基因工程药物的生产原理及其应用

第一篇：基因工程药物的生产原理及其应用

基因工程药物的生产原理及其应用

摘要：近年来，基因工程药物在目的基因制备、载体的构建、基因转移技术、宿主表达系统和生物反应发生器等方面取得了令人瞩目的成就。本文简单介绍基因工程药物的生产原理及其重要应用。关键词：基因工程药物 生产原理 应用

随着基因研究的深入，人类已经可以生产出许多基因工程产品。基因工程药物引入医药产业,由此引起了医药工业的重大变革,使得医药产业成为最活跃、发展最快的产业之一，同时大大提高了21世纪人类的整体健康状况。

基因工程药物又称生物技术药物是指利用基因工程技术研制和生产的药物，是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞),使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗。主要种类有：胰岛素、单克隆抗体、荷尔蒙、干扰素、白细胞介素、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、集落刺激因子。生产原理

基因工程制药技术分获取目标基因的上游技术和大量培养上游技术阶段。上游技术实质就是基因工程技术。下游技术则包括菌体培养，细胞破碎，大量培养以及分离纯化几个步骤。

1.1 基因工程制药的上游技术

基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达。

基因工程研究采用的技术方法很多，以下介绍常见基本两种：聚合酶链反应技和Sanger双脱氢链终止法。

1.1.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③ 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

作者简介:任灏诗,女,汉族,籍贯(广东佛山),大学本科,华南师范大学大二本科生, Email: 1030156661@qq．com 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。1.1.2 双脱氢链终止法

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。主要步骤如下：

Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。1.2 基因工程制药下游技术

1.2.1 基因工程菌的培养

基因工程菌的培养过程主要包括：

① 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件；

② 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。

由于细胞生长和异源基因表达之间有着较大的差异，各培养参数在全过程中必须分段控制。

培养方式主要有：

一、补料分批培养

补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。

二、连续培养

连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率。

三、透析培养

透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液打作者简介:任灏诗,女,汉族,籍贯广东佛山),大学本科,华南师范大学大二本科生, Email: 1030156661@qq．com．

入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环。

四、固定化培养

基因工程菌经固定化培养后，解决了质粒的稳定性问题，该培养方式对分泌型菌更为有利

1.2.2基因工程菌细胞的破碎

现今，在基因工程菌的研究中，主要涉及有细菌，酵母和藻类。微生物的细胞壁比较坚韧。

目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。

机械法有很多类型，常见的有：高压匀浆破碎法（homogenization），振汤珠击破碎法(Skaking Bead)，高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding），超声波破碎法（ultrasonication）。

非机械法有如下类型：渗透压冲击破碎法（osmotic shock），冻融破碎法（freezing and thawing），酶溶破碎法（enzyme lysis），化学破碎法（chemical treatment），去垢剂破碎（detergents）。

1.2.3基因工程蛋白的分离和纯化

基因重组产物均在其宿主细胞内克隆表达，且大多为胞内物质。基因重组蛋白的分离和纯化，由于目标产物的性质和对产品纯化要求不同，其分离和纯化的方法和选择的纯化路径也不同，但主要分为两个方面：1.目标产物的粗级分离，主要是在细胞培养后，将细胞从培养液中分离出来，然后再破碎细胞释放产物，溶解包含体，复原蛋白质以除去大部分杂质；2.目标产物的纯化，这是在分离的基础上，用各种具体高选择性的精密仪器，使产物的纯度和回收率。

主要分离技术: 1．离心及沉淀 离心分离的原理是在转子高速转动所产生的离心力的驱动下，利用固体及液体间的密度差来进行悬浮液，乳浊液的分离。沉淀原理是利用油和杂质的不同密度，借助策略的作用，达到自然分离才者的一种方法。

2.膜分离 膜分离是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一门分离新技术。膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生物、环保、化工、冶金、能源、石油、水处理、电子、仿生等领域，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。

3.双水相萃取 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法，又称双水相分配法。20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。

4.反胶团萃取 蛋白质溶解于小水池中(正萃，或称萃取)，其周围有一层水膜及表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活。改变pH、盐浓度等条件蛋白质又可回到水相(反萃)，实现了蛋白质的萃取分离、纯化目的。反胶团萃取蛋白质的机理目前尚不十分清楚。一般认为，萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用是主要推动力。根据所用表面活性剂类型，通过控制水相pH高于或低于蛋白质的等电点(pI)，达到正萃反萃的目的。

