落结构中的一个重要组成部分，其多样性程度与土壤肥力和生态状况密切相关，同时生态系统的物质循环及环境变化，也直接影响到真菌物种多样性和空间分布情况[2-4]。

本研究采用传统分离方法对宽阔水自然保护区3种不同土壤的真菌多样性进行调查，结合微生物多样性的分析方法，对该地区真菌菌群的基本特征、空间分布状况和物种多样性进行调查，为进一步揭示微生物和环境之间的关系奠定基础。

1材料与方法

1.1材料和试剂

土样采自宽阔水自然保护区。马丁氏培养基、马铃薯琼脂培养基、沙氏培养基均按标准方法配制，所用试剂为国产分析纯。真菌基因组DNA提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1土样采集选取宽阔水自然保护区内的红沙地、花生地、太阳山、煤场湾、天鹅湖、珙桐沟和一线天7个区域，GPS记录采集地的地理位置，采集地环境描述（表1）。采用对角线型路线多点采集腐殖质层土壤样品于灭菌袋中，进行编号，4 ℃保存。

1.2.2土壤真菌的分离及纯化分离培养基为马丁氏琼脂培养基、改良沙氏孟加拉红培养基和马铃薯孟加拉红培养基，均在使用前加入链霉素，使培养基中含链霉素30 μg/mL。

用稀释涂布法分离土壤真菌。称取10 g土壤于90 mL含少量玻璃珠的无菌水中，充分振荡混匀，按10倍稀释法稀释到1×10-3，取400 μL菌悬液于培养基上，均匀涂布，28 ℃培养5 d，进行菌落计数。

1.2.3ITS序列分子鉴定

1.2.3.1真菌基因组DNA的提取基因组DNA提取按照试剂盒操作说明书进行。

1.2.3.2ITS序列的PCR扩增（1）引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。（2）PCR反应体系：扩增反应体系为25 μ（L表2）。配制完成后，充分混匀，稍加离心使体系在PCR管底部，再置于PCR仪上进行扩增。（3）PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3.3PCR扩增产物的检测反应结束后，分别取3 μL PCR产物和DNA marker点于1% 琼脂糖凝胶的点样孔中进行电泳，结束后使用凝胶成像系统进行观察，若条带单一且明亮清晰则表明扩增成功，样品可用于进一步测序。

1.2.4序列测定与分析方法

1.2.4.1测序PCR产物经纯化后用全自动DNA测序仪进行测序，获得ITS序列。

1.2.4.2序列及真菌种群分布分析将已测定的序列在表1土壤采集地环境描述

采集地纬度（N）经度（E）海拔（m）土壤类型土壤pH值生境类型红沙地28°13′10″107°9′17″1 486 ～ 1 510紫色土5.5灌木丛花生地28°13′26″107°9′43″1 503 ～ 1 517黄棕壤6.0竹林地太阳山28°14′9″107°9′37″1 592 ～ 1 722黄棕壤6.0方竹煤场湾28°13′56″107°9′42″1 555 ～ 1 579黄壤6.5灌木丛天鹅湖28°13′45″107°9′43″1 515 ～1 524黄壤7.0灌木丛珙桐沟28°13′59″107°10′1″1 582 ～ 1 629黄壤6.5灌木丛一线天28°14′11″107°11′12″1 411 ～ 1 455黄壤6.5灌木丛

表2PCR反应体系组分

反应组分体积（μL）引物ITS1 1引物ITS4 1模板 22×PCR Master Mix12dd H2O 9

GenBank上使用Blast（basic local alignment search tool，Blast 2.2.31）进行序列比对分析、鉴定。

1.2.5真菌多样性分析方法采用物种个体数量（N）、物种数（S）、种群优势度（d）、Margalef丰富度指数（R）、Shannon-Wiener的多样性指数（H′）、Pielou均匀度指数（J）和Jaccard相似性指数（Cj）对宽阔水保护区不同土壤真菌群落多样性进行分析[5-7]。

