质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

第一篇：质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定

一 目的学习质粒的酶切及电泳分析。二 原理

限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

三 试剂与主要仪器

（一）试剂

1．EcoRⅠ酶 2．λ DNA

3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍 4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

5．溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6．琼脂糖

（二）仪器

1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱

四 操作步骤

（一）质粒DNA酶切

1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。

管 号

质粒DNA EcoRⅠ/ μl

酶切Buffer（10×）/ μl ddH2O/ μl RNA酶

① 102 8

② 10 1 2 7

③ 10 1 2 6 1

2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl Loading buffer。

（二）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65℃时加入2 μl EB，混匀。胶板制备将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。加样每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。1-2㎝处时，停止电泳。观察及照相将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。

第二篇：质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验报告-2015级预防医学-第2实验室

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级： 2015级预防

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定

实验地点 指导老师

教师签名

第二实验室 实验日期 2016-12-1 合作者 评分

一、实验目的

批改日期

1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2.掌握碱裂解法提取质粒的方法

3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作

二、实验原理

1.PCR反应：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链；降低溶液温度使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异。在pH高达12.6的碱性条件下，细菌线性染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，而质粒DNA大部分氢键也断裂，当pH调至4.8的时候线状染色体DNA片段难以复性而成缠连网状结构，与变性蛋白质与细胞碎片缠绕在一起而沉淀，而质粒DNA双链又恢复原状，并溶解于液相中。

3.离心层析柱：硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

4.紫外光吸收法：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，而且物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。

5.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。

三、材料与方法：

材料与仪器：

PCR反应：PCR仪、加样枪、菌液（大肠杆菌DH5a菌株）、引物、2×Premix Taq、灭菌去离子水；

质粒DNA的提取与鉴定：台式离心机、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α、AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒、溶液 P1（S1，50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)、10 mmol/L EDTA(pH8.0))、溶液 P2(S2，0.2 mol/ L NaOH、1% SDS）、溶液 P3（S3，5mol/L 乙酸钠 60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml）、去蛋白液 PE（W1)、漂洗液 WB(W2）、洗脱液 EB（Eluent)；

紫外光吸收法：比色杯、紫外分光光度计；

酶切鉴定：无菌水、10×M酶切缓冲液、质粒DNA（来自质粒DNA提取步骤）、Hind III(15U/ul)、EcoR I(12U/ul)琼脂糖凝胶电泳：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000

实验方法：

煮菌，PCR（PCR程序最后设4℃保温）

↓约2小时收集PCR产物

质粒DNA提取（约1小时）

↓ 紫外检测定量

↓ 酶切步骤 ↓ 酶切约1~2小时

↓

电泳（样品：质粒DNA，PCR产物，酶切产物，Marker）

↓约30分钟 观察电泳结果、记录、拍照、保存

1.PCR反应：

菌液煮沸10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清

↓

取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪分别加入各试剂

↓

在PCR仪中94℃预变性5分钟后开始循环（94℃30 秒，50℃30 秒，72℃↓(循环30次)72℃ 5 分钟，4 ℃ 保温

2.质粒DNA提取与定量）1min

取1.5ml培养物加入Eppendorf管中

↓

9000rpm×30 s，弃上清

↓

加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮

↓

加入250μl 溶液S2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮

↓

加入400μl 溶液S3，立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心10min，小心取上清液（700-800μl）

↓

将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液

↓

加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液

↓

向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2，13000rpm离心1min，弃滤液

↓ 重复步骤8一次

↓

空柱13000rpm离心2min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发

↓

取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-100μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用

酶切鉴定：

在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入试剂

↓

移液枪轻轻混匀,37℃水浴1.5h 琼脂糖凝胶电泳：

将PCR、酶切及提取的质粒DNA分别点样入凝胶电泳槽中

↓ 电泳 ↓ 取出观察并拍照

四、结果与讨论：

结果：在本次实验中，三种产物从左到右为酶切产物，质粒，PCR,如图1；

图1 在质粒DNA的提取中，经第一次离心过后的样品中沉淀附着于EP管壁下方；而在对提取的质粒DNA进行纯度鉴定时，可根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280），Ratio= 1.8表示DNA样品较纯,符合实验要求，Ratio＞1.9表示有RNA污染，而Ratio＜1.6则表示有蛋白质或其它杂质的污染，我们所测得的A260与A280的比值分别为1.82，1.79，1.75，如图2、3、4.图2

图3

A280 0.026 0.022 0.017 0.022

图4

Ratio(A260/A280)1.82 1.79 1.75 1.79

测量次数 质粒DNA的浓度（ug/ml）A260 1 2 3平均值 119.5 100.5 73 97.67

0.048 0.040 0.029 0.039 进行琼脂糖凝胶电泳后制版上呈现颜色不同且移动路程不同的点，如图。

讨论：我们组的DNA纯度较纯，Ratio值为1.79，但未达到1.8，说明混入了蛋白质或其他杂物，有可能是在吸取上清液的时候吸入了蛋白质或者是在操作过程中操作不当，引入了污染物；也有可能是，因为前面的同学在进行紫外分光光度法测DNA的浓度及Ratio时用手多次接触比色杯的光滑面，造成了后来我们的实验数据有错误。每组质粒DNA的浓度都大于55ug/ml，说明DNA浓度较纯。

从琼脂糖凝胶电泳的实验结果来看我们组做的PCR反应及酶切鉴定都很成功，美中不足之处是质粒DNA的浓度不够，现象不是很明显，说明我们没有尽可能的吸取上清液，导致DNA含量不足。思考题：

