小鼠尾静脉注射心得

第一篇：小鼠尾静脉注射心得

小鼠尾静脉注射心得

对血管的选择

1.小鼠尾部有三条静脉，左右两边各一条而且比较浅，容易穿刺；中间一条较深不容易找到，建议尽量不要选择。另外穿刺选择尾部中下1/3-1/2处比较好，因为此处皮肤较薄，可以用75%的酒精反复擦拭穿刺部位血管，使其充盈，并使皮肤的角质层软化，便于穿刺。或者在注射之前，小鼠尾巴用温水泡大约2min,（水温大约50℃），这样才能使血管充分舒张。注射前用干棉球擦干，从下往上扎。这样的好处是万一一次扎不进，还可以继续使用此血管。

2.针的选择：书上说使用的是1ml的注射器，有人在实验中用的是头皮针，后接1ml注射器，因为头皮针针头更小，对血管的损伤更小，适合连续多次给药，其次使用头皮针穿刺后，我们可以通过回血来判断穿刺是否成功。（4号半1ml 注射器已经足够且容易进针。

3.注射手法：左手食指和中指上下夹住你所选择血管的靠近身体的一边，无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾（建立一个穿刺的平面的作用），拇指压住所选血管的尾尖端，上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜。（否则容易人为建立穿刺的角度，而使右手持穿刺针穿刺过深，导致穿刺失败。）右手持穿刺针，针斜面向上，针与皮肤稍成一角度（10℃左右），进针后要将针头稍向上挑，然后将针向里送一点。如果在血管里，则无阻力，并且能看见针。若针看得很清晰，则扎到了皮下，若针看不清，则针扎深了。看到回血表明成功，还可以回抽，见到回血后表明穿刺已进入血管，可以给药。

4.穿刺结束后，用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血。良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用，这对于需要天天穿刺给药是非常有用的。（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血。）

5.用细针头皮下进针（我用的是4号）从远端打起，后面的皮薄一点，较容易打成功（个人看法），打成功时进针会很顺畅，注药没有阻力，一般不会自己回血，若不成功再往近端打，但一般一条血管打过三次还不成功的话最好先暂停，因为刺激后血管会收缩，很难打，歇一会儿换另一边打。还有一点，信心很重要！有了信心才能找到感觉。

1.将小鼠固定好,将尾巴拉直，绷紧，这是成功的第一步。

小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。

或者用这个方法：1 小鼠要固定好，自制一个笼子，前面通气，中间最好有一个挡板，让小鼠不能后退，筒子后面开一个口，尾巴从这里出来，这样固定牢靠；

2、注射前尾巴用稍热的水浸泡几分钟，有利于注射；

3、先远后尽，不要一开始就从尾根部，那样失败了不好办；

4、进血管后注意保持稳定，针尖很容易刺穿血管的。至于能否穿进，个人手感如何，全靠自己啦。多练习，一定很快掌握的，不难，绝对不难！我练习10余只小鼠就比较熟练了

2.用酒精棉球擦拭尾巴,使血管扩张;或者用热水或者热毛巾焐热，使静脉扩张；选用适当的针头，越细越好；在尾部较靠近上段的地方注射，这里血管比较大。用酒精或热水擦拭，擦拭的时候，可把尾巴用力扯在桌面上。注射状态为尾巴发白，紧靠白色的尾骨两侧清晰可见两根红色静脉。

3.用左手的食指,中指,无名指及大拇指将小鼠尾巴固定,;手法：握住1ml注射器前面0.1ml处。右手小指搭在拽着鼠尾的左手拇指处 按此手形进针；看针尖前面那个斜面有3/4（关键），如果血管充盈则进1/2，进入，停，上挑针头，进针；左右轻摆动，如可动，可注射。原则是：把你第一次打进的手形，完全固定下来，每次都重复。

