周四第三组《利用蚕豆微核技术检测牙膏安全性》

第一篇：周四第三组《利用蚕豆微核技术检测牙膏安全性》

利用蚕豆微核技术检测牙膏安全性

前言 ．．

牙膏是现代日常生活中很容易接触到的化学物品。日前，国家质检总局发出《关于禁止用二甘醇作为牙膏原料的公告》，要求今后牙膏生产禁用二甘醇。但是我们还不能确定市场上销售的牙膏不再含有二甘醇。据了解，被检测出含有二甘醇的牙膏有田

七、黑妹、美加净等品牌的相关品种。其他品牌的牙膏是否存在同样的问题呢？药膏中其他化学物品是否也会对人体产生影响呢？基于这两点考虑, 我们应用蚕豆根尖细胞微核测定技术并结合生物量分析, 通过试验以不同浓度的处理液作梯度对照, 测量统计蚕豆种子生物量变化和根尖细胞微核率, 探讨某品牌牙膏的安全性状况。

原理 ．．

微核 是染色体畸变类型之一, 往往是细胞经辐射或化学药物的作用, 由有丝分裂后期散失着丝粒的染色体片断产生的。微核的产生与细胞的内外环境有关, 主要是由于各种具有损伤性的理化因子影响了染色体的结构与功能, 使胞内 DNA 的复制和细胞分裂受到干扰以及纺锤体的形成出现了障碍。

微核试验是以动植物为材料利用细胞生物学方法观察其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法, 也是遗传毒理学常用的试验方法之一。微核率是指生物材料经细胞生物学方法制片后, 在显微镜下观测 1 000 个细胞当中微核细胞所占的比率, 也可以是以每个细胞当中含微核数的平均值来计算。

材料，仪器及用具和试剂 ．．．．．．．．．．．

材料：

蚕豆果实

试剂：

(1)固定液。甲醇 ?冰醋酸按体积比 3 ?1 配制, 现配现用。

(2)70%的乙醇。量取 70 mL 无水乙醇于 100mL 容量瓶中, 加蒸馏水定容至 100 mL。(3)6 mol/ L 的盐酸。取 185.6 mL 浓盐酸(分析纯, 密度为 1.18 g/ mL)于 1 L 容量瓶中, 加蒸馏水定容即可。

(4)卡宝品红(碱性品红)染液。原液 A: 称 3 g碱性品红溶于 100 mL 70% 乙醇中;原液 B: 取 10mL 原液 A 加入 90 mL 5% 的苯酚水溶液中;染色液: 55 mL 原液 B 加入 6 mL 冰醋酸和 6 mL 37%的甲醛。

仪器：

显微镜，镊子，载玻片，盖玻片，吸水纸，培养皿，试管，解剖盘，标签纸，刀片等。

实验内容 ．．．．

（1）浸种催芽: 将蚕豆种子放入盛有自来水的烧杯中, 置室温条件下 浸泡 20~ 30 h, 此期间换水 2~ 3 次, 待种子吸胀后, 用湿毛巾松包裹置解剖盘内, 保持适宜的湿度, 待种子发芽，待种子初生根露出 2~ 3 mm。

（2）染毒:选取发育良好, 根尖长短、粗细一致的种子, 每 5 粒为一个处理组, 吸干表面水分, 称鲜重, 放入盛有受试物的培养皿中, 使液体浸泡根尖（液体配制为5个浓度梯度）。

（3）恢复培养: 将处理的种子用蒸馏水浸洗 3次, 每次 3~ 5 min, 洗净后的种子放入新铺

好湿脱脂棉的培养皿内, 于保持适度的培养条件使根尖细胞恢复 24 h。

（4）根尖细胞固定: 将恢复后的种子, 吸干表面水分, 称鲜重后从根尖顶端切下1 cm 长的幼根用固定液(甲醇 ?冰醋酸= 3 ：1, 体积比)固定 24 h, 置体积分数为 70% 的乙醇中于 冰箱中保存备用。

（5）酸解染色: 固定好的根尖用蒸馏水浸洗两次, 然后用 6 mol/ L 的盐酸在室温解离 8~ 12 min,直至根尖软化, 吸去盐酸, 用蒸馏水浸洗两次后, 浸于水中。

（6）染色制片: 将幼根放在擦净的载玻片上, 用解剖针截除根冠区, 截留下 1 mm 左右的根尖分生区, 滴一滴卡宝品红, 染色 5~ 8 min;加盖一清洁的盖玻片, 注意不要有气泡, 再在盖玻片上加一小块滤纸, 轻轻敲打压片。

（7）镜检: 将制片先置显微镜低倍镜下, 找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相较多的部位,转到高倍镜(物镜 40 ?)下进行观察。凡是在主核大小的 1/ 3 以下, 并与主核分离、着色与主核相当或稍浅的圆形、椭圆形、不规则形小核即为微核。每个根尖观察约 1 000 个细胞, 计录微核细胞数。观察计数时将载玻片沿一个方向移动, 不回看, 以避免细胞被重复计数。

(8)计算微核率, 并进行统计学处理。计算公式如下:(带有微核的细胞数/ 观察细胞总数)1 000;生物量用处理前和处理后的鲜重表示;污染指数 = 样品实测 MNF平均值 / 对照组(标准水)MNF平均值。

