第一篇：玫瑰花组织培养实验计划
玫瑰花组织培养实验计划
第一组：杨旺，唐龙，肖龙，陈林，高举，沈文涛
实验用品：
解剖刀 镊子 组培瓶 烧杯 容量瓶 ms培养基 玫瑰花嫩芽等。
外植体选取：
对于外植体选取。一般而言，在材料休眠末期或萌动前期选取外植体较为有利。从生长在田间或盆栽的优良品种植株上，选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎，表面污染较为严重，难于消毒。在取材前两三～周，最好将母株置于温室内培养，不要给它喷水。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体，对于玫瑰花我们可以选花苞，嫩芽。
外植体的选取：
取玫瑰外植体，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～02%的HgCl浸泡5～15min。用无菌水清洗7～10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒。消毒灭菌完毕后，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中[2]。升汞处理的时间长短对玫瑰茎尖和灭菌效果有较大影响，处理时间过长易使外植褐化甚至死亡，过短影响灭菌效果且污染率高。实验表明以升汞处理5分钟效果最好，灭菌成活率可达80％。
MS培养基的配制：
第二篇：《园艺植物组织培养实验》教学大纲
《园艺植物组织培养实验》教学大纲
课程编号：131010418s 适用专业：园艺专业 学时数：9 学分数：0.5 执笔者：董华芳
编写日期：2006年8月
一、课程的性质和目的
《园艺植物组织培养实验》园艺专业的必修课程，本课程任务是教授植物组织培养基本实验技术及基础理论，并培养学生运用所学知识和实验方法进行实验研究的能力，为学生以后从事相关工作或研究打下坚实基础。
二、课程的教学内容要求及学时分配
实验一 玻璃器皿、用具和器械的洗涤和灭菌（1学时）
内容要求：
学会正确洗涤玻璃器皿、用具，使之达到实验的要求；学会正确使用高压灭菌锅，并对玻璃器皿、用具和器械的进行正确的灭菌。
教学要求：
掌握洗涤实验用具和高压灭菌的正确方法。实验报告的要求：
写出洗涤实验用品的步骤和正确使用高压灭菌的方法。
实验二 母液的配制（2学时）
内容要求：
学会使用1/10000精度的分析天平和电子天平。
学会正确配置贮备液，包括药品的溶解、混药的顺序。教学要求：
掌握贮备液的配置方法。实验报告的要求：
写出配置贮备液的正确步骤并说明此实验应该注意的问题
实验三 培养基的配制（2学时）
内容要求：
学会熬制培养基。
学会正确分装培养基及封口培养瓶。
培养基的正确灭菌。教学要求：
通过培养基的正确配置及灭菌，使我们对培养基的成分与性质更加清楚，从而更好的利用它。
实验报告的要求：
（1）写出配置培养基的正确步骤
（2）试比较培养基的灭菌和玻璃器皿的灭菌有什么不同。
实验四 植物茎尖快速繁殖技术（4学时）
内容要求：
要求学生掌握植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植体的消毒、接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。教学要求：
掌握茎尖剥离技术。实验报告的要求： 写出植物快速繁殖的程序和操作方法，包括外植体的消毒、接种、继代培养及污染原因的分析及控制方法。
三、课程成绩的考核办法
实验成绩是由实验指导教师依据学生在实验中的表现，实验完成情况以及撰写实验报告情况等综合评定。每次实验成绩评定等级依次为：A、B、C、D等。
四、参考教材
1.《园艺植物离体培养学》，陈振光主编，中国农业出版社，1996年 2.《园艺植物组织培养实验指导书》，姜玲编, 1992年
第三篇：铁皮石斛 组织培养 栽培 试验 实验
铁皮石斛茎段组织培养与栽培
摘 要: 为试验铁皮石斛茎段组织培养与栽培，以铁皮石斛茎段为外植体，结合铁皮石斛的生物学特性，综述铁皮石斛组织培养与栽培的过程技术。观察研究基本培养基、天然附加物和植物生长调节剂对铁皮石斛生长的影响。验证和探究铁皮石斛茎段组织培养技术并对铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术进行了思考与展望。关键词: 铁皮石斛;组织培养;茎段;移栽;驯化 0.引言
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw．)多年生草本植物，又名黑节草，俗称铁皮枫斗，分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东和广西等地，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高达21.7%，能显著提高机体免疫功能，具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤等功效。现代药理学研究发现，石斛还具有抗衰老和扩张血管的作用。