种群优势度：di=Ni/N；

Margalef丰富度指数：R =（S-1）/lnN。

Shannon-Wiener多样性指数：H′ =-∑PilnPi（i=1，2，3，…，n）；

Pielou均匀度指数：J =H′/lnS。

式中，Pi=di，表示第i种个体数占总个体数的比例。

Jaccard相似性指数：Cj = c/（a+b+c）。

式中，a和b分别为2种生境地中真菌的种数或属数，c为2种生境地中共有的真菌种数或属数。Jaccard相似性系数（Cj）用于比较2个生境中真菌种类组成的相似程度，根据其原理：当Cj为0.00～紫色土>黄棕壤，物种数（属数）N为紫色土>黄壤>黄棕壤，Margalef丰富度指数R黄壤>紫色土>黄棕壤，Shannon-Wiener多样性指数H′紫色土>黄壤>黄棕壤，Pielou均匀度指数J黄棕壤>黄壤>紫色土。紫色土和黄棕壤的Jaccard相似性指数Cj为0.536，中等相似；紫色土和黄壤Cj为0.500，中等相似，黄棕壤和黄壤Cj为0.444，中等不相似。

3讨论

本研究采用种群优势度、丰富度指数、多样性指数、均匀度和相似度指数，对宽阔水自然保护区3种不同土壤的真菌群落多样性进行了分析。结果表明，从群落组成来看，各类土壤的优势种属、常见种属和稀有种属均有较大差异，其中有一些属为其相应土壤所特有。宽阔水自然保护区土壤中大量存土壤类型S（N）RH′J紫色土26（127）5.160 82.775 60.851 9黄棕壤17（90）3.555 72.468 20.871 2黄壤22（136）4.274 72.676 10.865 8

在的酵母菌属（Saccharomyces）、木霉属（Trichoderma）、被孢霉属（Mortierella）、拟青霉属（Paecilomyces）、绿僵菌属（Metarhizium）、黏帚霉属（Gliocladium）等，具有较高的利用价值和应用前景，可作为农林病害防治和可持续开发的资源[11-15]。此外，不同土壤真菌群落多样性存在一定差异，Margalef丰富度指数最高的是黄壤真菌，最低的是黄棕壤；3种土壤真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数在2.46～278之间，紫色土最高，黄棕壤最低；黄棕壤的Pielou均匀度指数最高，紫色土最低；Jaccard相似性指数为0.444 ～0536，表明3种土壤相似性介于中等相似和中等不相似之间。造成不同土壤真菌群落多样性的差异原因比较复杂，除了土壤质地和土壤肥力外，还与其对应生境地的光照、降雨量、植被类型等有关[16-17]。同时由于其中一些种属的菌株具有生防功能，且不同微生物群落之间产生的相互作用使网络结构发生改变，因此在一定程度上也影响了环境中的真菌多样性[18]。

由于传统培养方法的局限性，大量不可培养微生物无法通过分离获得，菌株数量十分有限。因此还需尝试多种不同的分离方法，结合以分子生物学为基础的相关技术进行多样性分析，才能更加全面地了解宽阔水保护区的土壤真菌多样性分布特征以及与环境之间的相互关系。

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第二篇：影响土壤真菌多样性的土壤因素及土壤真菌研究进展

土壤真菌多样性研究及真菌分类方法研究进展

陈秋君 201231142005 经济管理学院12级20班

摘要：简述了土壤真菌的多样性以及影响土壤真菌多样性的因子，介绍了土壤真菌分类方法近年来的研究进展。

关键词：土壤真菌 多样性 影响因子 研究方法

0 引 言

真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物.真菌多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量未开发的生物资源方面起到了重要作用.真菌构成了土壤的大部分微生物生物量, 具有分解有机质, 为植物提供养分的功能, 是生态系统健康的指示物.在农业中, 真菌既降低粮食产量, 又为控制植物病虫害和其他真菌生物防治提供一条有效途径.对根际真菌结构和多样性的了解将有助于更好的了解真菌对病原菌的抑制功能.在林业中, 丛枝真菌与植物相互共生作用, 为植物提供养份, 使植物能耐受干旱或贫养的条件, 同时也提高了植物的多样性.在草地生态系统中, 分解者生物量总体中78% ~ 90%是真菌.20 世纪60 年代以来, 微生物生态学研究发展较快, 推动了土壤真菌学研究的发展, 人们对探究土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满兴趣。70 年代以后人们更进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分, 并具有较高的生物活性。80 年代至今, 由于逐渐采用新的研究技术和手段, 土壤真菌研究的发展进入了一个新时期。