作者简介:任灏诗,女,汉族,籍贯广东佛山),大学本科,华南师范大学大二本科生, Email: 1030156661@qq．com．

基因工程药物应用事例

2.1胰岛素

胰岛素是基因工程药物最重要的代表。胰岛素是由胰产生的一种蛋白。它在人体新陈代谢中起着重要作用，如果体内不足就会引发糖尿病，因此胰岛素是治疗糖尿病的特效药。这种病发病率很高，困扰着上千万人。过去从猪、牛胰中提取胰岛素，产量低，满足不了患者的需求。现在利用基因工程技术，有两种方法可以让微生物发酵产生胰岛素。一种是先在大肠杆菌中分别合成胰岛素A链和B链，然后再在体外用化学方法将两条链连接成胰岛素。美国Eli lilly公司采用这种方法生产胰岛素。另一种是采用分泌型载体表达胰岛素原，然后再将其转化为胰岛素。丹麦Novo Nordisk公司就是采用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。2.2干扰素

干扰素是病毒入侵人体或其他动物后，机体产生的可以对多种病毒具有抵抗能力，抑制它们复制、增殖的一种蛋白质。它是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性受细胞基因组的调控。在一般生理状态下，细胞的干扰素基因呈静止状态，只有在干扰素诱导剂作用下，干扰素基因才进行转录并翻译出具有种属特异性的干扰素。干扰素本身不能直接杀灭活病毒，但是它能使细胞产生许多抗病毒蛋白质，使病毒的mRNA不能和核酸体结合，因而无法合成病毒蛋白质，从而减少了新病毒粒子的合成，阻断了病毒的增殖。它在临床上主要用于恶性肿瘤和病毒性疾病的治疗。

过去，干扰素一般只能从感染病毒的人血液中的白细胞或纤维中提取，量少价昂，难以应用于临床。1980年美国基因技术公司把人体血细胞干扰素基因转移到大肠杆菌或酵母菌中，成功表达。其中a、β、r种干扰素已工业化生产，产品已投放市场。我国也已生产出a型和r型干扰素。2.3重组疫苗

所谓重组疫苗就是利用重组DNA技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产物用作疫苗。重组疫苗的重要性在于它可以替代灭活或无感染力的病原微生物来进行免疫。第一个应用于人体的重组疫苗是用酵母菌生产的乙肝疫苗。它是将乙肝表面蛋白抗原基因在酵母菌 中克隆和表达，生产出来的蛋白及其聚合物与在感染体内发现的十分相似，将这些聚合物纯化，制成乙肝疫苗，可以用于使人体产生对乙肝病毒的免疫力。

在生物技术总的发展趋势下，基因工程制药仍是21世纪生物制药中最具活力的研究领域．随着人类基因组中更多基因的功能被研究清楚和药物基因组学的不断完善，将可能有数以千计的具有特殊疗效的蛋白质药物问世。这将使传统的医药业发生革命性变化。药物的生产和使用将会更加趋于种族化、家族化甚至个体化。参考文献

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第二篇：基因工程药物论文

基因工程药物

姓名：陈剑云 学号：U201210914 班级：机械学院测控1204班

摘要：自１９７２年ＤＮＡ重组技术诞生以来，生命科学进入了一个崭新的发展时期。１９８２年美国礼莱公司推出基因工程胰岛素，这是第一个人用基因工程药物。从那时起，以基因工程为核心的现代生物技术已应用到农业、医药、化工、环境等各个领域。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科发生了革命性的变化，也为医药工业发展开辟了广阔的前景，以ＤＮＡ重组技术为基础的基因工程技术改造和替代传统医药工业技术，已成为重要的发展方向。

关键词：基因工程制药应用

基因的定义：基因是脱氧核糖核酸（DNA）分子上的一个特定片段。不同基因的遗传信息，存在于各自片段上的碱基排列顺序之中。基因通过转录出的信使使核糖核酸（mRNA），指导合成特定的蛋白质，使基因得以表达。

基因工程定义：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程药物定义:基因工程药物又称生物技术药物,是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞),使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗。

基因工程药物的发展历程：自1972年DNA重组技术诞生以来,作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场,标志着世界第一个基因工程药物的诞生。美国是现代医药生物技术的发源地,也是率先应用基因工程药物的国家,其基因工程技术研究开发以及产业化居于世界领先地位。美国已拥有世界上一半的生物技术公司和一半的生物技术专利。据1998年美国药学会统计,美国FDA已批准了56种生物技术医药产品上市,其中绝大多数为基因工程药物。此外,还有200多种基因工程药物正在进行临床试验,其中至少有1/5的产品将可能在今后10年内上市。基因工程药物为美国的一些公司创造了丰厚的回报,取得了巨大的经济效益和社会效益。欧洲在发展基因工程药物方面也进展较快,英、法、德、俄等国在开发研制和生产基因工程药物方面成绩斐然,在生命科学技术与产业的某些领域甚至赶上并超过了美国。我国基因工程药物的研究和开发起步较晚,直至20世纪70年代初才开始将DNA重组技术应用到医学上,但在国家产业政策的大力支持下,这一领域发展迅速,逐步缩短了与先进国家的差距。1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物———重组人干扰素重组人干扰素αIb,标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素αIb是世界上第一个采用基因克隆和表达的基因工程药物,也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。从此以后,我国基因工程制药产业从无到有,不断发展壮大。截止1998年底,我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种，国内已有30余家生物制药企业取得基因工程药物或疫苗试生产或正式生产批准文号。至2000年,我国已有200多家生物技术公司,有20多家生产销售人干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗等12种基因工程药物。