铁皮石斛喜荫凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树干和岩石缝隙中。由于其药用价值高、生长条件特殊和分布受局限，且经长期人为采挖，野生资源濒临灭绝。铁皮石斛是2005版《中华人民共和国药典》收载的3种石斛属植物之一，为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低，是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物.。
铁皮石斛自然繁殖力极低, 常规繁殖又较困难, 且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量, 野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。由于药用价值高，人为的过度开采与生态破坏，野生铁皮石斛已濒临灭绝，1987年国务院将其列为国家重点保护植物。1 材料与方法 1.1 试验材料
野生云南铁皮石斛，取材于浙江农林大学组培实验室，取其茎段作为外植体进行组织培养。1.2 试验方法 1.2.1 外植体消毒
取铁皮石斛的茎，去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含 3 ～ 4 个节点的茎段，保留节点。依次用中性洗涤剂清洗，自来水冲洗 20min，用 70% 的乙醇浸泡 10 ～ 60 s，再转入 0.1% 的氯化汞中，灭菌 5 ～11 min 后倒去氯化汞溶液，用无菌水反复漂洗材料 3-5 次。用无菌纸吸去茎段上多余水分，将其切成 1 ～2 cm 带一个芽点的茎段，接种到培养瓶中培养。1.2.2 培养基制备
铁皮石斛培养基均添加 3% 蔗糖，0.7% 琼脂，pH 值为 5.8。按不同目的在基本培养基中加入 6-BA、NAA、IBA，每个培养瓶分装 50 m 培养基，密封。经过 121 ℃高温灭菌 25 min。不定芽的诱导培养基是在基本培养基 MS 中加入细胞分裂素和生长素，采用不用浓度水平的 NAA 和6-BA。组培苗的壮苗与生根，将生长状态稳
定的试管苗接种于添加不同激素组合的 1/2 MS 培养基上。(1)诱导培养基: ①MS+6-BA0.5mg／I。+NAA 0.05mg／L+AC(活性炭)29／L；
②MS+6-BAl．0mg／L+NAA0．1mg／L+AC29／L。
(2)增殖培养基: 花宝3号39／L+6一BA2．5mg／L+NAA0．25mg／I。+AC29／L。
(3)生根培养基:1／2 MS+IBA0．5mg／L+AC29／L。培养基中添加蔗糖209／L，pH5．2～5．4 1.2.3 培养条件
接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养，培养温度为(26 ± 2)℃，光照 14 h/d，光强1 500 ～ 2 000 lx。1.2.4诱导培养
用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基①中进行培养。15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织。继续培养20天后，转入培养基②中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物。
1.2.5增殖培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖培养基中，原球茎增殖速度很快，增殖倍数可达3～4倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行。
1.2.6 生根培养
取诱导形成的不定芽，要求芽高2 ～3 cm，带3 ～5片叶的不定芽，将其接种到不同处理的生根培养基上，进行培养。培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。
2.移栽与驯化 2.1移栽前的准备 2.1.1炼苗
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可炼苗。移栽前先将瓶苗至炼苗房进行2~3周的炼苗，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的环境过渡，慢慢适应自然环境，等瓶苗生长健壮、叶色正常，根长3cm以上，肉质茎有3~4个节间、长有4~5片叶，叶色正常，根长3cm以上，有4~5条根，根皮色白中带绿，无黑色根，无畸形，无变异。炼苗目的：
炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。炼苗方法：
1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天； 2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天 2.1.2出瓶
组培苗出瓶时，打开瓶塞将培养基与小苗一起轻轻取出，整齐放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分别放置。正常组培苗先
在自来水中洗净培养基，特别要洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，再换自来水清洗一次。裸根或少根组培苗经过上述清洗后，还需将小苗根部置于100mg/L的ABT生根粉中浸泡15分钟，以进行生根诱导。污染苗经过清洗后，用1000倍多菌灵浸泡整株小苗10分钟。后期管理得当可有效控制污染的发生。栽种于已灭菌的基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50％～60％、湿度达80％以上的温室中，2个月后，成活率达90％以上。2.1.3基质的准备
移栽铁皮石斛组培苗要选择适宜的基质。铁皮石斛的根是气生根，有明显的好气性和浅根性，因此，要求基质以疏松透气、排水良好、不易发霉、无病菌和害虫潜藏者为宜。可以选择水苔、石灰石、碎砖、树皮、刨花、蕨根、板边、菌糠、木糠等为移栽基质。
铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。移栽后隔5天再浇水效果较好。30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。2.1.4栽培场地的选择
铁皮石斛喜温暖、多雾、微风、清洁、散射光环境，忌阳光直射和曝晒。在移栽过程中要创造条件，为铁皮石斛创造最佳的生长环境。铁皮石斛原产区大多处于温带和亚热带，全年气候温暖、湿润，冬季气温在0℃以上。根据铁皮石斛的生长习性，要考虑场地的光照、温度、湿度、通风等自然因素。笔者认为最好选择在大棚内移栽，而且
要移栽在高架畦，这样容易满足铁皮石斛生长的最佳环境要求，而且很多自然因素容易控制。在建造育苗大棚时要满足以下三个条件：
（1）育苗大棚要通电、通水、通路，要求棚宽6m、长30m、棚肩高107m以上、棚顶高2.8m以上，棚顶覆盖塑料无滴薄膜和70%遮荫度的遮荫网，棚内安装有自来水管，大棚四周和入口装有40目的防虫网。有条件的，棚内还要装有自动或手动控制的喷雾系统（最好既能喷雾，又能喷肥、喷药），这样可以防晒、防雨、防虫、保温、保湿、透气，还能大大减少劳动量。
（2）棚内搭建畦底架空的高架种植畦。可用角钢、砖头、木条或方条等材料作为种植畦的框架，然后铺设孔径为0.3~0.5cm的塑料平板作为栽培基质的支撑面，要求畦宽1~1.2m，畦长度可自定，畦底架空高度30~50cm。种植畦上方装有可随时喷雾的喷头，喷雾饿时间最好能控制。没有条件的，也可以用喷雾器来代替。搭建高架种植畦的目的是为了使水分和透气容易控制，从而为组培苗生长提供最佳水分，保证通风透气，又能同时喷肥喷药，移栽成活率高，大面积移栽时能大大节省劳动力。
（3）在种植畦上铺5~8cm厚的基质，摊平。移栽前用0.3%高锰酸钾或1000倍多菌灵药液对基质喷洒消毒。
2.2移栽
2.2.1移栽时间
移栽最佳季节应为日平均气温在15~30℃时，气温过低或过高均不宜出瓶移栽。一般来说，在铁皮石斛主产地，除了最冷的1-2月以
及最热的7-8月外均可栽培。部分高海拔地区，除了12月至次年3月，其余时间均可栽培。
2.2.2移栽方法
用镊子将组培苗小心取出，洗去培养基后，即可移植到种植畦上。移栽时用手指在基质挖2~3cm深的小洞，轻轻把石斛根部放入小洞，注意不要弄断石斛的肉质根，然后用基质盖好。裸根苗或少根苗最好分开种，以便于管理。移栽密度为500株/m2，株行距为4cm×5cm。2.3移栽后的管理
2.3.1温度管理
人工移栽铁皮石斛组培苗要满足其冬暖夏凉的要求。组培苗生长适宜温度为20~30℃。夏季温度高时，大棚内须通风散热，并常喷雾来降温保湿，每天喷雾3~5次，每次喷雾2~5分钟；冬季气温低时，大棚四周要密封好，以防冻伤组培苗。2.3.2湿度管理
刚移栽的组培苗对水分很敏感，缺水则生长缓慢、干枯、成活率低。而喷雾过多则渍水烂根，温度高、湿度大时还易引发软腐病大规模发生。移栽后一周内（幼苗尚未发新根）空气湿度宜保持在90%左右，一周后，植株开始发新根，空气湿度可保持在70%~80%。种植畦干湿交潜有利于发根长芽。
2.3.3肥水管理
大棚移栽期间的施肥以叶面肥为主。由于石斛为气生根，因此要喷施适宜的叶面肥作为营养液，以供给植株充足的养分，利早发根长