（1）在碱裂解法提取质粒DNA时，溶液1的作用是：葡萄糖悬浮细胞，EDTA鳌合金属离子使DNase失活；溶液2的作用是：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，使核酸和蛋白质变性；溶液3的作用是在酸性条件下使质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，而Na则可中和DNA。

（2）为了提高限制性酶切的反应效率，应保证DNA的纯度，DNA样品中应不含有蛋白质、金属离子等杂质，选择合适的反应容器，并应在合适的pH、温度下进行实验及保证适当的酶浓度。＋

第三篇：DNA亲子鉴定分析及方案

前言：为什么要谈亲子鉴定可行方案呢，亲子鉴定近来很火，火也就是说明做亲子鉴定的人有很多。那么因此做亲子鉴定时会面临很多问题。为此，我们就来探讨一个全面、稳妥的亲子鉴定方案。

由上海亲仁亲子鉴定中心提供的数据表明，亲子鉴定中50%做的是个人亲子鉴定，也就是占一半左右，司法鉴定和胎儿鉴定分别占25%。该中心还透露了一条消息，胎儿鉴定每年都在逐渐上升。

那么为什么个人亲子鉴定占的比例有这么大呢？原因很显示，相对司法鉴定的复杂流程，做个人鉴定不需要提供任何身份信息，上海亲仁亲子鉴定负责人谈到这方面时说到：“做个人亲子鉴定的不需要提供任何身份信息，完全可以匿名做，只需要客户提供联系方式用来通知结果以及快递报告就行。而司法鉴定就得本人及鉴定人到我们中心来拍照由法医亲自取样。”

通过以上说明来分析，可知个人亲子鉴定为何占有这么大的比例。下面我们具体来分析并制定亲子鉴定的解决方案。

亲子鉴定按照类型分类：

一、个人亲子鉴定：

优点：可以完全匿名，样本可以自行取样，样本可快递到鉴定中心。

缺点：鉴定报告没有任何法律效力，报告不可用于任何司法用途，结果只做自己了解。

说明：鉴定结果的准确性与司法报告完全相同。

二、司法亲子鉴定：

优点：鉴定报告可以用于报户口、打官司、移民公证等，受国内公、检、法、司四大司法部门认可采信。

缺点：需要本人到鉴定中心取样拍照，需要实名做。

说明：司法鉴定的报告由3-5名法医签名盖章，司法鉴定与个人鉴定不同的也就是这个盖有法医的章。但是结果是一样的。

三、胎儿亲子鉴定：

说明：胎儿亲子鉴定一般是怀孕2个半月到7个月做，超过这个时段就不好做了。最佳时间是2个半月--6个月。

具体方案制定分析：

一、鉴定结果用途：

A：自己了解一下情况的：一般是做个人亲子鉴定。

B：鉴定报告用于司法用途：如上户口、打官司、公证移民、财产分割等所有需要用于公检法司部门的，一定要做司法鉴定。

C：先看结果如果结果对不上需要打官司的：推荐做司法鉴定，也可先做个人鉴定后，如果结果不是自己的可以再做司法鉴定。

二、鉴定人年龄：

A：未出生的胎儿：胎儿鉴定时间是2个半月到7个月间，最佳时间是2个半月到6个月，胎儿鉴定是有一定的流产风险的，超出这个时间不建议做胎儿鉴定。

B：5岁以下、70岁以上：一般用血液样本。

亲仁亲子鉴定中心400-660-2922

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亲仁亲子鉴定分点：

上海亲子鉴定 http://

深圳亲子鉴定 http://

胎儿亲子鉴定 http://

厦门亲子鉴定 http://

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第四篇：DNA粗提取及鉴定教案

《DNA粗提取及鉴定》

一、学习目标：

学生通过对本节内容的探究学习：能

⑴了解DNA的物理化学性质。⑵理解DNA粗提取与鉴定的原理。⑶掌握DNA粗提取及鉴定方法，⑷利用DNA的性质进行实验分析和实验设计。

二、本节内容学习的重点：DNA的粗提取和鉴定原理、方法。

难点：DNA的粗提取和鉴定原理、方法。

三、自主探究

（一）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、提取生物大分子的基本思路？

2、提取DNA的基本思路？

3、用文字和坐标曲线描述DNA的溶解性；并思考该问题在DNA粗提取中将有何应用？

4、DNA在酒精溶液中的溶解性

5、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性

6、如何来进行DNA鉴定

自主探究

（二）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、进行DNA粗提取应选择什么样的材料；你的选择的理由？

2、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

3、如何破碎植物细胞，并获取含DNA的滤液；请举例说明，并告诉自己应注意什么？

自主探究

（三）（阅读教材、学案；探究下列问题）

去除滤液中的杂质

1、此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

2、方案一中为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

3、方案二与方案三的原理有什么不同？

自主探究

（四）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、DNA析出的原理，DNA析出物是什么颜色？

2、DNA鉴定需要设置对照吗？要注意什么问题？ 四：

讨论

（一）你帮助、我改正；我质疑，共提升

小组内讨论自主探究内容并自行改正

讨论

（二）你我同思考，细总结，共同突破难点

小组内讨论：总结

1、本实验的实验原理

2、DNA粗提取与鉴定过程

3、此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出？分别在哪一步？

五：

小组间质疑，完善 六：课堂小结

七：达标检测；当堂掌握 知识拓展：课下思考总结：

1、在我们的高中生物学习中有颜色反应的实验有那些？

2、DNA在不同浓度氯化钠溶液中溶解度的变化曲线还能表示那些量的关系？

3、还有那些实验中用到了酒精，他们的作用是？