基因工程药物的本质是蛋白质，生产基因工程药物的方法是：将目的基因连接在载体上，然后将导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中的到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞表达，就称为基因治疗。

基因治疗：基因治疗就是从遗传物质本身，即基因入手，不必产生或纯化基因的最终产物，而是将基因，通常是通过一个载体直接导入人体，再利用人体自身就具有的基因复制、转录与翻译功能来产生这些产物，达到补充正常基因产物或对抗异常基因的目的。将基因导入哺乳类动物细胞的方法有两种，一类是理化方法，一类是病毒介导的DNA转移。

利用基因工程技术生产药品的优点在于：大量生产过去难以获得的生理活性物质和多肽；挖掘更多的生理活性物质和多肽；改造内源生理活性物质；可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

基因药物的发展前景

与传统制药相比，生物制药有便于大规模生产、利润高、生产工艺简单、人力投入少、无污染、生产周期短等优点，因此，随着人类基因组计划的实施和科技水平的进一步发展，基因药物在医药市场的比例也将会日益提升，也将越来越影响人类的生活。

基因药物同时具有高投入、高收益、高风险、长周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新报告指出，2004年，全球生物制药市场的收入为450亿美元。到2011年，其有望达到982亿美元。据预测，全球第一个用转基因植物生产的生物药物可望于2005～2006年上市。随着公众认知度的提高和相关法规的逐步完善，用转基因植物生产生物药物的市场将飞速增长，到2011年，单美国市场就将达到22亿美元。2002年底到2003年5月间一场突如其来的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒传播，席卷了亚洲及加拿大等地。在紧张而又严肃的应对这场疫情的过程中，生物制药又成为医药行业人士关注的焦点。

我国生物制品需求巨大，过去的几年我国企业一直能保持年均15％以上增幅，并且近年来销售的增长速度有加快的趋势。据统计，2005年国内生物制品销售收入总额为157．4亿元人民币，销售利润总额为38.7亿元人民币。预计到2006年生物技术工业总产值将达400亿到500亿元，到2015年总产值可达1100亿到1300亿元。我国的生物制药业将进入一个快速发展的阶段,生物医药工业将成为医药产业增长最快的部分。目前,我国许多省市已将生物制药作为本地的支柱产业重点扶持。一大批生物医药科技园相继在各地高新技术开发区建成。面对入世带给我国生物制药业的挑战和机遇,专家们预测,在未来若干年,我国的生物制药业将以超过全球平均增长速度步入高速发展轨道,前景十分广阔。

基因工程药物的发展概况

20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入到哺乳动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。

基因工程技术制药展望

基因工程技术在医药工业中的应用非常广泛，利用基因工程技术开发药物已成为当前.最为活跃和迅猛发展的领域。随着人类基因组计划的完成，以及基因组学、蛋白质组学、生物信息学等研究的深入，为医药生物技术开拓了一个新的领域，基因工程制药将有更多机会获得突破性进展，为保障人类健康做出更大的贡献。

参考文献：

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[11] 陆祖宏，何农跃，孙啸．基因芯片技术在基因药物研究和开发中的应用[J].中国药科大学学报．2001，32(2)：81．

第三篇：基因工程药物教学大纲（范文）

基因工程药物教学大纲

课程名称：基因工程药物

课程编号：0235203 学分：1.5 学时数：28

考核方式：N+2。笔记10%，考试成绩占40%，过程成绩N占50%。先修课程：生物化学、微生物学、基因工程等。课程说明：专业选修课。

一、课程的性质

基因工程技术, 不仅使整个生命科学的研究发生了前所未有的深刻变化, 而且也给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的经济和社会效益, 给人类进步带来了新的契机。目前，基因工程学正以新的势头继续向前迅猛发展, 成为当今生物科学研究诸领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一, 特别是基因工程在医药生物技术领域中的研究和应用，其意义深远、潜力之巨大。

二、课程的目的与教学基本要求

课程目的：为了适应生物工程技术的迅速发展、拓宽专业面, 为了使学生对当今世界生物工程领域日新月异地发展的高新技术有更多的了解, 进一步扩大学生的知识面和视野，同时为他们今后从事这方面的工作和研究打下一定理论基础, 特开设该课程。

