食品微生物实验室操作手册

第一篇：食品微生物实验室操作手册

食品微生物实验室操作手册

介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程 规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。

依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书

1.标准菌的来源

标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC

（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。

2.标准菌的验收

从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。

3.标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备

3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球

3.2培养基

改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。

改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤：

a.打开洁净工作台。

b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。

c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。

d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。

f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。

g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。

h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。

i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。

j．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。

3.4菌种确认

用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。

3.5污染处理

假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培

养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管

3.6菌种的传代与保藏

将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。

菌种的传代保藏过程

3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。

定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：

（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

（2）将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。

（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。

（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。

（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。

（6）取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

（7）将已接种好的细菌管置30～35℃细菌培养箱培养22 ～24h，真菌管置23～28℃真菌培养箱最多培养7天。

当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。

菌种斜面的培养、保藏条件及时间

菌种培养条件及时间培养基保存条件及时间

大肠埃希菌(CMCC(B)44102)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

生孢梭菌(CMCC(B)64941)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

白色念珠菌(CMCC(F)98001)23～28℃ 最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

黑曲霉(CMCC(F)98003)23～28℃ 最多7天改良马丁琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602)30～35℃22～ 24h营养琼脂培养基2℃～ 8 ℃保存3个月

注：菌种斜面1次/周观察状态是否正常。

3.7菌种的使用及销毁

每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。如果要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。

每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有牢固的标签。标明菌种名称、菌种代号、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。

废弃菌种及实验用品废弃物的处理：121℃ 高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行记录。

第二篇：食品微生物检测实验室要求

自来水水池至少有两个，工作台，药品试剂柜，超净工作台（无菌室），灭菌锅，培养箱，冰箱，干燥箱，电子天平，显微镜，平皿，试管，三角瓶等玻璃器皿。这些都是必备基本设备，只要能摆放的下就可以。

一、微生物实验室设计

微生物实验室由准备室、洗涤室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室六部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。

二、微生物实验室基本要求

（一）准备室

准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。

（二）洗涤室

洗涤室用于洗刷器皿等。由于使用过的器皿已被微生物污染，有时还会存在病原微生物。因此，在条件允许的情况下，最好设置洗涤室。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。

（三）灭菌室

灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。

（四）无菌室

无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。1.无菌室的设置

无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：

（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。

（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。

（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。

2.无菌室内设备和用具

（1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。

（2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。

（3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。

（4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。3.无菌室的灭菌消毒

（1）薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。（2）喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。

（3）紫外线照射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射30～60min。

（五）恒温培养室1.培养室的设置

（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4＝14m2左右，外室面积在3.2×1.8＝6m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。

（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。2.培养室内设备及用具（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。

3.培养室的灭菌、消毒 同无菌室的灭菌、消毒措施。小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。

（六）普通实验室

进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。

第三篇：微生物实验室工作总结

微生物实验室工作总结

忙碌的2011年已经走远，总结一年的工作，尽管有了一定的进步和成绩，但在一些方面还存在着不足，个别工作做的还不够完善，这有待于在今后的工作中加以改进。微生物室将逐渐建立建全各项政策规章制度，修正完善SOP文件，努力使思想觉悟和工作效率全面进入一个新水平，新的起点意味着新的机遇新的挑战，可以预料我们的工作将更加繁重，要求也更高，需掌握的知识更多更广。为此，我将更加勤奋的工作，刻苦的学习，努力提高文化素质和各种工作技能，为微生物室的发展做出更大的贡献。一定努力打开一个工作新局面。我将从以下几点做科室总结：

一． 微生物实验室在合理应用抗生素中作用：怎样才能充分发挥微生物检测报告的作用

将经验用药改为根据药敏试验结果合理使用抗生素，从而有效避免耐药菌的产生首先要规范标本的采集：这是病原菌检测正确与否的关键，若标本的采集与处理不符合要求，则细菌培养的结果就没有意义，甚至会给临床造成误导，延误对患者的正确治疗，将造成严重后果。其次是规范化操作程序和加强病原菌的检验提高时效性和准确性，提高病原菌的阳性率和准确率，鉴定出真正的病原菌，有菌部位标本，如痰，咽拭子，粪便等在培养出细菌时面临判断该菌是致病菌还是正常菌群，以免给临床造成误导。一般标本采集到明确检验结果需要3—4天，有是需要更长时间，此时患者的病情可能早已发生了变化。检验报告对临床而言，已失去了相应的价值，为让临床及时了解病原菌诊断情况应积极与临床大夫沟通。最后

二．与临床沟通：临床微生物实验室比其他任何实验室都需要与临床进行良好的沟通，微生物实验室的各种检验数据尤其是药敏试验结果以及病原菌的分离报告只有与临床结合分析才能真正知道我们的价值所在，另外，这种沟通也会导致临床在感染性疾病的诊治方面采取更有效的手段，更合理的应用抗菌药物。

