分子生物学论文

第一篇：分子生物学论文

分子生物学论文

姓名：

专业：药学

班级：11级药学三班 学号：

基因工程抗体治疗白血病的研究进展

【摘要】目前采用基因工程药物治疗白血病逐渐成为热点。研究表明白血病在获得缓解后用基因工程药物治疗即可提高疗效，又可减轻化疗药物的毒副反应，并可望达到治愈白血病的目的。

【关键词】白血病；基因工程抗体；研究进展

引文

白血病是一类造血干细胞的克隆性疾病，在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚，并浸润其他器官和组织，而使正常造血受抑制。在儿童至35岁以下青壮年人群中因患恶性肿瘤致死的以白血病为首，故可称为“第一杀手” [1]。治疗白血病通常采用细胞毒药物，虽然能使大部分患者病状缓解和生存期延长，但治愈率仍很低。基因工程技术的发展为降低单克隆抗体的免疫源性提供了一个有力的手段。目前嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体三种人源抗体很好地克服了HAMA反应的缺陷。2 正文

Campath一1H是在体内外对大部分正常和恶性淋巴细胞都有溶解杀伤作用的人源化CD52抗体，但对造血干细胞没有杀伤作用。起初，Campath一1H主要集中在对非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验中，但由于Campath一1H对血循环中的淋巴细胞有强力的清除作用，现已经将其应用到CLL、T— PLL疾病中。

氟达拉滨等嘌呤类似物在各种慢性淋巴细胞白血病的治疗中获得较高的缓解率，但完全根除疾病的报道很少。将Campath一1H给予预先接受氟达拉滨治疗的CLL患者，来清除微小残留病变(MRD)，从而提高完全缓解率和持续时间，这可以使难治性CLL患者的总生存率(overall survival，OS)得到改善。Galimbeai[2] 等对8名CLL患者在氟达拉滨治疗后给予Campath一1H治疗。在Campath一1H治疗后，5例患者获得分子学缓解(62．5％)，其中4例在治疗结束后一个月内获得。OR(overall response)率为72％，CR率为43％，因此Campath一1H对CLL的治疗作用是显著的。

另外，Keating[3]等 2002年对76例先前治疗过的T—PLL患者给予Campath—IH治疗的安全性和功效进行了回顾性的分析。接受Campath一1H治疗的患者，其OR率为51％，CR为39．5％，CR中位持续时间8．7个月，0s率为7．5个月(CR者14．8个月)。作者认为Campath一1H是补救T—PLL一线治疗失败__的较好药物。

在造血干细胞移植中，Campath一1H还能有效地清除供者的T淋巴细胞而不影响采集的干细胞的数目和功能，成为预防异基因移植中预防移植物抗宿主病(GVHD)较为理想的药物。

随着减轻强度的预处理(RIC)方案的发展，出现了“非清髓性”造血干细胞移植。这种方案主要是靠免疫活性细胞作用，目的是使供体干细胞既易于植入，又最终起到根除肿瘤的作用。通常是包括氟达拉滨等药物的联合应用，但仍然有较高的慢性GVHD的发生和死亡率。而Campath一1H能有效地清除供受者的T淋巴细胞，从而减少了排斥反应和GVHD的发生，为“非清髓性”移植提供了一种较为理想的免疫抑制效应。Faulkner[4] 等报道了65例接受BEAM+Campath一1H预处理方案进行异基因移植的患者，包括CLL、PLL，中位年龄为45．6岁。其中Campath—IH每天用10mg。11例发生了急性GVHD(I一Ⅱ)，9例发生了慢性GVHD。55例获得了反应，其中41例为CR，6例复发。2年Os率为68．1％，无事件生存率(EFS)为57．7％。结果2年移植相关死亡率(TRM)为13．3％。3 结语

基因工程药物治疗白血病首先可以有效的避免治愈白血病过程中由于肿瘤的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除而引起的疾病复发；其次是避免单纯化疗带来的毒副反应而引起机体的损伤以及机体对化疗药物的耐受性。因此用基因工程药物治疗白血病的方法成为了国内外科学家研究热点。我国与国外相比，虽起步较晚，但也获得了较大的发展，取得了一定的科研成果。例如，已经研制成功和正在研制的基因工程产品就有几十种，有些已经投产并开始使用，女ⅡIFN一、rhIL一