芽。叶面肥可以选择硝酸钾、磷酸二氢钾、腐植酸类等，以及进口三元复合肥和稀释的MS培养基等。一般移栽后一周，植株新根发生后开始喷施千分之一的硝酸钾或磷酸二氢钾，7~10天喷一次，连续喷3次。长出新芽后每隔10-15天喷3‰的三元复合肥等。一般情况下，施肥后两天停止浇水。若空气对流太大，则视基质干湿度适当喷雾补水。
3.病虫害防治
铁皮石斛的主要病害有软腐病、黑斑病、炭疽病等。软腐病发病快，严重时整株腐烂解体呈湿腐状；黑斑病危害叶片，使叶片枯萎；石斛炭疽病危害叶片及肉质茎，受害叶片出现黑色或褐色病斑。针对这些常见病害要加强棚内管理、注意通风透光、适当降低棚内湿度，及时施药并拔出病株带离。铁皮石斛的主要虫害有蜗牛、菲盾蚧、红蜘蛛等。其中，蜗牛是常见害虫，危害幼茎、嫩叶、花蕾和幼果。可用诱杀、人工捕杀或撒石灰、茶麸防治；石斛菲盾蚧寄生于植株叶片边缘或背面吸食汁液，可将集中有菲盾蚧的老枝烧毁或用40％乐果乳油 1 000 倍等喷雾杀灭； 红蜘蛛可通过除周边环境的杂草或喷低毒杀螨剂800～1 000 倍防治。铁皮石斛为珍贵药材，因此铁皮石斛的病虫害防治应尽可能以预防、物理防治和生物防治为主，不用或采用低毒农药；一旦发现有病虫害应及时采取相应措施，避免病虫害情的加重。4.思考与展望
有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。外植体造成的污染
最复杂，也最难控制，其原因可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的。微生物可能是腐生的，也可能是内生的，最难处理的则是内生菌。铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌，从铁皮石斛根中分离出内生真菌约25种，因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难。不定芽诱导和增殖的基本培养基以MS为宜，同时，植物生长调节物质对铁皮石斛的组织培养起重要作用，虽然用量小，但在植物组织培养中使用的激素包括生长素、细胞分裂素等，而 NAA 和6-BA组合常用于诱导不定芽和生根。结果与其他研究报道的铁皮石斛不定芽诱导培养基配方有所不同，可能与培养的石斛品种有关。同时，适宜的接种密度和不同的外植体部位都会对不定芽的诱导和增殖产生一定的影响。试验结果表明，低浓度的 NAA、IBA 对组培苗根系生长具有显著的促进作用，而高浓度的 NAA、IBA 均对组培苗根系生长有明显的抑制作用。适合铁皮石斛组培苗生根培养基为: 1/2 MS + 0.5mg/LNAA，其次为1/2 MS + 0.5 mg/L IBA。
目前，铁皮石斛组织培养的研究大多集中在快速繁殖、扩大繁殖系数等方面，今后应加强铁皮石斛的基础性研究，如共生菌、光照、温度、湿度、栽培基质等对石斛生长发育的影响，从而深入掌握石斛生长发育的营养需求，物质合成与分解等新陈代谢规律，确定铁皮石斛类群生长的最佳生态环境，将研究方向和成果与大田栽培紧密结合起来，才能从根本上解决铁皮石斛培养困难，人工种植困难，产量低等问题。参考文献：
[1] 张治国，刘外，王黎.铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J].中草药23(8): 431.[2] 张治国，刘外，王黎，张玲.铁皮石斛原球茎适合培养基研究[J].中国中药杂志1993,18(1):16.[3] 蒋林,丁平,郑迎冬.添加剂对铁皮石斛组织培养和快速繁殖的影响[J].中药材2003, 26(8):539~541.[4] 刘骅,张治国.铁皮石斛试管苗繁殖降低成本的研究[J].中国现代应用药学杂志1998, 15(3): 15~17.[5] 王立安.铁皮石斛生境小记[J].植物杂志199 0,(4): 29 [6] 王春.石斛兰组织培养及快繁技术研究[J].浙江林业科技2002, 22(2): 38~40, 77 [7] 曾宋君,程式君,张京,等.五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究[J].园艺学报,1998, 25(1): 75~ 80 [8] 郑勇平,王春,俞继英,等.铁皮石斛试管苗移栽技术[J].林业科技开发,2006(6):56~58
第四篇：组织培养课程感想
植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。外植体： 愈伤组织：
一、植物组织的主要特征：（1）在培养容器中进行；
（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；
（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：
（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
三．植物组培的应用 1.植物离体快繁。2.无病毒苗木培养。
