关于长期责任准备金的提取方法及其借鉴[合集五篇]

第一篇：关于长期责任准备金的提取方法及其借鉴

关于长期责任准备金的提取方法及其借鉴

摘要：2004年12月，中国保监会发布了《保险公司非寿险业务准备金管理办法（试行）》，规定了各种责任准备金的提取方法。该试行办法中，有关对长期责任准备金的提取方法的规定侧重于原则性，缺乏可操作性，有待进一步完善。美国保险官协会（NAIC）于1997年修订、并于1998年开始实施的关于长期责任准备金的提取方法，对我国非寿险公司以及保险监管部门有借鉴意义。特别是按照美国保险官协会（NAIC）的新规定，长期责任准备金的提取涉及到精算人员的经验与判断，故对精算人员提出了更高的要求。

关 键 词：长期责任准备金；成长惩罚；成本率

一、引言

为了规范非寿险业务的发展，加强非寿险业务的核算工作，促进非寿险业务准备金的科学管理和准确计算，减少经营非寿险业务的公司管理层对准备金提取的人为干预和主观臆断，包括监管部门在内的保险业界都极为重视准备金领域的理论及其实践操作和监管模式的研究。

2004年12月，中国保监会发布了《保险公司非寿险业务准备金管理办法（试行）》（下称《试行办法》）。《试行办法》规定，非寿险业务准备金包括未到期责任准备金、未决赔款准备金和保监会规定的其他种类的责任准备金。未到期责任准备金包括保险公司为保险期间在一年以内（含一年）的保险合同项下尚未到期的保险责任而提取的准备金，以及为保险期间在一年以上（不含一年）的保险合同项下尚未到期的保险责任而提取的长期责任准备金。保险公司应当采用二十四分之一法或者三百六十五分之一法提取未到期责任准备金。对于某些特殊险种，根据其风险分布状况可以采用其他更为谨慎、合理的方法。[1]由此可见，目前监管部门在准备金监管上，对短期险和长期险业务等同对待，均要求按照传统的比例法计提，并没有实行差异化的监管方式。

该试行办法明确了传统比例法的法律地位，并最先以法律的形式将精算理念引入准备金的核算，势必有力推动产险公司的规范经营与管理。该试行办法要求长期责任准备金按比例计提，因而较《保险公司会计制度》和《保险公司财务制度》有了相当大的改进。但相对于目前产险公司的业务操作方式而言，试行办法仍有一些不足。一方面，各产险公司长期险业务以楼按为主，而该类险种保险期间较长，一般涉及十年、十五年或二十年等较长时间，最高甚至可达三十年；另一方面，该类险种的签单费用一般偏高，后续费用较低，呈现费用前期集中的特点。试行办法在忽略签单费用的基础上，以签单保费为基数比例计提长期责任准备金，将全部签单费用列入当期费用核算，结果导致当期费用高估，利润考核数据严重失真，从而无法形成良好的业务导向。也就是说，不考虑签单费用而以签单保费为基数计提长期责任准备金的规定，使保险公司陷入了“做的规模越大，当期利润越紧”的尴尬境地，从而引起业界对此广泛关注和深入思考。

本文重点介绍和分析美国保险官协会（NAIC）对长期责任准备金提取方法的规定，并结合国内市场的实际情况大胆思考，希望对国内产险公司的经营和政府监管有借鉴意义。

二、美国保险官协会（NAIC）关于长期责任准备金提取方法的规定

1997年，美国保险官协会修订了《财险与意外险公司的会计实务与程序指南》，并于1998年开始实施。该指南明确了对长短期险业务实行差异化的监管，规定使用不同的计提方式。按照该指南的规定，对于保险期间在一年以内的保险合同，未到期责任准备金按照保费与未赚比例的估计值的乘积结果来计提，其中未赚比例的估计值取合同未到期期间预期成本（含赔款和费用）与整个合同期间预期成本的比率。对于保险期间在一年以上（不含一年）的保险合同，该指南规定长期责任准备金在计提之前需要计算三个金额（即经过三个测试程序）：第一个金额为假设合同终止情形下保险公司根据条款规定应支付的退保金额（测试程序1）；第二个金额为保费与未赚比例的估计值的乘积（测试程序2）；第三个金额为合同未到期期间未来预期成本的现值减去未来应收保费的现值的差额（测试程序3）。[2]