课程任务: 通过讲授基因工程制药的概貌及国内外研究进展、基因工程制药常用的工具酶和克隆载体、基因工程药物无性繁殖系的组建以及基因工程药物的生产和质量控制等, 使学生对基因工程的基本理论、基本步骤和操作技术以及基因工程药物的生产技术原理和方法有比较系统的了解, 初步掌握基因工程制药有关基本知识。

三、课程适用专业

本课程适用于生物技术专业等相关专业。

四、教学内容、要求与学时分配

第一章 基因工程制药概述(2学时)

第一节：基因工程的概貌 简述基因工程的诞生和兴起，基因工程的定义、特点与基本步骤，基因工程早期的开创性研究成就，基因工程的应用与发展趋势等。

第二节：基因工程与生物制药 简述基因工程药物的研究和发展概况，介绍应用基因工程和蛋白质工程技术研究开发的几种新型基工药物。

第二章 基因工程制药常用的工具酶(2学时)

第一节：限制性核酸内切酶 简述限制酶的发现、限制酶的种类、限制酶的命名和限制酶的特性与用途等。

第二节 DNA连接酶 重点介绍DNA连接酶连接作用的特点，基因工程中常用的连接酶(T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶)的酶活性和用途，DNA连接酶连接作用的分子机理。

第三节 DNA聚合酶 重点介绍大肠杆菌DNA聚合酶

1、Klenow大片段酶、T4噬菌体DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及、反转录酶等的酶活性和用途。

第四节 DNA修饰酶 重点介绍末端脱氧核苷酸转移酶、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等的酶活性和用途。

第五节 单链核酸内切酶 重点介绍S1核酸酶、Bal31核酸酶等的酶活性和用途。

第三章 基因工程制药常用的克隆载体(4学时)第一节 质粒载体 内容：质粒的定义、质粒DNA分子的特性、质粒载体的改造及构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种质粒载体的结构和用途，主要包括pBR322及其衍生栽体、pUC系列载体。

第二节 λ噬菌体载休 内容：λ噬菌体的基本特性、λ噬菌体基因组的结构与功能、λ噬菌体DNA的改造及其载体的构建。重点介绍基因工程制药中常用的几种λ噬菌体载体，主要包括 Charon系列载体、EMBL系列载体、λgt系列载体。

第三节 M13噬菌体载体 内容包括：M13噬菌体的基本特性、M13丝状噬菌体载体的构建、常用的M13噬菌体载体，主要包括M13mp18和M13mp19载体。

第四节 粘粒（Cosmid）载体 内容：粘粒载体的构建、常用的粘粒载体。

第五节 哺乳动物细胞载体系统 主要介绍：SV40载体、BPV载体、EBV病毒载体。

第四章 目的基因的制取(2学时)

第一节 目的基因的化学合成 内容：目的基因的设计, 寡聚核苷酸片段的合成, 寡核苷酸片段的分离和纯化, 用寡核苷酸片段组装目的基因, 化学合成寡核苷酸的其它用途。

第二节 构建基因文库法分离目的基因 内容：构建基因文库法分离目的基因的基本步骤, 真核基因组DNA文库的构建过程

第三节 酶促合成法制取目的基因 内容：真核生扬细胞中的mRNA, 从构建 的cDNA文库中筛选目的cDNA, RT-PCR法合成目的cDNA。

第五章 目的基因与克隆载体的体外重组(2学时)

第一节 目的基因与质粒载体的连接 内容：粘性末端连接法, 定向克隆法,平末端连接法, 同聚物加尾法, 加人工接头连接法, 加DNA衔接物连接法, 其它转换末端形式连接法。

第二节 目的基因与噬菌体载体的连接 内容包括：噬菌体载体臂DNA的制备, 噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接。

第六章 重组克隆载体引入受体细胞(2学时)

第一节 概述 内容：基因工程的受体细胞, 重组体分子导入受体细胞的途径。

第二节 重组体DNA分子的转化或转染 内容包括：用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法, 用复合剂制备感受态细胞转化法, 高压电穿孔转化法。

第三节 重组噬菌体DNA的体外包装与转染 内容：噬菌体体外包装的基本原理, 噬菌体DNA的体外包装, 包装提取物的制备, 重组DNA的体外包装与感染方法。

第四节 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染

第七章 含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析(6学时)

第一节 重组体(菌)的筛选 内容：抗生素抗性基因插入失活法, b-半乳糖苷酶 基因插入失活法, 快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法, 放射性标记核酸探针杂交筛选法, 免疫化学筛选法。

第二节 重组体的鉴定 内容：酶切及凝胶电泳鉴定法, Southern印迹杂交法, 电镜R-环检测法, 基因产物鉴定法。

第三节 重组DNA的序列分析 内容：Sanger双脱氧链终止法DNA测序, Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序。