4.注射:注射时左手扯尾，使尾巴紧贴桌面，尾巴与桌边紧贴转弯处为进针部位，一般选择距尾尖1/4或1/3处进针，此处皮肤较薄，血管清晰，进针容易。进针时针头与桌面平行，针尖稍稍朝下，从中指及无名指与拇指接触处稍上方进针，一旦进入，须将针头稍稍上挑进入，针头沿血管进入，肉眼可关察到针头前进。如果针头在血管中前进，可明显地感觉到针行通畅，毫无阻力。若针头不在血管中，手感针行有阻力，有一种堵的感觉。进针时不要太深，针头入皮肤后马上把针头略往上，平行进针，针扎入时有落空感，推液时无阻力则说明成功了！如针头处出现皮丘则说明在皮下，推出重来。进针处最好在尾巴的1/3-1/2处，甚至可以更下一点。这样一次失败了还可以往上再来，不要马上在最高处打，因为你们要打这么多天。要为以后作准备。用热水、酒精、红外都可以扩张血管。可以视情况而用。总而言之，最重要的是“熟能生巧”。你最好先练习一下或请高手相助。不然到了最后几天，真的很难打的。

2。注射：针进入后，切记手不可发抖，因为血管壁非常薄，容易扎穿。推药时，要缓推。若进针成功，推药顺畅，无阻力；若推药时感觉有阻力，说明针头不在血管中，须及时拔出，重新进针。一般选用4号或4号半针头。最好用打疫苗的2毫升一次性注射器。尾静脉注射并不难，主要是一种感觉。若用上十只鼠练手，你必会找到感觉。心要静，手要稳，要有耐心。我研一的时候尾静脉注射让我头疼万分，越急越打不进去。后来静下心来，边注射边找感觉，很快就熟练了。

祝你找到感觉

5.通过看有无回血来测试针是否在静脉内;

6.注射.

第二篇：小鼠尾静脉注射的心得体会

小鼠尾静脉注射的心得体会

IV比IP困难许多，我练习了非常久了之后，才抓到窍门。由于当时没有一个人能指导我，所以我的IV技术可说是完全自己摸索出来的。当我遇到困难时，找了许多课本、网络，可是读了却做不出来，果然theory跟practical之间还是有差距的。一般书本所形容的IV很简洁，但实际情况要复杂许多，因此不先训练，是一定打不好静脉针的。

照例，打针之前，先量体重、准备要打的液体、做好稀释、load好进针筒里面。准备好完这些后，就开始要抓老鼠了。

但打IV不能靠普通的restraint方法，因为打静脉要很固定的，不能有丝毫动摇。因此需要一个restrainer，就是一个小小的塑胶东东，来困住老鼠，但它的尾巴可以掉出来。你就抓住它的尾巴，然后往尾巴上的静脉打针。

这个restrainer一定要把老鼠牢牢地关在里面，一点都不能动才可以。这时就要尽量把老鼠压在里面，压成一团也没问题，只要不要弄到它骨折，或者呼吸困难就可以了。

一般老鼠虽然喜欢关在一个圆圆的筒子里，但因为IV需要的是绝对的动弹不得，所以它会被关压到蛮不舒服的。而且老鼠不喜欢别人去碰它的尾巴的，所以打尾巴针对它们来说是相当痛的。如果不牢牢困住，就算有一点点的位置，它也会挣扎的，它一挣扎，你就打不到了。

为什么那么困难呢？就是因为老鼠尾巴的静脉其实不大，很小而已，只要稍微移动，很容易就打错地方了。

打静脉的针头我一般用30G，是比26G更加细的针头。我把步骤简化如下：

1)把针尖向下，即bevel up，这样比较容易刺进去，位置也能很精准

2)从尾巴的最后面开始试，不要一开始就刺比较靠近身体的部位，因为如果弄错了，还可以一直往上继续试，但如果一刺就刺靠近身体的，就没办法再上了 3)老鼠尾巴有静脉的地方会泛有红色的，就对准红色的线条

4)尾巴要抓紧，不要有丝毫动摇，有时候老鼠会挣扎，就要大力一点抓尾巴 5)刺进去时，尽量把针摆得跟尾巴越平行越好，因为稍微有一点角度就打不进去了(平行的话针就会在血管里面，如果有角度可能会刺过血管到血管下面的组织去)6)可以尽量刺深一点，只要是平行就好，刺得够深的话整支针可以挂在那里不会掉下来的