从上述规定中可以看出，NAIC对短期险未到期准备金规定的提取方法比较简单，容易理解，电脑系统也容易实现；而对长期责任准备金，无论是客观数据的要求，还是主观上的估计，其内容都要丰富得多，电脑系统的实现也比较复杂。

一般在实务处理上，长期责任准备金有一些要求。第一，逐单与汇总的要求。在保险合同的头三年内，保险公司必须在逐单进行三个测试程序之后，按照最大的计算结果逐单计提长期责任准备金；已赚时间超过三年的合同，保险公司却是在逐单测试后，按风险的特点将上述三个金额分类汇总，然后取最大值作为某类别的长期责任准备金。第二，使用最新数据进行估计的要求。NAIC关于长期责任准备金的规定，突出了“估计”和“预期”这两个概念，这与传统的以会计保费为基础的比例法迥然不同。比例法按照固定模式进行机械化的计算，而NAIC的规定则要求精算人员进行估计和判断，更加侧重于经验的运用。一般来讲，在每个准备金报告日期，NAIC要求精算人员使用最新的经营数据对预期成本重新估计，并使用这种结果计算长期责任准备金。第三，贴现的要求。传统的比例法在计算各项准备金的过程中不允许贴现，而NAIC在计算长期责任准备金第三个金额的过程中，涉及了现值的计算。这里必须注意两点：（1）贴现时间长度的确定。一宗赔案从发生、报案到结案的整个过程中会有多个关键时间点，如事故发生时间、报案时间、立案时间、结案时间、赔款支付时间等，在实际处理过程中，保险公司因缺乏相关的技术力量，往往会出现因理解差异从而导致错误计算贴现时间长度的问题。为此，NAIC明确规定了贴现时间长度按照未来预期赔款与费用发生的日期计算。（2）贴现利率的选择。NAIC规定，计算使用的贴现利率应低于下列两者当中的较小者：当前五年期国债的到期收益率；公司符合法律规定的投资资产的到期收益率减去1.5%后的差额。第四，与财务口径保持一致的要求。长期责任准备金最终要在年度报表中体现，因此为保证一致性和连贯性，计算长期责任准备金时需要考虑是否参与了分保。另外，计算预期成本时，如有必要，可扣除未来预期残值和追偿款收入。

为行文方便，本文将NAIC计提长期责任准备金的方法称为测试法。三、三个测试程序的比较分析

由于保险公司经营风险变幻莫测，因而准备金特别是长期责任准备金在提取原则和方法上并不是一成不变的，各方争议和分歧颇大。测试法的三个程序各自从不同的角度对长期责任准备金的计算原理进行了阐述，这充分显示了测试法的谨慎性。同时，选择三个程序最大结果的机制，也有力地说明了测试法具有明显的保守性。谨慎性和保守性确保了测试法能够最大程度地维护被保险人的利益，从而使得该方法倍受各国监管者的青睐。

计算退保金程序主要是保证保险公司在业务停办、合同提前终止时有足够大的准备金用于支付退保金。这种思路遵循了清算会计的理念，侧重于在停办业务的假设下保险公司应该承担的义务。该程序客观性强，无需精算人员的专业判断和经验分析，一般根据条款约定的方式来计算退保金。大多数条款规定，退保时保险公司按照比例计算的未赚保费退还，从而使得该程序容易理解和掌握，便于操作及电脑系统的实现。在这个程序下，通过准备金提取和返回机制，保险公司每笔业务的保费都是在该保单的整个保险期间内按比例赚取的。

按照未赚比例估计长期责任准备金程序，其显着作用是消除了“成长惩罚”。所谓“成长惩罚”，是指在传统的比例法下，准备金按照保费比例计提；其提取和返回机制使得保费在整个保险期间分期赚取，而占比较大的签单费用却一次性记入签单当期，这种收入与费用匹配不合理的弊端，造成保险公司陷入了“做的规模越大，当期利润越紧”的尴尬境地。未赚比例程序在使用过程中，其未赚比例的计算必须考虑赔款、费用在整个保险期间的分布，从而保证了每笔业务的收入与成本能很好地配比，有效地解决了“成长惩罚”的问题。如在一年最后一天承保的保单，签单费用占比15%.按照比例法，该笔保费基本上全部记入准备金，转为今后的收入；而大额的签单费用却全部记入当期，作为本年费用，故这种方式对签单部门极不公平，本年利润严重缩水。但按照测试法，该程序却是通过未赚比例的估计，准备金仅按照保费的85%提取，故该做法极好地消除了比例法造成的不利影响。