3.培育新品种或创制新物种。4.次生代谢物生产。
5.植物种质资源的离体保存。6.人工种子。
1.）实验室包括：准备室，无菌操作室，培养室，温室。2.）器具的灭菌：
1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。
（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150 ℃保温2小时，成本较高。
（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120 ℃ 15－20分钟。
（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌：采用高压蒸汽灭菌。120℃ 15－20分钟。培养基体积越大，灭菌时间越长。
3、不耐高温化合物：采用过滤灭菌，如IAA等。
4、外植体的表面灭菌： 采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分钟）等。杀菌剂中加入几滴吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好。3）无菌操作：
1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。
2、保持超净工作台的洁净：接种前用70％乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70％乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。
3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。
4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。
5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。4）通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S，微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等 有机成分、主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L, 通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。植物生长调节剂、常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：
1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D
2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip
3、赤霉素类：GA3、GA4、GA7
4、脱落酸：ABA
5、乙烯：ETH 碳源、碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在2－5％，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低直接影响形态建成。
琼脂以及其他附加物等。琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在4～10g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80％。
5）培养基的具体步骤：取出母液并按顺序放好，将有机营养物质贮液融化待用；取一只烧杯，放入三分之一左右纯水，将母液按顺序加入并不断搅拌；加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热视其溶解；调ph；分装封瓶；灭菌；冷却取出待用。
1）植物细胞的全能性（Totipotency）即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。
2）分化（differentiation）：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。
3）脱分化（Dedifferentiation）：也称去分化，指离体条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。
4）植物胚胎发生：植物离体培养的细胞、组织、器官产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似合子胚胎发生和发育过程，这种现象称为植物体细胞胚胎发生，形成的类似胚的结构称为体细胞胚或胚状体。1）植物离体培养中再生植株有哪些途径？