虽然真菌在陆地生态系统中有很重要的作用, 但是人们对自然界的真菌多样性了解还很少.受到全球气候变化、环境污染和人类活动等诸多因素的影响, 自然环境中真菌的种类和数量、分布都发生了显著的变化.土壤真菌研究越来越受到人们的重视。土壤真菌多样性

1.1 物种多样性

通常真菌被描述为具有真核, 能产生孢子、无叶绿素的有机体, 以吸收方式获得营养, 普遍以有性和无性两种方式进行繁殖, 菌丝通常是由丝状、分枝的枝细胞构成, 并典型地被细胞壁所包裹.真正意义的真菌包括四大类群, 壶菌门、接合菌门、子囊菌门、担子菌门.已知的壶菌约100 属, 1 000种.最新研究估计全世界的真菌种类约有150 万, 但至今已被正式描述的只有5%~ 10%[ 18~ 20] , 绝大多数是未知的.其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖, 不能从少量材料中分离出目标生物, 缺少对所有真菌群落生物都适应的培养基和培养条件;另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解, 不能准确地评价不同地域(特别是热带雨林地区)真菌群落的结构组成.1.2 生境多样性

真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中, 包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土、冻土层等.由于不同环境因子的影响, 使土壤真菌在其生活环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律.例如在林地中外生菌根真菌的种类、数量较多, 而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛.在一些极端环境, 如南北极的冻土层中则分布着丰富的子囊菌门生物, 而在温泉热土中则与其他土壤例如林地的优势种类几乎完全不同.一些真菌的生活环境仍然没被完全的报道,真菌能否像细菌一样生活在一些极端环境中? 这有待我们进一步去发现新环境中新的种类, 并探索其生理机制.1.3 功能多样性

真菌在土壤生态系统中发挥着多种多样的功能, 包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质、还原氮、溶解磷、螯合金属离子、产生青霉素等一些抗生素等.功能基因多样性又使我们对真菌功能多样性有了更进一步的理解, 使我们认识到真菌生物功能的差异是通过功能基因多样性来体现的.科学家通过从纯培养物和环境样品中扩增漆酶基因序列, 研究了美国东南部沼泽湿地中有木质素降解潜在功能的子囊菌漆酶序列多样性.独特的序列类型显示出真菌群落中这一功能基因的高度序列多样性.虽然这方面的研究受到许多因素的限制, 处于刚刚起步阶段, 但不失为我们未来发展的一个方向.真菌多样性分布影响因子的分析

2.1 种植年限对真菌多样性的影响

蔬菜种植年限对真菌的影响没有一定的规律性，总的说来，棚龄较短的较棚龄长的，土壤真菌的数量和种类都要多，但棚龄超过5 a 以后，真菌数量显著减少，不过一定周期后土壤真菌的数量又会逐渐增多，但只是少数种类真菌数量的增多，这可能与之适应了土壤环

境有关。种植年限对真菌种类的影响与对数量的影响趋势基本相同，到一定年限后，真菌种类呈现减少的趋势。

2.2 土壤碱解氮对真菌多样性的影响

土壤碱解氮含量的高低影响到土壤真菌的种类和数量。随着土壤碱解氮增多，土壤真菌的数量基本呈现出下降趋势，当土壤碱解氮低于50 mg/kg 时，真菌数量最多，达到29.49×104 cfu/g 土，高于300 mg/kg 时，真菌数量最少，仅为17.33×104 cfu/g 土。当碱解氮含量在100~300 mg/kg 之间时，真菌的种类最多，分别为44 种和35种。

2.3 土壤有效磷对真菌多样性的影响

土壤有效磷含量与土壤真菌的种类和数量之间相关性不大（表5），土壤中有效磷含量在10~50 mg/kg 之间时，土壤真菌的数量最多，极显著高于其他磷含量土样中的真菌数