计算现值程序主要是针对产品定价不足而设计的；它完全撇开保费，其未来成本的估计全部建立在对未来风险判断的基础上。因此，只有这个程序才可能要求保险公司提取保费不足准备金。该程序有很强的主观性。为了避免操作上的随意性，监管者一般都会对未来成本的估计、贴现时间长度的计算和贴现利率的选择等进行明确的规定和界定，以形成行业的统一标准，树立行业监管的公正性和权威性。因此，有效降低定价不足风险、最大程度上满足产品监管的需要，是该程序最突出的特点。

对上述三个程序的比较归纳如表1所示。

四、风险分布对测试法的影响

风险分布不同的合同，在使用测试法的过程中，其占主导地位的程序是不同的。对于成本前置的合同，由于按比例提取准备金的方法比较保守，测试程序1容易占主导地位；对于成本后置的合同，测试程序2有优势；对于定价不足的合同，准备金一般按照测试程序3的结果计提。在实务中，不同标的的合同，其成本分布千变万化。有的合同，其成本在逐年上升到一定程度后又逐年下降，在这种情形下，其长期责任准备金的计算中，占主导优势的程序则分阶段有所差异。

现在考虑三份不同的长期合同，保险期间分别为5年期、2年期和6年期（见表2）。如果假设承保在每年内是均匀分布的，那么不失一般性，可假设以上三份合同在年中开始生效、合同期内每年的赔款与费用均发生在年中、三份合同在保单签发时均有15%的签单费用、之后均有总和为80元的赔款与费用支出。

注：合同1原来是5年，但这里假设理赔需要6年才结束。同样的考虑适用于合同2和合同3.首先，假设每份合同的保费都是100元，那么每份合同都有5元的利润，利润率为5%.现按照三个测试程序对这些合同分别计算应提取的准备金，其中，测试程序3按照5%的贴现率计算。具体结果如表

3、表4和表5所示。

注：①第2列即测试程序1有一定的规律，如第一年后的测试值减少了10，而第5年后的测试值正好是10；从第2年开始，每年的测试值等额减少20.②84.21=100×（80÷95）。其中，95为整个合同期间的预期成本，80为未到期期间的预期成本。同列的其他值类推。

③67.73=0.77×1.05-0.5 7.88×1.05-1.5 „ 7.41×1.05-5.5，同列的其他值类推。

合同1在第5年和第6年的赔款与费用有所降低，因此在中间年份，该合同准备金的计算以测试程序2为主；但在合同期间的尾部年份，测试程序1重返主导地位。由于合同2的成本前置，测试程序1比其他两个程序保守得多，因此该合同每年的准备金全部按照测试程序1来计算提取。与合同2相反的是，合同3的成本明显后置，即成本主要发生在保单后期，在这种情形下，准备金的计算提取以测试程序2的结果为主。由于存在承保利润，测试程序3的结果未出现在准备金中。

其次，假设每份合同的保费为85元。此时公司出现承保亏损，每份合同的成本率为109.1%[=（85×15%+80）÷85].重新计算准备金，得到表

6、表7和表8.此时，测试程序3计算的结果出现在合同1的中间年份和合同3的尾部年份。对于成本前置的合同2而言，相对保守的测试程序1仍然占主导地位。

最后，假设每份合同的保费为60元。此时保险公司面临相当大的承保损失，测试程序3在长期准备金的计算中凸现出来。每份合同的成本率为148.3%[=（60×15%+80）÷60].重新计算准备金，得到表

9、表10和表11.除了合同2的第2年外，测试程序3在其他地方都占主导地位。另外，值得注意的是，合同1和合同3中前两年的长期责任准备金超过保费，合同2第一年的准备金也超过保费。更为特别的是，合同3在前两年的长期责任准备金出现递增，这种现象意味着在这段时期保险公司的已赚保费为负数，这就是严重的“成长惩罚”。