2、rhG—CSF、rhGM—CSF等。总之，基因工程药物治疗前景是十分诱人的，还有待于科研工作者的继续努力，让它为人类的健康作出更大的贡献。

【参考献文】

[1] 杨进．血液病中西医结合治疗学[M]．北京：科学技术文献出版社，2005：65．

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[3]Keating MJ，Cazin B，Coutre S，et a1．Campatb一1H treatment of T—cell prolymphocytie leukemia in patients for whom at I east oneprior chemotherapy regimen has failed[J]．J Clin Oncol，2002，20(1)：205—213． [4] Faulkner RD，Craddock C，Byrne JI，et a1．BEAM—alemtuzumabreduced intensity allogeneic stem cell transplantation for lympho—proliferative diseases；GVHD，toxicity，and survival in 65patients[J]．Blood，2004，103(2)：428-434．

第二篇：浅谈分子生物学发展期中论文

浅谈分子生物学的未来发展

摘要：在生命科学飞速发展的时代里，分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，生命活动的一致性，是生物学范围内所有学科在分子水平上的统一，分子生物学是目前自然学科中进展最迅速、最具活力的领域之一，本文在分析分子生物学的现状基础上浅谈分子生物学的未来发展里比较感兴趣的几方面，其中包括医学方面中，RNA干扰技术从基因水平上进行基因诊断和基因治疗和Micro RNA（Mi RNA）对治疗肿瘤疾病的研究进展，同时还有在基因工程方面转基因动植物的培育里对DNA重组技术的研究。

关键字：分子生物学，RNA干扰技术，Micro RNA，肺癌靶向治疗

在生命科学飞速发展的时代里，分子生物学的发展揭示了生命本质的高度有序性和一致性，生命活动的一致性，是生物学范围内所有学科在分子水平上的统一，分子生物学是目前自然学科中进展最迅速、最具活力的领域之一。要谈分子生物学的未来发展，首先就分子生物学的现状来看，分子生物学的发展及其在临床医学上的应用已经走过了半个多世纪的路程，目前在医学院校和省级以上的医院均建立了临床分子生物学实验室。随着分子生物学的兴起，分子生物学渗入到各个分支学科中，比如在发育生物学产生了分子发育生物学;与细胞生物学关系密切,已形成一门新的分子细胞生物学，许多细胞生物学问题如细胞分裂、细胞骨架、细胞因子的研究都进入了分子水平;与免疫学结合,产生了分子免疫学；与病理学结合,产生了分子病理学。因为分子生物学的广泛渗透与应用，推动了分子生物学对生命现象和本质的研究不断深入和扩大，其发展也为其他相关科学提出了许多新的研究课题，开辟了许多新的研究领域，所以在分子生物学的未来发展中，前景是相当可观的。

在医学方面，生物学的一些重大问题，比如癌、艾滋病、遗传病激增（从400种到4000种），一直没有获得解决。对于癌症，癌症是人体中一部分生长、增殖和分化失去控制的细胞。癌细胞具有脱分化、癌异质型性(DNA、蛋白质或量的增加)、无限增殖性、浸润性、癌DNA、蛋白质高螺旋化、甲基化、它失去接触抑制、对生长因子需求降低、细胞骨架紊乱、细胞表面和黏附性质改变等主要特征。在针对癌物质变化的研究中，从分子上入手对癌物质进行透彻了解，会揭开新一轮的癌症治愈革命。

RNA干扰的发现是一大壮举，近几年来一直成为分子生物学研究的热点问题之一。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。在癌症研究中，通过shRNA表达载体成功抑制了成年大鼠脑癌细胞，同时对RNAi远程基因沉默进行了非常有益的探索。RNAi干扰的进展给研究很多启示,我们可以通过构建RNA干扰系统来下调相关基因的表达，从而研究该基因的功能或者用于基因治疗。以往，我们如果想下调一个基因的表达往往要使用核酶、定点突变。这些方法与RNAi技术相比，有很多缺陷；此外，RNAi干扰还表现出极大的应用前景，我们可以研究肿瘤细胞，制备相应的RNA，对肿瘤细胞的相关关键基因进行干扰，从而抑制肿瘤细胞的扩散。