7)往后拉一拉plunger，如果看到血，位置就对了！

8)位置对的话，保持针的不动，然后注射，注射的时候会觉得很顺畅，而且可以亲眼看到红色的血管慢慢被你所注射的液体所flushed，所以红色就会慢慢变成白色

9)最后把针拉出来，针口的位置会流一点血(代表真的是血管嘛)，然后用一块棉花按按扎针的部位就可以了

那错误又会怎样发生咧？举例如下：

1)明明是看到自己刺到红色的线条了，可是往后拉的时候没看到血，只是感觉真空压力，这时就可以肯定刺错位置了，刺到尾巴的其他组织上，要拉出来再找一个地方刺，一般不要再刺回同样一个位置

2)开始注射后发现很难注射，plunger遇到很大的阻力似的，其实这也是打错了，不在血管里面就会这样，这时你就会看到你打针的部位周围开始泛白，但这个泛白跟血管里面泛白不同，这个泛白就围绕在你打针的部位，而且尾巴的那个部分会开始肿胀。如果你强迫注射完进去，就发觉尾巴那里变大了，因为你所注射的液体都集中在这个部分的组织里，没有进去血管

3)有时候一开始时注射时没问题，似乎注射进了血管，可是注射到一半突然感觉阻力来了，感觉不在血管里面了，这可能是因为你的针移位了，或者老鼠的尾巴动了

4)如果注射错误，泛白了的尾巴部位就再也看不到血管了，因此才要从越下面开始尝试越好，因为你刺错后还可以往上在找找看别的位置刺，如果一开始就刺在很上面的位置而且刺错了，要从下面再注射是很困难的，因为上面已经充斥着肿胀的组织，要成功更加困难了

5)另外有一些时候，刺的时候发觉有血流出来，以为在对位置了，可是开始注射时就注射不进去，这可能跟针的角度有关系，角度不对就不容易进去，反而会注射到外面去

怎样可以帮助注射呢？除了要一个很好的restrainer之外，还有一个重要的步骤，就是要给尾巴加温。因为加温之后静脉会放大，放大了之后就比较容易注射。一般我的做法是注射之前拿一盏很热的灯，照老鼠的尾巴大概5分钟左右，才开始注射。这个办法很有用的，如果没有加温，效果差别很大。

还有一个TIPS，就是不要擦酒精。酒精有点凉，擦在已经加温后的尾巴上面会马上给尾巴降温。我每次擦了酒精之后都打得很困难的，所以还是不擦酒精比较实际。

如果万事顺利，打静脉针也可以很快的。最好是做好好事前准备，如果可以第一次注射就成功就是最好了。第一次如果不成功，之后就要更加小心仔细了，不然最后可能落得老鼠的整条尾巴都被刺得白白了，已经没有新的位置可以尝试了---然后你的实验做不成功罗！

如果你折磨了老鼠很久才成功的话，老鼠放出来之后会很agitated，情绪会受到一点影响。但是如果做得干净利落，老鼠不会觉得怎样的。好啦，就是这样啦，说是容易，做啊，可真的要许多练习咧！

第三篇：静脉注射简介

静脉注射简介

静脉注射发生药效的时间最快，剂量准确，并可随时控制速度，也可随时停止正在注射的药液，对有刺激性的药物可以采用这种给药方法，也可以用于静脉营养治疗，如果注入脱水剂可以降低颅内压力。但必须在正规医疗机构有医疗急救保障条件的情况下接受注射，方能确保医疗安全。

温馨提示

1、在输液过程中，请服从医务人员的安排，不要随意变动座位，不可自行调节滴速。

2、在输液时，如感觉不适，请及时告知护士。

3、输液拔针后，请按压5分钟（但不要揉）

4、注射做“皮试”的药物，需观察二十分钟方可离开。

5、输液前应适当进食，避免空腹输液。

6、贵重物品请妥善保管，以免丢失。

静脉输液告知事项

1、为了减少输液时可能产生的不良反应，护士离开后，请您不要擅自调快液体的滴速。根据权威医籍《临床医学护理》载明：输液不良反应与控制输液速度有密切的关系，“成年人静脉输液速度为每分钟40—60滴（一般静滴250毫升药液需要耗时1小时），对老年、体弱或有心肺疾病的患者，或输入高渗盐水、含钾药液、升压药等，输液速度宜慢”。因此，敬请各位病友：为了您的身体健康和医疗安全，请不要自行调快输液速度。谢谢合作！特殊药物输液速度要求，医生会在处方中写明医嘱。