根、茎或芽器官的发生可使植株重建。先诱导分化出芽，后形成根较好。（还有先根后芽，先愈伤再根芽）离体培养中再生植株的主要途径有：
器官发生；器官型（直接由外植体的细胞形成器官原基），器官发生型（外植体先形成愈伤组织，再产生器官原基）
胚胎发生（与合子胚的发生过程类似，体细胞胚在形态和生化水平上和合子胚都相似。）2）愈伤组织是如何形成与生长的？
在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。
分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。
生长：诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受伤表面形成一层愈伤组织，细胞数目迅速增多，表层细胞平均重量下降，体积变小；降低温度，可以使细胞生长速度减慢，平均大小可增加。质地类型：松脆和致密两种。高浓度生长素，可使Callus变得松脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密。生理生化变化：次生物质合成能力变化，对激素的需求变化等。3）植物体细胞胚胎发生有哪些途径？
直接途径：指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，如子叶、花序、珠心等外植体。间接途径: 外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织的某些细胞重新“决定”为胚性细胞，进而分化出体细胞胚胎。多数体细胞胚胎通过该途径形成的。通常包括2个阶段：
（1）胚胎发生丛（Embryogenic clump）EC是由液泡小、细胞质浓的小细胞构成。（2）胚状体的发育。将EC转入降低或除去生长素、降低还原氮的培养基上培养即可。
4）影响植物离体形态发生的因素有哪些？
一、植物种类和基因型
1、植物种类不同难易程度不同；被子植物比裸子植物容易。
2、同一物种不同基因型间存在较大差别。
二、培养材料的生理状态
1、发育年龄：一般幼态比老态组织形态发生能力高；
2、培养器官或组织类型：细胞分裂旺盛的器官较好；
3、培养时间和细胞倍性：一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。
三、培养基
1、营养成分
一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。
茎尖培养和芽诱导培养基主要是MS及其修改的培养和B5培养基。
茎尖培养的起始培养基和芽增殖的培养基往往是不同。碳水化合物种类及浓度对胚状体发育有重要作用。缺糖或低糖无法形成胚状体。
2.植物激素及生长调节剂（起主导作用，通过影响内源激素的平衡起作用）
（1）生长素：促进外植体生长、生根，并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长。2，4 – D诱导体细胞胚胎发生。
（2）细胞分裂素：促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。
（3）赤霉素：GA3促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。（4）乙烯：对芽的诱导和形成有促进或抑制作用
（5）脱落酸：对体胚的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生。
3、培养基的性质
（1）愈伤组织诱导：在固体培养基上（胡萝卜、石刁柏）。（2）细胞和胚状体的诱导：在液体培养基上。
（3）诱导胚状体或早期胚状体培养：渗透压，要求高.四、培养条件
1、光照培养条件下，光照的作用是影响细胞的状态，而不是光合作用。连续光照有利于培养细胞维管组织的形成。昼夜光照有利于极性的建立及形态发生。光强一般要求1000-5000lx。植物间有所差别。光照周期为10~16h/日。不同波长光质作用不同，蓝光有利于芽的分化，红光有利于根系发生。
2、温度：大多数培养温度为25±2℃.花药培养低温或高温预备处理。
3、气体：氧气、二氧化碳以及乙烯等气体的浓度和通气状况。
5）、体细胞胚胎发生的两个特点：双极性；母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，处于较为孤立的状态，即存在生理隔离。
第五篇：植物组织培养论文
植物组织培养的发展及其应用
刘兆书、王梦瑶、王瑞雄、尹树明、左通通
（石河子大学，生命科学学院，新疆石河子，832000）
摘要:植物组织培养作为一种有效的技术手段已被广泛应用于生产实践的各个领域。本文从植物组织培养技术的发展，总结了植物组织培养的发展历史及发展现状，重点介绍了组织培养技术在育种和脱毒快繁方面的应用，为今后植物组织培养的进一步发展和应用打下基础。