最新的实验结果表明，RNAi技术用于抑制肿瘤生长因子的表达可以抑制动物模型的肿瘤生长，并已经应用于快速鉴别新的肿瘤靶目标，所以这项技术在肿瘤的基因治疗七有光明的应用前景。再则，肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果。RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰。

尽管目前对这项功能强大的技术已经有深入的了解，新的结果不断涌现，但RNAi技术应用与肿瘤的基因治疗还需要进一步探索，相关问题有dsRNA序列的不同而产生不同抑制疗效，不同的mRNA对RNAi的敏感性不同及大于30个bp的dsRNA可导致非特异性反应等。虽然如此，因RNAi在基因特异性治疗方面的突出优势，使其在肿瘤的基因治疗方面将会具有更加广阔的应用前景。

还有，近年来，关于miRNA(Micro RNA简写)的研究新进展很多，我在中国肿瘤生物治疗杂志中有个较为感兴趣的研究进展，miRNA是一类内源性、非编码的单链小分子RNA，作用广泛，参与生命活动的一系列重要进程，并与肿瘤的发生发展密切相关。最近研究表明，大多数肿瘤细胞可利用miRNAs调节细胞凋亡，从而导致肿瘤形成或被抑制。比如，某些miRNAs上调抗凋亡基因，从而抑制肿瘤细胞的凋亡；而另外一些miRNAs则可以下调抗凋亡基因而促进肿瘤细胞凋亡

miRNA let-7是最早发现之一，在哺乳动物中调节多种细胞增殖，且在细胞周期调节中起关键作用，miRNA let-7与人类多种癌症的发生有关，其中与肺癌的关系最为密切，miRNA let-7在肺癌中表达显著降低，在非小细胞肺癌中尤为多见，其低表达可能与肿瘤预后不良有关，而高表达则直接抑制肺癌生长，miRNA let-7作为肿瘤抑制因子负性调控多种癌基因，同时也负性调控多种细胞周期调节因子，在肺癌组织中起到了肿瘤抑制因子的作用，有望成为肺癌基因治疗和预后判断的一个新靶标。

尽管大量研究表明，miRNA表达改变与多种肿瘤发生关系密切,但目前利用miRNA作为肿瘤基因诊断指标，尚缺乏一套成熟的判断标准。而通过导人外源miRNA或抑制细胞内miRNA表达,从而实现抑制癌基因或上调抑癌基因表达目的的基因治疗,也由于靶向性、安全性和有效性等问题,使基因治疗研究面临重重困难。尽管如此,作为一类新型分子标记物，miRNA在肺癌发生发展、基因诊断和基因治疗中的应用价值仍然是今后研究的热点。

除了医学的疾病，动植物方面转基因动植物的培育也是一大重点研究方向，尤其是转基因食品一直都是热题。对转基因食品的限制，以及对转基因动植树技术的审慎，意味着人类已经意识到，DNA重组技术是对人类和其他生物的基因组即遗传内环境的破坏。这与世界的科技进步对整个地球大环境的破坏一样：我们在获得现实利益的同时，可能要承受未来无法预料的灾难。因此，在进行基因工程的同时，我们必须考虑到维持体内基因环境的平衡。这是21世纪的一个新课题，是一大新的挑战与机遇。

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[3]

[2]

[1]随着生物科学的众多分支学科也将在更高层次上实现理论的大综合，分子生物学技术将会进一步普及，21世纪分子生物学的发展将进入一个新时代。

参考文献：

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第三篇：《分子生物学与基因工程》课程论文

植物基因工程研究进展

摘要：自1983年美国人首先成功地获得抗卡那霉素的烟草再生植株开始，人类就开始了植物基因工程的研究。至今已在逾200种植物中成功地获得了转基因植株,并有近1000例转基因植物获准进行田间试验,更有十余种转基因植物(如转基因棉花.大豆)已进入商业化种植.转基因产品已进入人们日常生活。植物基因工程的应用已进入蓬勃发展阶段。下面是我从植物基因工程改善生物质能利用的研究进展做一说明。