五、测试法对财务分析的影响

虽然测试法能够最大限度地保护被保险人的利益，与监管者的监管诉求不谋而合，然而，它必须经过三个测试程序，并选取最大值计提准备金，故这种方式决定了它必然存在不可弥补的缺陷。由于这种内在的选择机制，故在计算准备金过程中，测试法使用程序将不连贯，从而使得每年已赚保费和成本率会发生比较大的波动。

（一）已赚保费的分析

已赚保费分累计已赚保费和每年已赚保费两种。简单地讲，累计已赚保费就是保费减去准备金后的差额；每年已赚保费为累计已赚保费在每年的增量。对上述三份合同的累计已赚保费和每年已赚保费进行计算，得到表

12、表13和表14.由表12-14可见，在保费为60元时，累计已赚保费和每年已赚保费会出现负数。另外，即使赔款与费用流按照平滑的趋势发展，已赚保费也不一定会出现平滑的趋势。例如，合同3的赔款与费用流呈现递增的趋势，当保费为100元时，每年已赚保费却在第2年和第3年之间呈现下降的趋势。出现这种异常的原因，在于NAIC规定取三个测试程序结果的最大值作为准备金这种选择机制。

（二）成本率的分析

如果保费收入与成本不能较好地匹配，那么在保险期间内的成本率变化是不稳定的。在赔款与费用的估计没有发生变化、且与实际情况相吻合的假设下，对累计成本率和每年成本率进行测算，得到表

15、表16和表17.由表15-17可以得出一个结论，成本率的变化很不稳定，应用成本率的意义不大。另外，上述例子都假设赔款与费用在整个保险期间内与估计相吻合；一旦这些估计发生偏差，那么相应的准备金、已赚保费也会发生显着的变化，从而进一步加大成本率的波动。

六、对国内保险业的借鉴

总的来说，测试法在长期责任准备金的计提上具有其他方法不可比拟的优势，因此无论在理论上还是实践上，该方法已经逐步得到各方的认可。然而对国内保险业来讲，测试法却显得很陌生。在保险业对外开放渐成气候的形势下，引入并借鉴测试法已成为必然的选择。不过，长期以来，数据缺乏有效性、业务系统二次开发力度不够、业务操作尚不规范统一等问题，会直接影响测试法在国内保险业的使用效率和作用发挥。本文认为，就现阶段而言，针对国内各产险公司的实际情况，测试法对国内保险监管、产险公司准备金评估及分析有以下借鉴之处。

1.充足性测试可按照计算未来预期成本的方法进行。《试行办法》第十二条规定：“保险公司在提取未到期责任准备金时，应当对其充足性进行测试。未到期责任准备金不足时，要提取保费不足准备金。”但该办法对如何进行充足性测试并不明确，测试法为我们提供了一种思路。如前所述，测试法的程序3要求保险公司计算未到期预期成本的现值减去未来应收保费的现值的差额。但在使用时，必须注意两点：一是慎用贴现率。在国内资本市场尚不发达以及各保险公司投资业绩不甚理想的环境下，使用贴现率的时机不够成熟；二是应考虑分期应收保费计划的操作惯例和系统实现方式。目前，各产险公司虽然允许一些大客户使用分期付款计划，但很少在业务系统有所体现，一般是手工操作或仅在财务系统中记录。

2.测试法的程序1和程序2要求保险公司精算人员对赔款和费用的分布进行合理的分析和预测，然后根据分析和预测的最新结果进行相关计算。这对数据的集中性和可信性提出了很高的要求。当前，监管部门要求各产险公司定期提供xml格式的数据，这在机制上为数据集中化奠定了基础。因此在宏观上，针对国内的行业现状，建议在现有的行业数据集中的基础上，加强赔款和费用分布的研究，掌握各类险种的承保理赔规律，并由政府或政府委托的学术机构负责组织并对外发布，形成一套准备金的计量标准作为监管依据，从而避免各公司各自为政和故意扭曲经营数据等行为导致的信息失真，确保各公司提取的长期责任准备金能够达到客观性、公正性和公平性的要求。在微观上，建议严格各险种条款中保险责任的界定，加强各险种条款间差异的研究，尽快制定产险统计指标的行业标准，切实提高数据的质量，防止数据资源的浪费。