关键词：植物组织培养；发展；快繁；脱毒；育种
德国的植物生理学家Haberlandt提出细胞全能性理论以后，在无数科学家的努力下，植物组织培养经过近百年的发展历程后，该技术日趋完善和成熟，得到了广泛的应用。随着科学技术的不断发展，研究领域的不断拓展与深入，植物组织培养技术的应用也越发的广泛。育种方面的应用非常广泛，已经形成了一门理论和技术；在工厂化育苗方面，产生巨大的经济及社会价值;同时植物组织培养技术的发展也促进设施农业、食品、工业、医药业等领域发展，现就植物组织培养技术的发展和应用作简单总结。
1、植物组织培养的发展
1.1植物组织培养的发展历史
1838-1839年，德国的植物学家T.Schleidon和动物学家T.Schwann提出细胞学说。1902年德国的植物学家Haberlandt提出:高等植物的器官和组织，具有植物细胞全能性。1904年Harming在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行培养，发现离体胚可以发育成熟，并提前萌发成小苗。1937年White发现了B族维生素，建立了第一个由已知化合物组成的培养基，该培养基被定名为White培养基。同时法国的Gautherer和Nobecourt也发现了B族维生素的重要性，三个人被誉为植物组织培养学科的奠基人。1952年Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得脱毒植株。1953-1954年Muir利用震荡培养和机械方法获得了万寿菊和烟草的单细胞，实施了看护培养，使单细胞培养获得了成功。1957年Skoog和Miller提出生长素和细胞分裂素控制器官形成。1958年英国学者Steward通过体细胞胚胎发生途径获得了人工体细胞胚，这一实验证实了Haberlandt的细胞全能性理论。到20世纪60年代组织培养进入快速发展阶段，在基础理论、实际操作方面不断取得进展，比如在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面取得了可喜的成果。
1.2植物组织培养发展现状
1.2.1国内的研究发展现状 我国的组织培养与国外相比起步相对较晚，但发展却比较快。20世纪70年代我国掀起了单倍体育种的高潮，在作物育种上取得了一些实用性的成果。据不完全统计，目前我国用花药或花粉育出的植物已超过22科52属160种。目前我国组培已经进入了生产阶段，实现了花卉、果树、蔬菜等100多个品种的工厂化生产。花卉出口年创汇达800多万美元。
1.2.2国外植物组织培养的研究发展现状 国外的组培发展的比较快，20世纪70年代在美国形成了兰花产业。80年代后，以商品为目的的组培苗生产量以20%-30%的速度递增，年产组培苗在10万株以上的植物微繁殖公司约占50%，年产量大于50万株的公司约占25%，整个西欧年产组培苗达2亿多株。
2、工厂化植物快繁及脱毒方面的应用
组织培养技术有几乎不受地理环境和季节的限制、遗传背景一致、生长周期短、成本低等诸多优点。同时，结合茎尖培养方法可以去除植物病毒、使植物复壮、提高质量和产量，所以，离体快繁和植物脱毒是目前植物组织培养应用最广泛的一个方面，尤其在兰花、名贵树种、马铃薯、草毒等无性繁殖为主的植物显的更是尤为重要。据估计，目前全球有关生物技术产业的年交易额约为1 500亿美元，其中50%一60%与农业有关。植物组培苗的贸易额约占总额的10%，即150亿美元，并以每年15%速度递增。
在我国，离体快繁育苗技术的开发应用起步于20世纪80年代初。如华乐种苗有限公司，年生产能力在500万株以上兰花克隆苗，主要出口日本、美国、荷兰、德国等，北京杉友兰业生物科技有限公司，年生产能力为350万株兰花克隆苗，连云港振兴恒巨生物科技有限公司，年生产蝴蝶兰克隆苗3 000万株，产品远销欧洲、美洲、亚洲等十多个国家和地区。据不完全统计植物快繁涉及观赏植物、蔬菜、果树、药材等300种以上，其中观赏园艺植物约200种，约占60%。在脱毒方面，如通过脱毒的马铃薯、甘蔗、甘薯、大蒜、草毒、香蕉平均可以增产30%以上，兰花、水仙、康乃馨、大丽花通过脱毒后植株生长势强、花色艳丽、花朵大、产量高。
3、在植物育种上的应用
植物组织培养技术对培育优良作物品种开辟了全新的途径。目前，国内外已把植物组织培养普遍应用于作物育种，并在单倍体育种、胚胎育种、细胞融合育种、细胞突变育种、基因工程育种等方面取得了较大进展。3.1单倍体培养育种
通过对植物的花药、花粉、未受精的子房或胚珠进行组织培养获得单倍体(其中以花药和花粉培养应用最为广泛)，单倍体在培养过程中利用秋水仙素处理，可使染色体加倍，成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。研究表明，常规育种一般需要8-10 天或更长的时间，而通过单倍体进行育种一般仅需要4-5 天的时间，单倍体育种具有程序简单、育种周期短、基因型一次纯合等优点，单倍体育种是常规育种程序和方法的重大改革，尤其在林业等生长周期长的物种中效果更为显著。因此，单倍体育种在国际上引起了很大的重视，各国纷纷开展单倍体育种方面的研究工作。3.2胚胎培养育种