关键词：木质纤维素 细胞壁 水解酶

近几年来全世界对能源的需求量急剧增加加速了对有限的不可再生矿物质 能源的消耗资源的利用也增加了CO2及粉尘的排放,造成环境破坏和全球气候变 化[1]可再生的清洁的生物质能成为人们关注的热点。其中的燃料乙醇工业,近年来在世界范围内得到了广泛的发展,我国也大力支持发酵乙醇用作能源[2]。目前,绝大部分乙醇来源于玉米淀粉发酵生产。但是由于淀粉本身又作为食品和饲料,产量有限,成本较高,阻碍了乙醇工业的发展。于是,人们把注意力转移到谷物秸秆等廉价 的含有大量 的木质 纤维素 的生物质 材料上希望 能够被 充分利用 [3]。但由于木质纤维素本身难以分解,许多研究利用 基 因工程 方法 改善植物,使自生产生的多糖资源更利于降解,用于发酵产乙醇。1.木质纤维素发酵生产乙醇发展现状

在中国,大约每年会产生10t亿农林业废弃物这些资源用于造纸、纺织或者直接作为燃料这些占到很少一部分。绝大部分被废弃了木质纤维素是光合作用的基本产物 , 也是生物圈产生的最充足的可再 生生物资源被认为是地球上最丰富的生物高分子聚合[4]。

大部分的高等植物细胞壁由胶联多糖、糖蛋白和木质素组成双 子 叶植物 , 如拟南芥等,细胞壁多糖主要有三种:纤维素半、纤维素和果胶质,包埋在非 纤 维多糖基质(半纤维素和果胶)中的纤维素网络,与木质素和结构蛋白共同构成植物细胞壁的聚合液晶结构[5]天然状态下由于木质素的保护作用,阻碍了水解 纤维素酶与纤维素的接触并发挥作用,成为影响纤维素水解的重要因素 [3, 4]。YangB等人发酵降解实验证明,虽然半纤维素对纤维素。也有一定保护作用 , 但木质素的去除对于纤维素有效降解是最关键的[6]。一般对木质纤维素材料 的利用,首先要进行粉碎,然后预处理(酸碱处理等),最后 添 加 微 生物 来源 的纤维素复合水解酶类,使之与处理过的木质纤维充分接触,将其降解为单糖 , 从而用于乙醇发酵。现在虽然前期的粉碎和预处理工艺研究取得了很大进展但成本仍然较高，而且后期发酵分解处理。要添加来源于微生物的纤维素水解复合酶,价格仍十分昂贵[7]。这些因素导致目前用木质纤维素作为这些因素 导致 目前用木质纤维素作为原料发酵产乙醇,成本较高发展缓慢因此,现在对木质纤维素进行高效降解使用,仍然是个很大的难题。2.植物基因工程与植物木质纤维素利用

近年来随着生物技术的不断进步,人们开始尝试利用植物基因工程方法来 解决植物木质纤维素有效利用问题研究主要集中在改善植物细胞壁木质纤维素结构和含量比例等方面,使植物多糖资源利于降解使用，或者利用植物作为生物反应器,在植物内表达微生物来源的强活性纤维素降解酶,使植物自身表达高活性纤维素水解 酶类等研究。2.1 改善植物细胞壁的结构与组成

过去几十年的研究,改善木质素含量及细胞壁已成为可能。利用基 因工程方法,控制植物内木质素合成相关基因的表达,可以改变木质素结构和含量木质素对纤维素形成的保护作用是导致 纤维素资源利用 的主要障碍,降低木质素含量或改变其结构,将利于纤维素 的分解[8]。虽然植物体木质素的合成过程还不是十分清楚,但近几年的研究,已使大量降低木质素含量成为可能。