第八章 目的基因在宿主细胞中的表达(2学时)

第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达 内容：原核基因表达载体的构建, 常见的原核细胞表达载体系统, 外源目的基因在原核细胞中的表达形式, 在原核细胞中高效表达目的基因, 基因定点诱变技术。

第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达 内容：真核细胞表达载体的功能元件, 酵母菌表达系统, 哺乳动物细胞表达系统。

第九章 基因工程无性繁殖系的组建(2学时)

内容：人胰岛素原融合蛋白重组菌的组建, 人a2b型干扰素工程菌的组建, 集落刺激因子工程菌的组建, 白细胞介素融合蛋白工程菌的组建, 乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建, 人组织型纤溶酶原激活剂细胞株的组建, 红细胞生成素CHO细胞株的组建, 人肿瘤坏死因子昆虫细胞株的组建。

第十章 基因工程药物的生产(2学时)

第一节 基因工程菌（细胞）的培养与发酵 内容包括：工程细菌的培养与发酵, 工程酵母的培养与发酵, 工程细胞的培养与发酵。

第二节 基因工程药物的分离纯化 内容包括：影响分离纯化工艺的主要因素, 各种产物表达形式采用的分离纯化方法,。

第三节 基因工程药物的分离纯化实例 内容包括：以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化, 以分泌型表达的人a1-干扰素的分离纯化, 以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化, 在酵母中表达的HBsAg的分离纯化。

第十一章 基因工程药物的检验(学生自学)

第一节 基因工程药物的质量控制 内容包括：主要的基因工程药物, 基因工程药物的特点, 基因工程药物的质量要求, 基因工程药物的质控要点, 基因工程药物的制造及检定规程。

第二节 基因工程药物常用的检验方法 内容：化学检定法, 肽图分析法，外源性DNA残留量的测定，宿主细胞蛋白杂质的检测，无菌试验，内毒素试验，异常毒性试验，热原质试验，生物学活性(效价)检定。

第三节 主要基因工程药物的检验 内容：重组人胰岛素的检验，重组人生长激素的检验，重组人干扰素的检验，重组人白细胞介素的检验，重组人红细胞生成素的检验，重组人集落刺激因子的检验，重组人组织型纤溶酶原激活剂的检验, 重组人肿瘤坏死因子的检验，重组乙型肝炎疫苗的检验。

五、教材和主要参考资料

理论教学教材： 《基因工程》, 杨汝德主编，华南理工大学出版社，2006.8 主要参考教材： 《基因克隆技术在制药中的应用》, 杨汝德主编，化学工业出版社，2004.1

执笔人：阚劲松

教研室：

系主任审核签名：

第四篇：基因工程药物开发利用前景

基因工程药物开发利用前景

摘 要：生物制药是以基因工程为基础的现代生物工程，即利用现代生物技术对DNA进行切割、连接、改造，生产出传统制药技术难以获得的生物药品。而现代生物技术是以基因为源头，基因工程和基因组工程为主导技术，与其他高技术相互交叉、渗透的高新技术。比尔·盖茨预言：下一个首富可能是从事生物技术的投资者。本文简要分析了国内外基因工程药物开发的现状和前景。

以基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程为主体的现代生物技术是70年代开始异军突起的高新技术领域，近一，二十年来发展极为神速，它与微电子技术，新材料和新能源技术并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱，被认为是21世纪世界科学技术的核心。现代生物技术又是一项与医药产业结合极为密切的高新技术，它的发展已带给了某些医学基础学科的革命性变化，并给医药工业开辟了更为广阔的心领域。

自1982年全世界第一个基因重组医药产品“人胰岛素”在美国面市以来，至今已有数十个生物技术药物上市。现代生物技术开辟了人体内源性多肽，蛋白质药物的新天地。于此同时它也正渗透到传统医药的哥哥领域，以抗生素，氨基酸，细胞融合及基因工程菌，化学合成药物的生物转化性，到单克隆抗体靶向制剂等等。不久之前美国的Eli Lilly公司又提出了生物技术在医药上的更大应用，是在新药研究筛选方法上的革命，即用基因工程受体实验代替传统的动物实验，所有这一切都表明了医药产业的技术基础正在发生战略性的变革。世界各大医药企业已瞅准目标，纷纷投入巨资围绕以现代生物技术为核心的产品和技术结构开拓，展开了面向21世纪的空前激烈的竞争。基因药物的前沿技术及部分基因药物

基因药物的直接体内基因治疗发展迅速,新型基因药物不断产生。现着重介绍对效果比较肯定关于基因药物的几项前沿技术，基因疫苗、反义RNA 药物、三链DNA 药物这三种新型基因药物技术的基本方法。1.1基因疫苗

基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的给药途径,目前使用的方法有以下几种:（1）裸DNA 直接注射:将裸质粒DNA 直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。