3.测试法要求退保金计算必须实现逐单化和电子化。逐单化和电子化是相辅相成的。就现阶段国内各产险公司的实际情况而言，为达到逐单化和电子化的要求，有两个问题需要关注：一是IT技术支持必不可少。由于长期以来各产险公司不重视退保工作，突出表现是新产品在写入系统时往往缺乏退保考虑，因而在实践中，退保金的计算更多的是停留在手工层面。二是业务操作的复杂性。一方面，各产险公司经营的产品多种多样，各产品对于退保的规定有不少差异；另一方面，迫于竞争的压力，即使相同的产品，应客户的要求，保险公司也会做一些变通，如降低退保手续费率等。因此，业务部门在提交IT需求报告之前，有必要总结整理各产品业务流程和操作细则，在此过程中，IT部门可协助提供系统的历史记录。

第二篇：中药提取方法

综述中药提取方法

摘要

以中药提取方法的本质和影响提取作业的因素为理据，分析国内中药厂提取方法 关键词

中药提取方法 1前沿

近年来有关中药提取方法的论述有很多，然而有效成分的提取率仍然是现今国内中药制药工业现代化的瓶颈。尽管近年来国内在中药提取生产中推出了一些新工艺，如超声场强化提取、微波提取、超临界流体提取等，但当下的主流仍是浸提技术。浸提技术是应用溶剂提取固体原料中某一或某类成分的提取分离操作，又称固液萃取。目前在中药生产过程中，常用的中药浸提方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、水蒸气蒸馏法等。

面对众多中药提取方法如何抉择是一个复杂的问题，因为它牵涉到生产设备和生产条件等许多因素。加上如今中药提取的规模较大，尤其考虑到连续生产，即使在实验中取得成果，在实际情况下还要经过长时间的实践检验。还有前面提到过的提取新工艺，其提取物往往是化学结构明确的物质，与传统中药生产完全是两回事，所以生产传统中药的厂家下不了决心去尝试新工艺，生产者情愿随大流，以避免风险。

提取方法的不同，提取等量有效成分所需原料和能源也不尽相同，资源和能源对世界经济和人类生存环境的影响越来越被重视。可持续发展经济和资源节约型社会的概念已经被全世界广泛认同，中国也不例外。在市场竞争激烈异常的今天，生产成本的控制就是企业的生命，而对世界能源价格上涨的现实，生产者应该节约每一滴水，每一度电。中药生产厂家必须努力挑选出最好的中药提取方法，改变目前中药提取效率低、高能耗、高污染所造成的负面影响。2选择原则

和所有的工程项目一样，选择中药提取方法必 要考虑的条件也是：被处理物料的性质、数量，产品的价值操作人员的技术水平，现实的设备安装场地，生产成本的控制，投资的预算。所追求的目标也是最高的投资回报率，最低的能耗，最简单的操作，最理想的提取率。降低生产成本，提高产品质量，从而提升本企业的市场竞争力。舍此不会有 良好的后果。3中药提取本质

中药提取本质上是一种固液萃取作业，任何化工原理教科书和化工手册对固液萃取的机理都有详尽的阐明。为了便于分析国内中药厂现有提取装置的状况，有必要将其与中药提取有关的结论摘录于此。（1）固液萃取的速度取决于二相接触介面的面积和吸附力，溶质扩散到介面的距离，溶剂的粘度和扩散系数、对溶质的选择性，萃取的温度、压力。

（2）固液萃取的萃取率取决于萃取时间、级数（同一份固相被萃取的次数）和溶剂的数量。（3）在多级萃取作业中，固液萃取的级效率取决于固相底流的反混量，以及固液二相接触的均匀程度。

（4）萃取率既定时，多级固液萃取的溶剂使用量取决于萃取过程的形式：并流、错流或逆流。（5）所谓并流是指被萃取的固体物料在每一级萃取作业中都被同一份溶剂萃取，液相的移动方向与固相在级间移动的方向相一致的作业方式。实际上是一种移动的单级萃取作业。为了保证最终的萃取推动力，萃取液成品的浓度必须相当低，所以整

个萃取过程的溶剂需用量相当大。

（6）所谓错流是指被萃取的固体物料在每一级萃取作业中都使用新鲜溶剂进行萃取，每一级都要将固液二相分离。然后把这些浓度逐次降低的各级提取液混合在一起作为成品。

（7）所谓逆流是指被萃取的固体物料在每一级萃取作业中都是被来自下一级的萃取液所萃取，固液二相的移动方向是相逆的。新鲜的液相溶剂萃取最后一级固相渣滓，而最浓的萃取液成品萃取新鲜的固相物料。不仅可用最少的溶剂量维持各级萃取所需的推动力，而且可以获得浓度最高的萃取液成品。4中药提取方法