在玉米和苜蓿的研究中发现,木质素合成单体之一的芥子醇, 其前体的甲基化合成酶基因COMT(caffeate/5-hydroxyferulate O-methyltransferase),如果被抑制表达,芥子单体含量会明显减少,可导致木质素含量降低 [9, 10]但是在杨树中抑制这种酶的表达却不能够改善材质,木质素含量反而增加[11]。Li L等人在杨树中研究发现,通过反义表达4CL基因(4-coumarate-CoA ligase)时,木质素含量了减少了约40%,并且导致10%的纤维素含量的增加，如果正义表达控制木质素组成单体紫丁香基丙 烷(syringyl)和愈疮木基丙烷(guaiacyl)比率的CAld5H基因(Coniferaldehyde 5-hydroxylase),可导致紫丁香基丙烷的量明显增 高,但木质素含量没有变化[12]。当两基因同时转化时,木质素含量减少可达53%,紫丁香基丙烷含量进一步增加,而纤维素含量能够增加30%。Cano-Delgado A等人研究拟南芥CESA3突变体发现,纤维素合成酶受损时,导致了木质素大量合成[13]这表明在植物木质部细胞中可能存在一种调控机制,当木质素含量减少时,为了维持支撑作用,纤维素含量会相应增加。Chabannes M等人在烟草中研究发现,同时抑制CCR(Cinnamoyl CoA reductase)和 CAD(Cinnamyl alcohol dehydrogenase)的表达,可大量减少木质素含量,但非预期 的还引起了细胞壁多糖酚类物质及可溶性酚类物质含量的变化[14]等人在番茄中抑制表达木质素合成相关的CCR基因,导致木质素含量降低,同时与木质素形成具有共同前体的酚类复合物增加[15]。Boudet AM等人通过抑制杨树木质素合成酶基因CCR,可导致植物细胞壁纤维 素成分更容易被纤维素分解菌Clostridium产糖量达到原来的2倍[16]这表明,降低木质素等物质含量后,非常利于纤维资源的利用。Li Y等人研究发现,过氧化酶影响了木质化过程[17]。Blee KA等人在烟草中反义抑制过氧化酶FBP1(French bean cationic peroxidase)同系物表达,在不影响植物生长发育的情况下,使木质素含量降低了40%~50% [18]。通过基因工程方法,改变木质素结构与含量的方法改善植物细胞壁结构,利于作为能源植物,具有重要的研究价值。

2.2 植物体内表达木质纤维素水解酶

过去几十年的发展,植物已成功的作为重组蛋白表达的生物反应器,它相对于微生物和动物表达的优势是具有较低的成本已在多种植物里面进行了异源重组蛋白的表达研究(如疫苗和工业用酶等),蛋白表达量高且保持了很好的生物学活性[19]。近几年,人们开始在植物体内进行微生物来源的研究,希望这些植物作为生物反应器,大量表达并在细胞内积累纤维素酶。收获的植物,经过粉碎和预处理(酸碱处理等)后,在分解过程中能利用自身表达的酶,不添加加来源于微生物的酶,就可以将纤维素充分分解为单糖, 进一步用于生产乙醇,降低生产成本(Sticklen M,2006)[20]。考虑到细胞质表达对植物生长影响较大,一般采用定向胞外或细胞器积累表达（如定向质外体叶绿体溶酶体等）Ziegler MT等人在拟南芥中,定向质外体,积累表达了来源于Acidothermus cellulolyticus的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶(Endo-1,4-β-glucanase),表达量约达到叶子总可溶性蛋白的26%,并且保持了很好的活性[21]，同样是在拟南芥中,Hyunjong B等人定向叶绿体和过氧化酶体,积累表达来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶(Xylase),达到了总可溶性蛋白的4.6%,明显 高于细胞质表达和单一细胞器定向表达[22]在烟草中Dai Z等人定向叶绿体,积累表达了A.cellulolyticu 的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到总可溶性蛋白的1.35%[23]。Dai Z等人采用同样的酶,比较了定向不同细胞器积累表达的差异,发现定向质外体表达蛋 白量最高,且保持了较好的活性[24]。在其它的植物中,也进行了相关的研究, Xue GP等人在大麦的胚乳中,特异表达来源于Neocallimastix patriciarum 的内切-β-1,4-葡聚糖酶,约达到了总种子蛋白的1.5%[25]。Oraby H 等人在水稻中,定向质外体积累表达了A.cellulolyticu耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶,达到了叶子总可溶性蛋白的 4.9%。

目前的研究集中于将植物作为生物反应器,尽可能多的表达并积累纤维素酶,用于后期的处理。在发酵分解过程可以利用植物自身表达的异源纤维素水解酶,节省了额外添加酶的量。表达 的大都是内切-β-1,4-葡聚糖酶或木聚糖酶,为了预处理后还 能保持较好活性,多采用稳定性强的耐高温酶。由于纤维素有效降解需要复合水解酶,并且木质素对其具有很强的保护作用,这些植物不会发生自身降解。3.前景与展望