（2）脂质体包裹DNA 直接注射:包裹DNA 的脂质体能与组织细胞发生膜融合,而将DNA 摄入,减少了核酸酶对DNA 的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。

（3）金包被DNA 基因枪轰击法:将质粒DNA 包被在金微粒子表面,用基因枪使包被DNA 的金微粒子高速穿入组织细胞.。

（4）繁殖缺陷细菌携带质粒DNA 法:选择一种容易进入某组织器官的细菌,将其繁殖基因去掉,然后用质粒DNA 转化细菌,当这些细菌进入某组织器官后,由于不能繁殖,则自身裂解而释放出质粒DNA。1.2反义RNA 反义RNA 指与mRNA 互补后,能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达,具有特异性强、操作简单的特点,可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病,反义RNA 治疗的基本方法有： 1)反义寡核苷酸：体外合成十至几十个核苷酸的反义寡核苷酸或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列,用脂质体等将反义寡核苷酸导入体内靶细胞,然后反义寡核苷酸与相应mRNA特异性结合,从而阻断mRNA 的翻译。

2)反义RNA表达载体:合成或PCR 扩增获取反义RNA 的DNA ,将它克隆到表达载体,然后

将表达载体用脂质体导入靶细胞, 该DNA 转录反义RNA ,反义RNA 即与相应的mRNA 特异性结合,同样阻断某基因的翻译。

反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。有报导，用反义封闭胰腺癌、肺癌的癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。1.3三链DNA 脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA 专一性序列结合,形成三链DNA ,来阻止基因转录或DNA 复制,此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA 形成脱氧寡核苷酸(TFO)。为了与作用在mRNA 翻译水平的反义RNA 的反义技术相区别,将三链DNA 技术称之为反基因技术。

基本方法与机理

设计合成15～40个碱基的脱氧寡核苷酸, 这些序列具有较短而兼并性较高的特点, 与双链DNA结合,通常结合在蛋白识别位点处,形成三链DNA ,干扰DNA与蛋白质的结合, 如转录激活因子, 从而阻止基因的转录与复制。1.4部分基因药物

生物技术的开发迅猛异常、日新月异。生物技术的核心是基因工程, 基因工程技术 最成功的是用于生物治疗的新型药物的研制。已有近50 种基因工程药物投入市场, 产生 了巨大的社会效益和经济效益。生物技术用于疾病的预防和疑难病症的治疗已经成为现 实。基因药物主要为以下几个系列：

（1）干扰素系列(IFN)IFN是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，仅在同种细胞上可发挥作用。根据其来源、理化及生物学性质的不同，可分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ 3种干扰素。干扰素具有很强的生物活性，主要表现在：

①抗病毒作用 目前慢性丙型肝炎的治疗以IFN-α为首选。②抗肿瘤作用。③免疫调节作用。

（2）白介素系列 白细胞介素是非常重要的细胞因子家族，现在得到承认的成员已达15个；它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。

（3）集落刺激因子类药物(CSF)一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落，这些因子被命名为集落刺激因子，根据其作用对象，进一步命名分为粒细胞-CSF，巨噬细胞-CSF，粒细胞和巨噬细胞-CSF及多集落刺激因子。

（4）其他基因工程药物

①促进红细胞生成素 促红细胞生成素(Epo)是一种调节红细胞生成的体液因子，自从成功地克隆人类Epo基因后，其产物重组人促红细胞生成素被成功用于治疗肾性贫血及肿瘤等疾病伴发的贫血。最近的研究认为Epo是一种由缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor，HIF)家庭诱导产生的多功能细胞因子超家庭成员，对于多种器官都有保护作用。有报导，Epo能通过降低肾IRI时MDA、IL-6水平，增加SOD水平从而发挥保护作用，而最新研究还表明Epo有促进血管生成的作用。

②人生长激素人类的生长激素(Growth hormone，GH)是一条单链、非糖化、191个氨基酸合成的亲水性球蛋白，分子量21700Da，等电点pI为4.9.人生长激素具有促生长、促进蛋白质合成、对脂肪、糖、能量代谢有影响。

③人表皮生长因子 皮肤细胞表达10种以上的生长因子，它们以自分泌和旁分泌的方式对细胞自身和邻近细胞进行多种调节。

④重组链激酶 对心脑血管疾病有一定的疗效。

⑤肿瘤坏死因子 研究表明，巨噬细胞是产生TNF的主要来源。当肝、脾等网状内皮系统受到刺激后，借助于脂多糖的帮助，TNF基因开始转录，产生并释放TNF。同时B淋巴细胞也