2、每瓶大输液滴注完毕时，对瓶内残留的部份（药液平面在瓶颈高度时），不宜要求全部输完（因为残留液内有穿刺瓶塞的微粒、瓶内壁在产生消毒过程中的崩脱微粒、药物配制时产生的极小颗粒，倒置沉淀后单位容积中浓度较高），所以应废弃不用，以保障输液安全。

3、某些抗菌素静滴时可能会有一定程度的消化道症状刺激副作用，请输液时适当进食，避免空腹输液。

4、在输液或使用（头孢类）药物的当天，请您切记：“禁忌饮酒”，以免造成过敏反应。

第四篇：苯酚-氯仿法从小鼠尾巴中抽提基因组DNA

从小鼠尾巴中抽提基因组DNA

一、试剂与材料

⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0)100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)10mg/ml(溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用时，终浓度达到100ug/ml

⑶ RNaseA RNaseA溶液配制

将RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸钠（pH5.2）中，使终浓度为10mg／ml，加热到 100℃，15min。室温下缓慢冷却，用0.1体积的1M的Tris-Cl调整pH至7.4后，小管分装保存在-20℃。使用时，终浓度为100ug/ml.⑷ Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(体积比)3M 醋酸钠（pH5.2）；

无水乙醇； 70%乙醇；

无菌ddH2O.⑸ 手术剪，1.5mlEP管.二、方法

⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(约20-30mg)，立即放入细胞冻存管并投入液氮中（防止基因组DNA降解）。

⑵ 从液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混匀。

⑶ 在热孵育器中，55℃过夜。（刚开始可每隔30min摇晃一次）

后续操作可在冰上进行---⑷ 取出EP管，加入等体积Tris平衡苯酚，用力摇晃3min；12000g，离心10分钟。

⑸ 轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中（宁可少吸，也不要吸到下层的苯酚或沉淀物）。

⑹ 向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；12000g，离心2分钟。⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀。

⑻ 12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。

⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力摇匀。（此步为了去除残留的SDS和苯酚）

⑽ 12000g，离心1分钟，去除乙醇，再重复⑼、⑽一次（为了尽可能把DNA清洗干净）。

⑾ 将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。

⑿ 用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。⒀ 分光光度计检测纯度、浓度。

DNA提取的注意事项

1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。

3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。

4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。

5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

8、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。

9、要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。

10、避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。

11、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。

12、基因组应4度保存，如-20度保存可能导致DNA断裂。

13、在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。

14、用Tris缓冲液溶解DNA。

15、加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。

16、加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA

17、将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。

18、在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。

19、酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h，5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊醇（24﹕1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇 试验步骤： 材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。2)离心4000g×5min，去除上清液。3)加10倍体积的裂解缓冲液。4)50-55°C水浴1-2hr。DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法： 试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9、1mol／LHCl。10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。植物DNA的CTAB提取法： 试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇 70%乙醇 试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 真菌DNA提取总结的两种方法： 第一种方法： 试验步骤：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二种方法： 试验步骤：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

石蜡包埋DNA提取试验方法

试验原理：

从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。

试验试剂：

配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠·2H2O，用HCL调PH值至7。0 石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。试验步骤：

1、取蜡块切片15-20张（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。

2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。

3、消化：以1×SSC500μL加入SSC洗涤沉淀，以12000rpm离心3min。弃去上清夜，干燥沉淀。加入石蜡消化液400μL，PK（20mg/ml）20μl；55℃消化120h，第四天，补加PK10μl。

4、消化后的液体很清亮，肉眼可见的组织较少。将其转入98℃的水浴箱中，煮沸10min，以灭活PK，取出后置于冰上，使其迅速冷却。以10000rpm，离心5min。