利用不断发展的植物基因工程技术,在能源植物研究方面已经取得了不错的研究进展。但是,目前要实现廉价充分的利用纤维资源,还有一定的困难。通过对植物细胞壁合成 代谢研究的不断深入,应该能够获得对自身生长发育不影响的低木质素植物细胞壁木质素结构及含量改善纤维素含量增加,利于降解发酵产乙醇。还希望最终能够获得一种能源植物,这种植物通过自身表达异源的高活性木质纤维水解复合酶,酶的表达受到诱导调控,收获前诱导表达,收获后送往生物能源发酵工厂。这期间,木质纤维素多糖在植物体内也可进行持续降解,在发酵工厂只需添加一些简单的辅助分解酶就可以彻底降解掉,使木质纤维资源产乙醇变得十分简单 参 考 文 献: 1.Dorian JP, Franssen HT, Simbeck DR.Energy Policy, 2006, 34 : 1984~1991.2.Yang B, Lu Y.J Chem Technol Biotechnol, 2007, 82 : 6~10.3.Himmel ME, et al.Science, 2007, 315 : 804~807.4.Ding SY, Himmel ME.J Agric Food Chem, 2006, 54(3): 597~606.5.Cosgrove DJ.Nat Rev Mol Cell Biol 2005 6 11 850~861.6.Yang B Wyman CE.Biotechnol Bioeng 2004 86 1 88~95.7.Kabel MA, et al.Biotechnol Bioeng, 2005, 93 : 56~63.8.Ragauskas AJ, et al.Science, 2006, 311 :484~489.9.Piquemal J et al.Plant Physiol 2002 130 4 1675~1685.10.Guo D et al.Transgenic Res 2001 10 5 457~464.11.Pilate G et al.Nat Biotechnol 2002 20 6 607~612.12.Li L et al.Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4939~4944.13.Cano Delgado A, et al.Plant J, 2003, 34(3): 351~362.14.Chabannes M et al.Plant J 2001 28 3 257~270.15.van der Rest B et al.J Exp Bot 2006 57 6 1399~1411.16.Boudet AM Kajita S Grima Pettenati J et al.Trends Plant Sci2003 8 12 576~581.17.Li Y et al.J Plant Res 2003 116 3 175~182.18.Blee KA, et al.Phytochemistry, 2003, 64(1): 163~176.19.Streatfield SJ.Plant Biotechnol J 2007 5 1 2~15.20.Sticklen M.Curr Opin Biotechnol 2006 17 3 315~319.21.Ziegler MT, Thomas SR, Danna KJ.Mol Breed, 2000, 6 : 37~46.22.Hyunjong B, Lee DS, Hwang I.J Exp Bot, 2006, 57 : 161~169.23.Dai Z, Hooker BS, Anderson DB, et al.Transgenic Res, 2000, 9(1):43~54.24.Dai Z, et al.Transgenic Res, 2005, 14(5): 627~643.25.Xue GP et al.Plant Cell Rep 2003 21 11 1088~1094.

第四篇：分子生物学与基因工程结课论文

《分子生物学与基因工程》

结课论文

Real-Time PCR在分子生物学中的应用

姓

名：XXX 学

号：AXXXXXXX 院

系：生命科学学院 班

级：生科XXX班 任课教师：XXX

二零一二年十二月 Real-Time PCR在分子生物学中的应用

XXX XXX大学生命科学学院 黑龙江哈尔滨 150xxx

摘 要：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于分子生物学领域中获取特定基因或基因片段。定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术，即实时定量PCR（real-time quantitative PCR）。该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，且与常规PCR相比，它具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，成为了分子生物学研究中的重要工具。关键词：实时定量PCR；基因扩增；分子生物学

1971年Khorana等最早提出PCR理论：―DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA 基因‖。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶 ⅠKlenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序,最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。

自从PCR技术问世便很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术，上述问题才得到较好的解决[1]。实时荧光定量PCR（real-time fluoro-genetic quantitative PCR，FQ-PCR）是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。