产生一种与TNF类似的淋巴毒素，并与TNF享有共同受体。为了便于区分二者，将巨噬细胞产生的毒素称为TNF—α，淋巴细胞产生的毒素称为TNF-β。

TNF-α是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，它能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响，能抑制肿瘤细胞的增殖并促使其溶解，还可激活机体的抗肿瘤免疫反应。但是由于TNF-α能被肾快速排泄和各种蛋白酶分解作用，在体内很不稳定，半衰期很短(15～30min)，而杀伤肿瘤细胞需要12～36 h。若希望通过静脉给药获得明显的抗肿瘤效果，则必须频繁大剂量注射，进而导致严重的不良反应。目前国内外学者对其的制剂研究主要集中在高分子化学修饰和药物载体传递系统两方面．无论采取何种手段，其最终目的有二：一是减少RES的摄取，延长药物血中半衰期；二是提高药物的靶向性，降低不良反应.国外基因工程药物研究开发现状和展望

据不完全统计，欧美诸国目前已经上市的基因工程药物近100 种，还有约300 种药物正在临床试验阶段，处于研究和开发中的品种约2 000 个。近两年基因药物上市的周期明显缩短，与一般药物研究开发相比，基因工程药物研究投入较大。

美国作为基因重组技术的发源地和众多基因工程药物的第一制造者，每年在基因工程药物研究方面的投资高达数十亿美元，现已成为国际公认的现代生物技术研究和开发的“带头羊”。日本，欧洲等地也不甘落后，都根据各自的特点，制定出符合本国国情的发展战略和对策，进行着激烈的竞争和角逐，就连亚洲的韩国，新加坡等也野心勃勃地着手这方面的研究和开发。

美国：在基因工程药物的研究和开发方面美国一直保持着世界领先地位。从1971年成立第一家美国生物技术公司到现在已形成拥有1300余家公司（占全世界生物技术公司总数的2/3的令人注目的产业规模，不过短短25年的历史，到1996年8月美国有20多种基因工程药物和疫苗上市。（详见表1）另有113家美国公司的284个产品处于临床试验阶段或等待FDA批准，呈现了强劲的发展势头。

日本：日本在基因工程药品的研究和开发方面也投入了大量资金，并取得了丰硕成果。现已开发出干扰素，乙肝疫苗，人促红细胞生产素，组织纤溶酶原激活剂，人生长激素，人胰岛素，人巨噬细胞集落刺激因子，人粒细胞集落刺激因子等众多产品。国内基因工程药物研究开发现状及展望

我国生物工程药物研究虽起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视。为跟踪世界新技术革命迅猛发展的浪潮，1986年3月我国一批著名科学家倡导起草了“高技术研究计划”——“863计划”，并将现代生物技术列为“863计划”最优先发展的项目和国家“七五”，“八五”攻关项目。经过广大科技工作者的艰苦努力，已取得了鼓舞人心的进展，一批基因工程产品的上游研究正在努力展开；一些产品正逐步进入开发研究阶段，不少产品已步入临床试验阶段或已获新药证书，进入工业化生产，详见表2。

与传统制药相比，生物制药有便于大规模生产、利润高、生产工艺简单、人力投入少、无污染、生产周期短等优点，因此，随着人类基因组计划的实施和科技水平的进一步发展，基因药物在医药市场的比例也将会日益提升，也将越来越影响人类的生活。

基因药物同时具有高投入、高收益、高风险、长周期的特征。Frost&Sullivan公司的一份最新报告指出，2004年，全球生物制药市场的收入为450亿美元。到2011年，其有望达到982亿美元。据预测，全球第一个用转基因植物生产的生物药物可望于2005～2006年上市。随着公众认知度的提高和相关法规的逐步完善，用转基因植物生产生物药物的市场将飞速增长，到2011年，单美国市场就将达到22亿美元。2002年底到2003年5月间一场突如其来的SARS疫情，再加上2005禽流感病毒传播，席卷了亚洲及加拿大等地。在紧张而又严肃的应对

这场疫情的过程中，生物制药又成为医药行业人士关注的焦点。

我国生物制品需求巨大，过去的几年我国企业一直能保持年均15％以上增幅，并且近年来销售的增长速度有加快的趋势。据统计，2005年国内生物制品销售收入总额为157．4亿元人民币，销售利润总额为38.7亿元人民币。预计到2006年生物技术工业总产值将达400亿到500亿元，到2015年总产值可达1100亿到1300亿元。我国的生物制药业将进入一个快速发展的阶段,生物医药工业将成为医药产业增长最快的部分。目前,我国许多省市已将生物制药作为本地的支柱产业重点扶持。一大批生物医药科技园相继在各地高新技术开发区建成。面对入世带给我国生物制药业的挑战和机遇,专家们预测,在未来若干年,我国的生物制药业将以超过全球平均增长速度步入高速发展轨道,前景十分广阔。