5、取上清加等量的酚-氯仿，轻颠倒混匀呈乳白色。低温下以14000rpm，离心10min。小心取上清，再加入等量的酚-氯仿重复上面的步骤。

6、取上清加入预冷的两倍体积的无水乙醇及1/10的乙酸钠（PH5.2），颠倒混匀。置于-20℃，30min。低温下以14000rpm，离心10min，去上清。

7、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤2次，（颠倒eppendorf管数次）以14000rpm，离心5min，自然干燥沉淀。

8、加TE20μl，（含RNA酶），4℃下过夜。注意事项：

1、取材时应避免出血坏死的组织，尽可能选用新鲜的标本。

2、消化时应不时震摇离心管，使酶与组织充分接触。

3、福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，匀浆的效果往往不理想，可将组织切成10um的薄片进行消化。

4、消化不完全，可采用高浓度蛋白酶K及延长消化时间。附：elz氏DNA提取方法的主要步骤：

提取液的制备：500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmol/LNaCl1％SDS 500μg/ml蛋白酶ＫpH8.0

1、切除多余石错，暴露组织。将组织切碎（最大径<0.5mm），称重。

2、溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h。

3、再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h。

4、用等体积酚－氯仿溶液抽提３次。2.5倍体积乙醇沉淀DNA。-70℃放置２－４h。9000rpm离心１h。

5、沉淀物用70％乙醇洗１次，干燥，TE（pＨ7.2）溶解。

DNA提取其他方法

适用于PCR研究的快速提取法： 试验步骤：

1、田间剪取植株新鲜叶片5－10mg（约2cm长）左右，新鲜叶片放于15ml离心管中，存于冰盒中，根据样品号贴上相应的标签。

2、用剪刀将叶片组织剪细（约0.5cm长）放在点穴式研板中。加入400μlDNA提取缓冲液，用玻棒将叶组织研细，直到液体变成深绿色即可。

3、加400μlDNA提取缓冲液，混合均匀，转入一新的15ml离心管（贴上相应的编号）。

4、加400μl氯仿，混合均匀后，2400转离心30s，将上清液转入一支新的15ml离心管（贴上相应的编号）。

5、加800μl无水乙醇，混匀，2400转离心3min。弃上清。70%乙醇冲洗，风干。用50μlTE缓冲液溶解，存于－20℃。取1μl用于PCR分析。

Chelex-100法提取DNA： 试验原理：

Chelex-100是一种化学螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲合力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，DNA游离。Chelex-100特别适用于微量生物样本的处理，方法简便快速，提取过程始终在同一管中进行，不用转移，可减少DNA的损失，操作步骤简化，减少了污染的机会。

以血液为例实验步骤：

1、取血液1-3?l，置1.5ml离心管中，加灭菌双蒸水1ml，振荡混匀，室温30min，或置冰箱-20℃5min。2、10000r/min离心5min，弃上清，反复2-3次。

3、于沉淀中加入200?l悬浮好的5%的Chelex-100溶液，56℃水浴2h或37℃水浴过夜。

4、振荡5-10秒，置100℃5-10min，取出振荡溶液5-10s。5、10000r/min5min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。注意事项：

1、Chelex-100处理模板仅适用于PCR反应，处理液不宜长期保存，如果保存的时间稍长，可将上清液转移至另一管中保存备用。一般在一周内使用，如果保存时间过长则会影响PCR扩增结果。

2、在处理模板的各个步骤中，振荡要充分。

3、煮沸的温度、时间要充分，否则将影响扩增。

4、使用前要混匀离心，取上清液作为模板，如果PCR反应体系中含有Chelex-100，Mg2+会被螯合，降低酶活性，使PCR扩增失败。

硅珠法提取DNA： 试验原理： 在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，DNA能够被二氧化硅特异性吸附，当没有硫氰酸胍存在时，DNA又可从二氧化硅中释放出来。硫氰酸胍是一种高性能的蛋白变性剂，可以使蛋白质与DNA充分分离，在硅珠吸附前高速离心可以将变性的蛋白质及一些不溶的物质除去。吸附后的漂洗过程则可将溶液中的PCR抑制物洗去。

试验试剂：

1、吸附剂：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)，0.8ml0.5mol/LEDTA，0.5mlTritonX-100。