1.实时荧光定量PCR技术概述

1.1 实时荧光定量PCR原理

1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。在探针5’端标记一个报告基团（R），在3’端标记一个淬灭基团（quencher，Q），两者距离很近时（7-10nm），报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收，并依赖其较高的S/N比值（信-噪比, signal-to-noise ratio）和良好的辨别能力进行定量检测。

荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[4][3]1.2 常用实时荧光定量PCR分类

1.2.1 实时荧光定量PCR荧光染料法

实时荧光定量PCR荧光染料法包括非饱和染料SYBR Green法和饱和染料LC Green法[5]。非饱和染料SYBR Green染料法定量成本低，方法简便，不需要设计探针，但是特异性低。荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。饱和染料LC Green法与SYBR染料法工作原理是一样的，但与传统的荧光染料SYBR Green相比有如下优点：LC Green染料在进行PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制PCR反应，而Sybr Green 染料浓度过高会抑制PCR反应。从而，利用LC Green染料可以进行高分辨率熔解曲线分析。在进行HRM分析时，由于饱和染料占据了DNA双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除LC Green染料外，常用的染料还有Reso Light、Ever Green等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。

1.2.1 实时荧光定量PCR探针法

实时荧光定量PCR寡核苷酸探针法包括TaqMan探针法和TaqMan-MGB探针法。TaqMan 探针法技术原理是利用Taq酶的5’—3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5’端标以荧光报告基团，3’端标以荧光淬灭基团。在PCR退火复性期，探针与DNA模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’—3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。因此，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。荧光信号强度与PCR产物量相对应。

MGB探针与传统的TaqMan探针比较，有很大的优势。它可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列的 MGB探针的设计有很大的帮助；同时可以提高配对与非配对模板间的Tm值差异； 由于在探针的3’端的Quencher基团为不发光的荧光基团，并且与Report基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高，可 以进行SNP分析。MGB探针实验步骤简单，使杂交的重复性大大提高。

1.3 实时荧光定量PCR定量方法

在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：绝对定量和相对定量。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量；相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。由于每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品可做出标准曲线。

1.3.1 绝对定量法

该方法是利用标准品作一条标准曲线，通过标准曲线对样本进行定量。绝对定量标准品一般是用质粒DNA或是PCR扩增产物等制备的。标准品的量根据260nm的吸光度值计算得出。由于样本的浓度完全是通过标准曲线来确定，所以合适的标准品是定量准确的关键。一方面标准品与未知样本应具有一致的扩增效率，另一方面标准品的定量必须准确。这就要求标准品的扩增序列与样本完全一致，制备的标准品纯度要高，不应含有影响定量的因素如Dnase、标准品与未知样本各自反应体系内的干扰因素要一致等。该方法的优点就是测定范围很广（10～1010拷贝），结果可直接通过软件得出，不需额外计算。1.3.2 相对定量法

相相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素，通常选用的管家基因有GAPDH、β-2微球蛋白和rRNA。使用的β-actin、相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。此种方法计算出未知样品的量是相对于某个参照物的量而言，因此，相对定量的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。在整个试验中，待测样品的量来自于标准曲线，最终必须除以参照基因的量，即参照基因是1×的样本，其他的样本为参照基因的n倍。由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用管家基因的量来作为标准，以比较来源不同的样本，目的基因表达量的差异，此即相对定量。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致；此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PCR反应，存在两种模板相互的干扰和竞争[7]。

1.3.3 相对定量反应循环值（Ct）比较法

[6]即ΔCT值法，该方法是同时扩增待测靶基因片段和一个作为内参照的基因片段，一般是一个内源性管家基因片段。这两个扩增反应可在2管中分别进行，也可在同一反应管中进行，测得两者的CT值之差，即ΔCT。该方法不需要标准曲线。它是根据PCR扩增反应的原理，假设每个循环增加倍的产物数量PCR反应的指数期得到扩增产物的值来反映起始模板的量通过数学公式来计算相对量。比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。比较不同待测标本DNA的ΔCT值与正常标本DNA的ΔCT值的变化，即可对未知标本靶基因的原始拷贝数作出判断，从而对病理状态进行判断或诊断。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计[8]。最终结果也是靶序列和参考品的相对比值。该方法需确定靶序列和参考品的扩增效率是否一致；如不一致，则会影响结果的准确性。