量。有效磷含量为50~100 mg/kg 时，真菌种类最多，为46 种。而其他磷含量不同的土样中的真菌种类差异不大。

2.4 土壤速效钾对真菌多样性的影响

速效钾含量在250~350 mg/kg 之间时真菌数量和种类均最多，分别为21.49×104 cfu/g 土和40 种，显著高于其他土样中的真菌的种类和数量。

2.5 有机肥对真菌多样性的影响

随着土壤有机肥含量的升高，土壤真菌的种类和数量也在上升，当有机质高于40 g/kg，土壤真菌的种类和数量均最高，分别为22.86×104 cfu/g 土和55 种，经过分析得出，有机肥含量与土壤真菌的数量和种类的相关系数分别为0.976和0.960。

2.6 土壤含水量对真菌多样性的影响

土壤含水量在10%~25%之间适宜真菌的生存和繁殖，在这其间真菌的数量差异不大，土壤含水量过高或过低，真菌数量均明显下降。同样，土壤含水量对真菌种类的影响也如此，土壤含水量在10%~30%之间，土壤真菌种类较多，其中含水量在15%~20%之间真菌种 类最多，为50种。

2.7 土壤质地对真菌多样性的影响

土壤质地对真菌的种类和数量影响较大，轻壤土中真菌数量最多，为23.98×104cfu/g 土，极显著高于其他类型土壤中的真菌数量。但中壤土真菌种类最多，为68种，其次是轻壤土中的真菌种类，但中壤偏重和砂壤偏轻土壤中真菌种类最少，仅为1种。关于影响土壤真菌多样性因子的讨论

土壤真菌的数量和种类受耕作制度、土壤层次、气候变化及土壤类型等诸多因素影响，轮作与连作对土壤细菌数、真菌数和放线菌数均有较大影响，设施栽培条件下，轮作有利于土壤微生物群落的多样性和稳定性的提高，有利于土壤生态环境的改善。

施肥能不同程度地促进或抑制土壤微生物数量，影响根际土壤生理活性，尤其是有机肥能够促进蔬菜根际真菌的繁殖。

种植的蔬菜种类也影响土壤真菌的数量和种类。保护地种植年限的延长后，土壤中病原菌如镰孢菌、致病疫霉、链格孢、丝核菌的数量得到累积，一旦发病条件适宜就会造成病害的流行，给蔬菜生产带来巨大的损失。

但土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物的群体作用，土壤微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强，这也是单一或少数拮抗菌往往难以成功拮抗病原菌的原因之一。由于土壤条件复杂，微生物之间的作用关系微妙，而化学农药的大量施用，又会杀掉许多有益微生物，破坏土壤生态系统平衡，使病害更加猖獗，因此应采取各种农业综合措施，如通过施肥和轮作等来改善土壤条件，调整和优化土壤微生态结构，使土壤中病原菌数目下降到不至于引起作物病害造成经济损失程度。真菌分类技术在土壤真菌研究中的应用和发展

早在数千年前真菌就已被人类认识和利用,但对真菌的系统研究却只有200 多年的历史。此间, 主要依据形态特征描述和鉴定真菌的属和种,并且在比较形态学的基础上建立了一些分类系统。随着人类整体科学技术水平的不断提高, 真菌分类研究技术也得到了不断的发展、完善和补充, 大大推动了真菌分类研究的进展。到目前为止, 已被描述的真菌约有1 万多属, 12 万多种, 而且还不断有新的真菌属、种被陆续发现。

4.1 传统分类方法

经过多代真菌分类学家们200 多年的不懈努力, 已形成了比较完善的真菌分类体系, 对科学研究和生产实践起着重要的指导作用。

到目前为止, 由以形态学为主的传统分类方法为基础, 建立的分类系统在分类学界仍占据着举足轻重的作用, 99%的真菌属、种级分类单位仍然是建立在传统分类研究基础上的, 并仍在为人类认识真菌物种、了解和利用真菌资源发挥着重要作用。不同真菌分类学家对一些分类特征的认识和理解不同, 提出的真菌分类系统就不同。具有较大影响的真菌分类系统有以Ainsworth为代表的分类系统、Hawksworth分类系统、Kirk分类系统、Alexopoulos分类系统及Kendrick分类系统等。上述分类系统都基本上是基于主要形态学为依据的传统分类方法。传统分类方法主要依据真菌的形态、生理和生化特征等对真菌进行分类。