2、漂洗剂：12gGuSCN溶于10ml0.1mol/LTris-HCl(pH6.4)。

3、硅珠悬浮液：0.06gSilica溶于1ml灭菌超纯水。

4、TES：1ml1mol/LTris-HClpH8.0，2ml5mol/LNaCl，2ml0.5mol/LpH8.0EDTA，95ml灭菌超纯水。

试验步骤：

1、取1.5ml离心管1支，加入TES200ul，10%SDS40?l再加入血液2-4?l，混匀，煮沸5min。

2、振荡混匀，加入300-600?l吸附液，混匀。

3、加入20-40?l硅珠悬浮液，振荡混匀，置室温15min，振荡5s，10000r/min离心2min。

4、除去上清，于沉淀中加入200-400?l漂洗液，充分悬浮沉淀物，10000r/min离心1min。

5、去上清液，重复漂洗一次，去上清后沉淀物用70%乙醇漂洗1－2次。10000r/min5min。

6、去乙醇，置56℃ 10min，于沉淀中加入50-100?lTES，旋涡混合30s，56℃保温10min。7、10000r/min离心10min，上清液可直接用于PCR反应。固相吸附法提取DNA： 试验原理：

硫氰酸胍具有溶解细胞和灭活核酸酶的性质，利用当硫氰酸胍存在时硅藻颗粒能特异性吸附DNA，而当去除硫氰酸胍时，DNA又能从硅藻上释放出来的特性，来提取样本中的DNA。该方法尤其适用于临床标本的DNA提取。

试验试剂：

1、裂解液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4，2.2ml0.2mmol/LEDTApH8.0，0.3mlTritonX-100。

2、洗涤液：12gGuSCN，10ml0.1mol/LTris-HClpH6.4。试验步骤：

1、取100?l样品加900ul裂解液，20?l硅藻液，振荡混合，10000r/min离心1min，去上清。

2、加1ml洗涤液，悬浮沉淀洗涤，10000r/min离心1min，再重复一次。加1ml70%乙醇洗一次，1ml丙酮洗一次，去上清，56℃ 10min。

3、加60?lTE缓冲液混匀，56℃ 10min，10000r/min离心5min，上清液备用.DNA含量的检测和纯化

DNA含量的检测：

一种方法是通过凝胶电泳的方法检测DNA的含量：取2-5?lDNA溶解液与0.4?l6×载样缓冲液混合，用0.75%琼脂糖凝胶(含EB0.5?g/ml)检测。溴化乙锭可迅速嵌于DNA双螺旋结构中，嵌入DNA中的溴化乙锭受紫外光激发而发出荧光，这种荧光强度与DNA总质量数成正比，通过比较样品与标准品的荧光强度，对样品中的DNA进行定量。（详见凝胶电泳）另一方法是分光光度法，组成DNA的碱基，具有一定的吸收紫外线的特性，其最大吸收值在波长250-270之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其吸收紫外线的特性没有改变，核酸的最大吸收波长为260nm，利用DNA的这个物理特性来测定DNA的浓度。

分光光度法的具体方法是：

1、取两只清洁的比色杯，各加入2ml0.1mol/LNaOH校正零点。

2、以其中的一只比色杯作为空白对照，在另一只比色杯中加入4?lDNA溶液，再加入0.1mol/LNaOH至2ml混匀。

3、测定波长为260nm时的OD值，再将波长调至280nm测其OD值。

4、根据OD260=1时，双链的DNA浓度为50?g/ml，单链DNA或RNA浓度为40?g/ml，按计算公式：样品DNA浓度(?g/ml)=OD260×40?g/ml×稀释倍数，计算样品的DNA浓度。

DNA纯化：

首先利用琼胶电泳将不同分子量的DNA片段分开,将某一特定分子量区域的琼胶切下,利用DNAextractionkit将DNA从琼胶中溶出并浓缩。（可参考质粒DNA的纯化）实验材料： 1、6Xgel-loadingde:15%Ficoll400,0.25%bromophenolblue,0.25%xlenecanol紫外光箱

2、DFBuffer

3、WashBuffer

4、ElutionBuffer:10mMTris-HCl(pH8.5)