回流法

回流法系指用乙醇等挥发性有机溶剂浸提药材成分，浸提液被加热，溶剂馏出后又被冷凝流回浸出器中浸提药材，这样周而复始，直至有效成分提取完全的方法。该法由于浸提液受热时间较长，故不适用于受热易破坏的药材成分的浸出。常用设备为多功能提取罐、索氏提取器。

滤过分离法

滤过分离法系指将混悬液通过多孔的介质（滤材），固体微粒被截留，液体经介质孔道流出，使固-液分离的方法。常用的滤过方法与设备如下所述。

（1）常压滤过

系指常压下滤过的操作。常以滤纸或脱脂棉作滤过介质，常用滤器为玻璃漏斗、搪瓷漏斗、金属夹层保温漏斗等。

（2）减压滤过

系指抽真空下滤过的操作。常用的滤器如布氏漏斗（铺垫滤纸或纸浆滤板）、砂滤棒（外包滤纸或丝绸布）、垂熔玻璃滤器（包括漏斗、滤球、滤棒）等。

（3）加压滤过

系指加压下滤过的操作。例如板框压滤机，是由许多块“滤板”和“滤框”串连组成，适用于黏度较低、含渣较少的液体加压密闭滤过。

（4）薄膜滤过

系指以薄膜为滤过介质，按薄膜所能截留的微粒最小粒径或相对分子质量，达到的滤过操作，可分为微孔滤膜滤过（微滤）、超滤、反渗透等。

微滤是指以微孔滤膜为滤过介质进行的滤过操作。微孔滤膜滤过具有以下特点：滤膜质地薄（0.1～0.15mm），孔径比较均匀，孔隙率高，故滤速快；滤膜对料液的吸附少；滤过时无介质脱落，对药液无污染。微孔滤膜的孔径范围为0.025～14μm，生产中主要用于精滤，如注射液的滤过。0.22μm以下孔径的滤膜可以滤除细菌。

超滤是指利用具有不同分子量截留值的薄膜作滤过介质，溶剂和小分子溶质可通过滤膜，大分子溶质被滤膜截留。所以，超滤是在纳米（Bin）数量级选择性滤过的技术。具有非对称结构的超滤膜孔径为l～20nm，主要滤除5～100nm的微粒。可用于中药注射剂的精制及除菌；蛋白质、酶、多糖类药物溶液的超滤浓缩等。

水提醇沉法

水提醇沉法（水醇法）系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法。一般操作过程是：将中药水提液浓缩至1︰1～1︰2（ml︰g），（溶液：溶质）药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇量，密闭冷藏24～48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。操作时应注意以下问题：①药液应适当浓缩，以减少乙醇用量。但应控制浓缩程度，若过浓，有效成分易包裹于沉淀中而造成损失。②浓缩的药液冷却后方可加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失。③选择适宜的醇沉浓度。一般药液中含醇量达50％～60％可除去淀粉等杂质，含醇量达75％以上大部分杂质均可沉淀除去。④慢加快搅。应快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失。⑤密闭冷藏。可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作。⑥洗涤沉淀。沉淀采用乙醇（浓度与药液中的乙醇浓度相同）洗涤可减少有效成分在沉淀中的包裹损失。

水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法系指将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的浸提。水蒸气蒸馏法可分为共水蒸馏法、通水蒸气蒸馏法、水上蒸馏法。为提高馏出液的浓度，一般需将馏出液进行重蒸馏或加盐重蒸馏。常用设备为多能提取罐、挥发油提取罐。

渗漉法

渗漉法是将适度粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。渗漉属于动态浸出方法，溶剂利用率高，有效成分浸出完全，可直接收集浸出液。适用于贵重药材、毒性药材及高浓度制剂；也可用于有效成分含量较低的药材提取。但对新鲜的及易膨胀的药材、无组织结构的药材不宜选用。该法常用不同浓度的乙醇或白酒做溶剂，故应防止溶剂的挥发损失。