尽管传统分类方法有一定的局限性, 但是, 目前仍是相当有效而且可靠的方法, 是大多数分类专家所乐于采用和接受的, 仍然是发展其它现代分类方法的重要基础。离开传统分类系统和方法这个基础, 真菌分类学就会成为无源之水, 无本之木。况且, 传统分类方法本身也正处于不断发展和完善的新阶段, 并不排除采用分子生物学、生理学、生态学和生物化学等学科的新进展和新方法,来不断地改进和提高真菌分类研究工作。生物分类研究的目的是认识物种和客观地反映其系统演化关系, 无论将来的分类系统和方法多么先进, 都无法摒弃以简明、节约为主要优点, 并在很大程度上反映客观实际的传统分类方法。

4.2 现代分类技术在土壤真菌研究中的应用

传统的分类方法主要依据于真菌的形态特征及细胞生理和生化等特性, 尤其是有性生殖阶段的形态特征。其主要困难是, 在许多情况下某些真菌的表型性状相对贫乏, 难于透过现象认识其遗传本质。许多真菌有性生殖极少发生, 难以通过检查生殖隔离来界定物种。

近年来多门新兴学科和技术的发展, 尤其是分子生物学技术的兴起极大地促进了真菌分类学的发展。一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生物学技术指标日渐显示出重要的分类潜能。利用各种分子生物学手段、特殊探针和特定序列鉴定真菌种类是这一领域深入发展的前提和基础。

2000 年, Muriel等采用非培养条件下, 对ITS 基因直接扩增,克隆和对ITS 区段进行限制性酶切和序列分析的方法尝试检测了土壤真菌的多样性。通过从土壤中直接提取总DNA 和从相同的土壤中分离培养真菌、鉴定后提取其DNA 两种方法来尝试、对比。

从土壤中得到67个真菌分离物, 从土壤中提取的总DNA中得到51个扩增子, 进行ITS 扩增、酶切并比较, 共得到了58 个ITS-RFLP 图谱。可培养真菌与土壤中扩增子的ITS-RFLP 图谱差异很大,仅有一种图谱是共有的, 其他的都不相同。同样的, 培养真菌和土壤中扩增子的ITS 序列也差别很大, 58 个ITS 序列同已知序列进行比较, 结果显示所有从土壤中分离培养得到的真菌几乎都是子囊菌, 只有一种为担子菌, 而在土壤总DNA 得到的扩增子中, 除了大部分为子囊菌外, 还有一种担子菌, 一种接合菌, 和几种分别属于藻物界的卵菌(Oomycota)和原生动物界的根肿菌(Plasmodiophoromycota), 可见PCR 直接扩增获得的真菌的范围明显广于培养获得的。与传统方法相比, 它们可以揭示更多的从未检测到的微生物的多样性,并为理解自然状况下土壤真菌的组成和功能提供更加客观可靠的依据。现代科学技术的发展, 尤其是以揭示某些核酸和蛋白质等分子生物学性状来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等分类阶元的进化的研究日渐增多, 大大开阔和延伸了人们认识真菌遗传本质的视野。现代分类技术主要包括: 真菌次生代谢产物的应用、可溶性蛋白质凝胶电泳、同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 38]、DNA 水平上的真菌分类学(DNA 中G+ Cmol%含量测定、基于聚合酶链反应(PCR)基础上的DNA 多态性分析、DNA 基因位点的序列分析、多位点酶电泳、脉 冲电泳核型分析、DNA-DNA 杂交和DNA-rRNA 杂交)及数值分类分析等等。

土壤真菌中, 无性态真菌(半知菌)占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系, 在培养过程中, 真菌的形态特征和性状, 如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等都易受培养基的类型、光照、温度、培养时间的长短等条件的影响而发生变化。

因此, 在传统分类研究的基础上, 采用现代分类技术, 特别是分子生物学手段来研究此类真菌的分类问题就显得更为迫切和必要。

以传统分类为基础, 不断探求以现代生物技术为手段的综合分类研究方法, 实现传统分类方法与现代分类技术的有机结合, 是未来真菌分类研究的必由之路。

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