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第五篇：基因工程及其应用说课稿

《基因工程及其应用》说课稿

一、说教材

1．教材的地位和作用

《基因工程及其应用》是人教版生物必修2第六章第二节内容。本节的教学内容是在学生对基因有一定的理解的基础上，引入基因工程，让学生了解基因工程在生活中的运用，激发学生的求知欲。在教学内容的组织上体现了学科内在逻辑性与学生认识规律的统一。这一节主要讲述了基因工程的原理、基因工程 的应用以及转基因生物和转基因食品的安全性三个 方面的内容。基因工程的原理既是学生进入高中以来第一次接 触到的生物工程方面的内容。为了避免与《现代生物科 技专题》模块中基因工程的内容重复，教材没有过 多地展开介绍。其地位更是由《课程标准》上的了解层次上升为 《考试说明》上的理解层次，其重要性显而易见。

2.教学目标

根据本教材结构和内容分析，结合着学生的认知结构及其心理特征，我制定了以下的教学目标：

(1)、知识目标：掌握基因工程的概念、原理及安全性问题；基因操作的工具及其操作过程。

(2)、能力目标：培养学生分析、推理、归纳、总结的能力。

(3)、情感目标：培养学生实事求是的科学态度，从微观到宏观，从现象到本质的科学的研究方法；培养学生严谨的学习态度和思维习惯。

3.说教学的重、难点

本着高二新课程标准和考试大纲，在吃透教材基础上，我确定了以下教学重点和难点(1)、教学重点

基因工程的基本原理及安全性问题、基因操作的工具，基本步骤及其应用。(2)、教学难点

基因工程的基本原理，基因工程的应用及其安全性。

4.课程资源的开发及有机整合：本节课安排2课时，应当充分利用学生已有的知识经验和网络条件学习本课知识。

二、说学法：本节课的授课对象是高二的学生，此年龄段的学生求知欲望强，因为本节知识难度不是很大，学生将通过多种途径，如：观察、阅读、思考、分析、讨论、实践等等，来开展学生之间的协作学习和自主学习，形成以学生为主体的教学模式。

三、说教法

围绕本节课的教学目标、教学重点和学生情况的分析，采用了观察法、演示法、讨论法、实践法等多种教学方法，积极创设一个可以让学生在轻松愉快的氛围中，去主动探求知识的过程。在教学过程中，开展师生互动、生生互动，体现出以学生为主体，教师为主导的主动探究式教学理念。

四、说教学过程

在这节课的教学过程中，我注重突出重点，条理清晰，紧凑合理。各项活动的安排也注重互动、交流，最大限度的调动学生参与课堂的积极性、主动性。

1、导入新课： 提问：各种生物间的性状千差万别这是为什么呢?

引导：生物体的不同性状是通过基因特异性表达而形成的。

列举：几种生物的不同性状：蚕吐出丝；豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气；青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素。

提问：人类能不能改造性状？能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？ 引导：让禾本科植物能够固定空气中的氮气；能否让细菌“吐出”蚕丝；让微生物生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物。（这种设想能实现吗？）定向改造生物的新技术——基因工程。

2、讲授新课：（1）基因工程的原理

指导学生阅读教材P102页第二段，通过提问的方式指导学生找出概念中的关键词语，并让学生理解基因工程概念，引导学生独立完成。最后归纳列表，便于学生的记忆。概念：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。（2）基因操作的工具

利用多媒体课件演示抗虫棉培育过程示意图，同时提出讨论问题，进行分组讨论，最后交流讨论结果，教师进行归纳总结。

思考：在以上的基因工程培育的过程中，关键步骤或难点是什么？

引导：关键步骤的完成过程中都要用到基因操作工具，并使学生形象地记忆“工具”的作用。A基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）。

要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性未端 B基因的针线——DNA连接酶

用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？

限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？ C基困的运输工具——运载体

大家一起思考下这些工具到底怎样操作才能完成基因工程的过程呢？ 思考题： 简要归纳基因工程操作的基本步骤和大致过程。

启发学生思考：想像科学家在分子水平上进行这一操作的精确性。

(3)基因工程的应用。

学生阅读教科书P.104的内容。教师总结，并从具体事例引入关于转基因生物和转基因食品安全性的争议，启发学生对其安全性问题进行讨论。

3、课堂小结，强化认识。

复习基因工程操作的基本步骤和重要工具，完成课后习题

4、板书设计 基因工程操作的基本步骤： 剪切→拼接→导入→表达

结束语：

本节课设置了一系列问题情境，层层设问，在学生答问、质疑、讨论过程中让学生建构新概念和新的知识体系，并通过教师及时掌握反馈信息，适时点拨、调节，让学生在推理判断中培养良好的思维习惯和对知识的迁移能力，而且通过留出一定的时间让学生提问，体现了以学生为主体的思想。我的说课完毕，谢谢大家。