1、从提高自身素质开始，提高整个实验室的整体素质，增加各方面的知识储备以及综合分析能力与判断能力。

2、把好标本采集与接种关，尽可能要求大夫多注明患者情况特别是以往和目前使用抗菌药物情况，不合格的标本尽量要求重新留取。

3、及时与临床大夫沟通，进一步了解病人详细情况。

4、对每一张检验报告都要认真分析，包括分离菌与药敏结果

5、科室交待，细菌标本送检时间，要让他们知道标本一旦留取，要尽快送到细菌室，不能和其他标本一样等到聚到一起送，从而导致无菌变得有菌。

6、有特殊菌生长，先电话通知临床床医生，这样他们可以调整用药。

7、人认为其实药敏结果比具体的细菌名更加重要，我们不需要拘伲于菌名的百分百准确。

三．微生物检测及消毒，灭菌的检测：应做好每月的院感检测为医院感染保驾护航，对某些科室的空气，工作人员手，桌面等细菌学检测出现超标，不能因各种人情关系出现瞒报或漏报的情况。应实事求是上报院感科。

四．明年的计划：新技术和新项目的开展；我院今年成功升入二级甲等医院，随着病原量的增加，我们应克服一切困难，想尽一切办法，积极开展新项目，兼顾经济效应和社会效应，充分发展前期引进的仪器设备的功能，开展临床迫切需要的检验项目，引进新设备：随着微生物实验室细菌量的增加及保证标本质量，明年争取购进：CO2 孵育箱，有条件可购置一台半自动细菌鉴定仪。

总之，2011年是一个收获的一年，我们一定会不辱使命，会不断改进自我，创造一个辉煌的太航医院。

微生物实验室 2011-12-9

第四篇：微生物实验室规章制度

实验室生物安全操作规范

（一级生物安全）

一.在实验期间实验室门需保持关闭状态。二.按规程操作，尽量避免气溶胶的产生。

三.在工作区域内不允许吸烟、进食、喝饮料以及储存食物。四.工作期间需穿工作服、戴手套和口罩。

五.不允许用嘴吸吸液管，应使用机械的吸液设备。六.避免使用皮下注射针。

七.完成实验操作后，离开实验室前需洗手。八.定期消毒工作台，有液体飞溅应立即消毒。

九.生物废弃物丢弃前需消毒，其它污染的原料器材在清洗、再利用或丢弃前也需消毒。

十.污染物应被封口，被耐用的、防漏的容器袋包裹，高压消毒后送到指定地点销毁。

十一.控制昆虫和啮齿类动物的出没。

十二.保持工作区的清洁消毒工作。

微生物实验室工作制度

一.在科主任的领导下，由实验室组长负责安排日常工作流程和工作人员的任务。

二.进入工作室穿工作衣、戴工作帽、口罩，进入无菌接种室应穿隔离衣、裤、帽、口罩、手套，换工作鞋。

三.坚持做好室内室间质控工作，做好室内质控的记录和室间质评的回报工作。

四.收到检验标本应及时处理，严格按照操作规程操作，并及时发出报告。

五.发现有烈性传染的标本应严格做好标本处理后的消毒工作，或转送有关部门处理。发现特殊阳性标本和难以确定的标本结果，应报告组长或主任，讨论后方可填发报告单。六.做好培养基的配制、消毒工作和日常消耗品的准备。七.经常保持工作间的清洁卫生，做好日常标本的污物处理、消毒工作。定时定期做好无菌室的消毒工作。

八.配合临床相关科室做好病房、手术室等的院内感染监测工作，并做好监测资料的记录、统计和分析工作。发现异常，及时报告院内感染管理委员会。九.做好菌种的保存工作。

十.做好每天的工作量统计工作，并做好特殊阳性结果的登记统计工作。做好交接班工作。

第五篇：微生物实验室培养

平陆中学高二生物

课题一：微生物的实验室培养第二课时

车柳顺2.24学习目标：

1、明确配制培养基的步骤

2、说出纯化微生物的方法和步骤

目标一：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

1、步骤：计算→称量→溶化→→灭菌→倒平板。

2、演示倒平板操作

导思：（完成倒平板操作的讨论题1——4）

目标二：纯化大肠杆菌

1、微生物接种最常用的方法是划线法和涂布平板法。

2、平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续分散到培养基的表面。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度，然后将不同稀释度的菌液分别到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

3、总结平板划线法和稀释涂布平板法的操作步骤并演示

（1）平板划线操作：

导思：（完成平板划线法的讨论题）

（2）稀释涂布平板法：

导思：（完成稀释涂布平板法操作的讨论题）

4、平板划线法和稀释涂布平板法的异同点是

目标三：菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用的方法

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用的方法。

自我反思

1、以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是（）

A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

B.将称量好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯

C.将培养皿冷却至50C左右时进行倒平板

D.待平板冷却凝固约5—10min后将平板倒过来放置

2、有关倒平板的操作错误的是（）

A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上

B.将打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰

C.将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上

D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置

3、有关稀释涂布平板法，叙述错误的是（）

A.先将菌液进行一系列的稀释

B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面

C.适宜条件下培养

D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落

4、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）

A.一个细菌、液体培养基B.许多细菌、液体培养基

C.一个细菌、固体培养基D.许多细菌、固体培养基