2.实时荧光定量PCR技术的应用

实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达[ 9 ]、分析基因变和多态性[ 10 ]、分析细胞因子的表达

[ 11 ]、单核苷酸多态性（SNP）

[ 12 ]

测定及易位基因的检测

[ 15 ]

[ 13 ]

等；在医疗方面，可用于免疫组分分析

[ 14 ]、临床疾病早期诊断、病原体检测、耐药性分析

[ 16 ]、肿瘤研究[ 17 ]和微小残留病变（MRD）[ 18 ]检测等。

以下就其在基因工程研究、病原体的检测和肿瘤分子诊断等方面的应用及其新进展作一简述。2.1 基因工程研究领域

实时荧光定量技术的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不稳定性，已经被广泛应用于遗传分析[19]。

2.1.1

基因表达研究

由不同的荧光报告基团标记的探针分别与野生型和突变基因杂交，探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关。如果一种染料的荧光信号明显强于另一种，说明它是一个纯合子，如果荧光信号都增加则表明是一个杂合子。从使用范围来看，它能用于检测已知基因序列的任何遗传病基因的突变和缺失及表达量的异常，从灵敏度方面看，它能从单细胞进行特异基因扩增，实现植入前基因诊断。PCR技术还可用于端粒酶的检测。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。应用实时荧光定量PCR方法对β地中海贫血症（β地贫）患者β与γ球蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地贫的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。迄今对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，只能通过产前监测和产前基因诊断，减少病婴出生[20]

。因此，实时荧光定量PCR方法可用于产前监测和产前基因诊断。

2.1.2

单核苷酸多态性（SNP）及突变分析

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性[21]。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析。

2.1.3

转基因研究

Tesson等确定了实时定量PCR的技术条件，利用两种发光探针及适当的循环域值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因鼠的接合性[22]。同型结合的和异质接合的动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律，通过实时定量PCR检测，该方法为转基因动物的同型结合及异质接合提供了明确的鉴定结果。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大用途。

2.2 肿瘤的分子诊断

肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等，尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因之一已得到普遍承认[23]。癌基因的突变和表达增加，在许多肿瘤早期就出现。实时荧光PCR技术不仅能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。如定量结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量，可作为诊断癌症微转移的重要依据[24]。目前，肿瘤患者的生存期已有所延长，但是缓解期的患者仍存在复发的危险，因此，微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案至关重要。实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具[25]。Eckert等提出采用实时荧光PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病微残留病灶，对儿童急性白血病的治疗有重要指导意义。

2.3 病原体的分子检测

目前，用此方法还进行了对人类结核杆菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒等病原体的检测[26]。同样在国内，2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得荧光定量PCR技术得以应用和发展。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。目前, 实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒（HIV）等各种病原体的临床诊断，为实现快速准确诊断提供了有效的检测方法。

3.小结

时荧光定量PCR与其他一些技术的结合应用，是今后发展的方向，如与高级微型解剖技术结合后，能提高形态学损伤所至低水平扩增的检测能力[ 27 ]、可定量分析石蜡包埋储存样本中的核酸[ 28]及少量细胞中的全部转录产物[ 29 ]等。此外，微阵列实验中所选基因表达水平的测定仍需使用实时PCR技术[ 30 ,31 ]，利用该技术还可使等位基因特异表达分析以及生化武器证据甄别成为可能。

通过设计针对目的基因的特异性引物和探针，并优化反应体系和反应循环参数，已成功地建立了快速、灵敏、特异的Q-PCR检测方法。可实现大量样本同时检测，并节省大量试验时间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段；同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断[32]。因此Q-PCR技术将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具，在临床上将有更加广阔的应用前景。

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第五篇：分子生物学

分子生物技术在微生物鉴定中的应用

摘要：微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性，分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。

关键词：16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1)生存环境多样;2)生长、繁殖速度多样;3)营养、代谢类型多样;4)生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长，生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究，传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要，最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种(约90%-99%)用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.，导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。1．16SrRNA比较测序

16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有的原核生物的基因组中，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异[3]。2.PCR近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA 的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对;耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[5]。3.电泳分离及其显示方法

除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE), 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物，其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构 的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。

温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性(SSCP)也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。

分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的(低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。

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