实验预期结果 ．．．．．．

蚕豆根尖在2%，4%，6%，8%，10%浓度的牙膏侵染液培养48小时，蚕豆根尖镜检都会出现微核，且微核率随着牙膏侵染液浓度增大而增大。

文献 ．．

【1】陈光荣, 李明, 金波, 等.利用蚕豆根尖的微核技术监测青山湖污染的研究[ J].中国环境科学, 1985, 5(4): 2~ 7.(他们从1983年开始利用蚕豆根尖细胞的微核技术检测了农药和诱变剂损伤,1984年又进一步研究筛选出了对农药更为敏感的蚕豆品种——松滋青皮豆.本文是在原有工作基础上,用蚕豆根尖细胞的微核技术,直接监测湖北省黄石市青山湖的污)

【2】李宏.环磷酰胺诱发蚕豆根尖细胞染色体畸变的分析[ J].渝州大学学报, 1998, 9(3): 28~ 33.(以蚕豆根尖为实验材料，研究了环磷酰胺对间期微核细胞及染色体畸变的作用，并对环磷酰胺的诱变机理进行了分析，提出了环磷酰胺可能通过激发细胞内的自由基反应而导致染色体畸变的观点。)【3】 马军，郑琳等，植物微核在环境污染检测中的应用 【J】自然学报 2007-10-15。（利用这种技术可以检测出有害气体、重金属、有机物等对生物体遗传物质的影响程度,目前已经被广泛地应用于环境中大气、土壤、水体等污染的监测。该文对植物微核技术的原理及其在环境污染监测中的应用作了概述。）

【4】赵吉平，王桂英，刘芳8@羟基喹啉诱发蚕豆根尖细胞异常性的研究〔J〕8 遗传，1996,13

（6)；5-10(本研究采用0.002mol/L和0.004mol/L的8-羟基喹啉(下称8-HQ)处理1.5—2cm的蚕豆根尖3.5小时,给以0—20小时的不同恢复生长期。以低温(4℃以下)处理24小时的相同材料为对照。比较了两种方法在染色体制片中作为预处理方法的效果。结果发现:(1)8-HQ不能有效地积累中期细胞和使染色体凝缩;(2)严重抑制细胞的生长;(3)降低有丝分裂指数(MI);(4)诱发较高频率的微核细胞;(5)产生较高频率的双核细胞;(6)导致多种类型的染色

体畸变以及其他异常性。研究表明,8-HQ 是一种有效的细胞板抑制剂和诱发染色体数目和结构变异较强的诱变剂。)

【5】王娜 蚕豆微核技术监测有机废水的遗传毒性【J】生物技术世界 2012-01-15（用蚕豆根尖细胞微核技术研究有机废水对蚕豆根尖细胞的遗传损伤效应。结果表明:不同稀释梯度的实验室废水对蚕豆根尖细胞的有丝分裂指数、微核千分率及污染指数影响不同,并存在一定的差异。）

【6】 王英彦.蚕豆根尖细胞微核检测技术的现状[ J].环境科学, 1989, 10(4): 661.（蚕豆根尖细胞微核检测技术(VMT)是继紫露草四分孢子微核检测方法,是国内较为普遍用于研究和监测环境致突变物(致癌物)的高等植物间期体细胞遗传检测系统。从方法学到实际应用等各方面已积累较多资料）

【7】] 段昌群, 王焕校.重金属对蚕豆的细胞遗传学毒性作用和对蚕豆根尖微核技术的探讨

[J].植物学报, 1995 , 37(1): 14-24.(对蚕豆根尖细胞遗传学毒性顺序为Ｈｇ２＋ ＞ Ｃｄ２＋ ＞ Ｐｂ２＋ ＞ Ｚｎ２＋ ＞ Ｍｎ２＋。经综合分析，３ 个参数在不同剂量范围下相关性程度有很大的差异。认为蚕豆根尖微核技术检测危险化学品和监测环境污染时取得可靠结果的条件是：受检物质在检测条件下不严重抑制细胞分裂和ＣＡＦ和ＭＣＮＦ呈正相关。)

【8】施金莲, 马桂芝, 蒋葵.化学染发剂和冷烫精的毒性及对人体健康的影响.环境与健(本文通过化学染发剂和冷烫精对大白鼠骨髓多染红细胞、毛囊细胞的微核实验及人群健康影响调查,结果表明化学染发剂、冷烫精具有较强致突变作用,两者同时使用致突变明显增强,并提出研制高效无毒染发剂和加强防护的重要性。)

【9】方宗熙.中美合作研究用植物细胞微核监测环境污染的报告.山东海洋学院学报, 1981;11(1): 1（工业发展经常引起环境污染。环境的污染物对人民健康一般都有不良的影响,引起疾病,甚至可能致癌。因此在工业发展的过程中,对环境的污染情况应该随时进行监测,发现问题,及时处理,以避免人民受害。监测环境污染有几种方法,如化学方法、物理方法、生物学方法等。在生物学方法中,大约在五年前,美国西伊里诺大学马德修教授根据环境污染会引起染色体畸变而形）

【10】曹军建 中国环境科学理论研究及发展【J】环境科学 1993-08-29

（主要介绍20年来中国环境科学基本理论研究及其发展。即大气和水环境科学与环境生态学和环境管理学主要理论研究及其发展。）