植物的胚(包括成熟胚和幼胚)、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术统称为胚胎培养，其应用领域主要包括胚胎发育机理、克服杂交不亲合、胚胎拯救、克服自交不亲和、克服珠心胚的干扰、打破种子体眠、获得体细胞胚和人工种子等方面，因此在农作物、园艺作物、林木和药用植物上有着广泛应用。
在克服杂交不亲合、克服自交不亲和方面主要通过植物离体受精来实现，在广义上通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等均称做植物离体受精。但严格意义上的离体受精或试管受精是20世纪90年代精、卵离体融合成功。该技术不仅可以克服植物授粉不亲和问题，还可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养，已在玉米、药用牡丹、婴粟、烟草等植物上获得成功。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术，为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统，为开发新的植物转基因途径提供了可能。
胚培养在打破种子体眠应用较为广泛，种子体眠的原因很多，利用组织培养方式打破种子体眠一般有种胚发育不全或种子含抑制物抑制种胚发芽2种情况，如胚乳发育尚不完全的兰科种子可以通过组织培养的方式获得再生植棵，而莺尾属、蔷薇科、野麦等植物可以通过组织培养的方式打破抑制物对种子发芽的影响。另外，胚培养还可以应用于胚胎拯救。
胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株，再经过染色体加倍获得六倍体，从而育出多倍体新品种。目前有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化或器官分化，不少植物已获得了再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、称猴桃等多种植物上得到了胚乳再生植株。同时，胚乳培养产生的混倍体，可用于染色体工程方面的研究。3.3细胞融合培养育种
细胞融合所使用的材料一般是指利用除去植物细胞壁的裸露细胞即原生质体，通过原生质体融合，可克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍，为广泛重组遗传物质开辟了新途径。同时，因去壁后的原生质体消除了核酶等对外源DN A的破坏，为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条伴。另外，在有些没有有性生殖能力或其有性生殖能力很低(如香蕉、木薯、马铃薯、甘蔗等)的植物作物改良中，体细胞杂交具有不可取代的重要性。通过大量的研究认为叶肉组织分离的原生质体较好，遗传性较为一致。在原生质体融合方面主要有物理(如电融合)、化学(如高PIE高钙、聚乙二醇)、生物(如仙台病毒)等融合方式。3.4细胞突变体育种
在研究中发现，通过愈伤组织获得的再生植株中常常出现基因型变异。这是因为无论是愈伤组织还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界环境(如物理因素、化学物质等)的影响而产生诱变。利用这一特点结合人工诱变方法包括物理诱变(Y射线、X射线、电子束、离子束、激光、紫外线等)、化学诱变(甲基磺酸乙醋、秋水仙素、叠氮化钠、平阳霉素、52BU ,EB等)和生物诱变(转座子插入突变、跳跃基因等)获得了一大批植物新品种和新材料。目前，这种方法已筛选出抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的植物突变体。
3.5基因工程育种
通过基因枪或农杆菌进行植物基因工程育种的关键环节之一是建立一个高效的组织培养再生体系。植物遗传转化的理想受体系统应具有高效稳定的再生能力，研究认为用于基因转化的受体系统，应具有80%-90%的再生频率，且每个外植体必须具有能再生的丛生芽，其芽数量越多越好。目前，用于遗传转化的受体主要有二种途径，一是外植体在激素的诱导下产生愈伤组织后再培养成体细胞胚即体细胞胚发生途径，二是诱导外植体产生单极性不定芽后再培养生成完整的再生植株即器官发生途径。目前，与组培技术结合的转基因的方法主要有农杆菌介导和基因枪两种方法。
参考文献：
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