5、DFColumn 6、2mlCollectionTube 实验步骤：

1、将欲分离之DNA混合物以0.7%琼胶电泳分离。

2、电泳后,将琼胶置於紫外光箱上观察,把含有欲纯化之DNA片段的琼胶部位切下。

3、将步骤B的琼胶以蓝色微量吸管尽可能戳碎。

4、加入500mlDFbuffer,55oC作用10分钟,每2-3分钟摇晃数次,直至琼胶完全溶解。

5、将步骤D琼胶溶液全部吸入DFColumn,并套上CollectionTube(收集过滤液)。6、8000rpm离心1分钟,将过滤液倒掉。加入500mlWashBuffer,8000rpm离心1分钟,过滤液倒掉。14000rpm离心2分钟。

7、将DFColumn转移至上另一乾净的微量离心管.加入15mlElutionBuffer,室温静置2分钟。8、14000rpm离心2分钟,微量离心管内之液体即为纯化的DNA片段。

9、取0.5ml纯化的DNA加入4.5mlDDW及1ml6xDNAloadingde,跑0.7%琼胶电泳,与marker比较,估计DNA的浓度。

第五篇：小鼠品系介绍

Swiss、KM、ICR、CD-1小鼠品系来源与优缺点

1.品系名称由来

（1）Swiss：1926年美国Rockfeller研究所的Clara Lynch博士从瑞士（Switzerland）Centre Anticancereux Romand的de Coulon实验室引入非近交白化小鼠，培育成Swiss小鼠。

（2）KM：1944年3月17日卫生部北京生物制品研究所汤飞凡教授从印度Hoffkine研究所引进Swiss小鼠，饲养在中国昆明中央防疫处。由于该小鼠起初引入地是昆明，故称之为昆明小鼠，这就是昆明小鼠品系名称的由来。

（3）ICR：1948年，美国费城癌症研究所（Institute of Cancer Research, ICR）Hauschka以多产为目标，用Rockfeller研究所培育出的Swiss小鼠群进行选育，培育出Ha/ICR，以后由美国肿瘤研究协会分送各国饲养实验，各国称为ICR小鼠。中国科学院遗传研究所在1973年从日本国立肿瘤研究所引进，1979中国医学科学院分院动物中心引进，1978年北京检定所引进，1983年上海计划生育研究所从瑞士苏黎世毒理学研究所引进。

（4）CD-1：1948年Edward Mirand博士将费城癌症研究所培育的Ha/ICR引入Roswell Park Memorial Institute，命名为HaM/ICR。1959年美国Charles River Lab引入该品系并于同年进行了剖腹产，并命名CD-1（ICR），并注册CD-1®商标。

2.优缺点

（1）KM：优点是抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率高。KM小鼠基因库大，基因杂合率高，在中国昆明小鼠作为实验动物用于生物医学研究已有半个多世纪之久，一直是我国生产量、使用量最大的远交群（封闭群）小鼠，被广泛应用药理学、毒理学等领域的研究，以及药品、生物制品的生产与检定，药典中甚至将KM小鼠作为某些检测项目的指定用动物。目前国内已从KM小鼠远交群中先后培育出不少近交系小鼠：C-1，615，TA2，AMMS/1等。缺点：国内各地昆明小鼠遗传背景不很一致，不同地饲养的昆明小鼠封闭群的生长发育与繁殖性能存在较大差异。

（2）ICR：优点是除了抗病力和适应力强，繁殖率和成活率高之外，从全球范围来看，ICR小鼠的使用更为普遍，其背景资料也更为丰富，而且发表文章时动

物品系这一考核指标更容易被接受。缺点：与KM小鼠相同，不同地域饲养的封闭群差别也较大。

（3）CD-1：是ICR小鼠的升级替代品系。因为Charles River Lab已经注意到了ICR小鼠的缺点，为了减少CD-1小鼠因不同地域饲养而引起的不同封闭群之间在生长发育与繁殖性能上的差异，Charles River将世界各地繁殖的CD-1种群按计划定期轮换，形成了具有国际遗传学标准的CD-1 IGS（International genetic standard）小鼠。这也是CD-1小鼠特有的优势，1999年北京维通利华公司从Charles River引入CD-1核心群，成为中国大陆唯一授权使用其注册商标权的单位。