（1）单渗漉法

系指用一个渗漉筒的常压渗漉方法。操作过程是：①粉碎药材：粉碎度应适宜，一般以粗粉或最粗粉为宜。过细易堵塞；过粗不易压紧，溶剂消耗量大，浸出效果差。②润湿药粉：药粉应先用适量浸提溶剂润湿，使之充分膨胀，避免在渗漉筒中药粉膨胀而造成堵塞。③药粉装筒：渗漉筒底部装假底并铺垫适宜滤材，将已润湿膨胀的药粉分次装入渗漉筒，应松紧适宜，均匀压平，上部用滤纸或纱布覆盖，并加少量重物，以防加溶剂时药粉浮起。④排除气泡：打开渗漉液出口的活塞，从药粉上部添加溶剂至渗漉液从出口流出，溶剂浸没药粉表面数厘米，关闭渗漉液出口。⑤药粉浸渍：一般提渍24～48h，使溶剂充分渗透扩散。⑥渗漉：打开渗漉液出口接收漉液，漉液流出速度以1000g药材计算，通常每分钟1～3ml.渗漉过程中应不断补充溶剂。使溶剂始终浸没药粉。

（2）重渗漉法是将多个渗漉筒串联排列，渗漉液重复用作新药粉的溶剂，进行多次渗漉以提高渗漉液浓度的方法。重渗漉法溶剂利用率高，浸出效率高。渗漉液中有效成分浓度高，可不必加热浓缩，避免了有效成分受热分解或挥发损失。但所占容器多，操作较麻烦。主要设备为渗漉筒。

5结束语 由于条件限制，笔者没有亲自尝试文中提到的部分提取方法，这篇文章只是介绍下当今中药提取的主要方法而已。

第三篇：几种核酸提取方法概述

几种核酸提取方法概述

(1).浓盐法

利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:

苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.

第四篇：DNA提取方法和试剂作用汇总

1试剂的作用

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。DNA提取分为三个基本步骤

每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

.细胞的破碎

细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。

DNA提取的几种方法(1).浓盐法

A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法;用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.1.动物来源的DNA的提取 1.1经典提取方法

酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高浓度的甲酞胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。

1.2 玻璃棒缠绕法

该 法 用 盐酸肌裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个带钩的或前端为U形的玻璃棒在这两层液体的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并于室温下蒸干乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸人TE中过夜，使其重新吸水膨胀进而和玻璃棒分离。这种方法对操作技术要求较高，但简单快速。

1.3 血细胞DNA的快速提取法

采用 非离子变性剂NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解细胞，提取细胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。这样从血液中分离获得的DNA纯度高，能够满足各种临床检验和实验的需要。也可采用NP40和Tween-20同时作用破碎细胞膜，以避免SDS对以后步骤的负面作用。Ba sun i等 [‘〕采用了4种常用的从血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 试剂盒法、QlAamp试剂盒法、Tri-PureTM试剂分离提取法以及经典酚抽提法，对通常作抛弃处理的血凝块进行人DNA 及病毒DNA的抽提，发现前两种方法可以迅速高效获得目的DNA，从而建立了由血凝块中提取DNA的方法，扩大了临床检验样本的来源。

1.4 玻璃颗粒吸附法

在该 法 中首先利用含异硫氰酸肌的细胞裂解液裂解细胞，然后加人含有能够与DNA 结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合染色体DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以与DNA 进行结合，一定大小的硅胶颗粒也可以与 DNA进行结合，据此，不少实验工作者实践了很多利用颗粒结合DNA 的提取方法。Pichler等[2〕在从抹香鲸(Physeter macrocephalus)牙齿及骨骼中抽提DNA时采用了一种以二氧化硅为吸附介质的方法，从抹香鲸标本骨骼组织中钻取的少量粉末中获得了足够用于分析的DNA产物，此方法扩大了对稀有哺乳动物DNA研究的取材范围。Caldarelli-stefano等[3〕在从福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织标本中提取DNA时利用小磁珠作为结合核，也获得了理想的纯化 DNA。很多试剂公司也依此设计生产了许多颗粒提取试剂盒，Pint。等[4]就探讨了采用 Gibc。公司的GlassMAX系统，对福尔马林固定的组织进行DNA提取的具体操作方法，目前这些试剂盒在临床上广为应用，省时省力。

1.5 三乙醇胺月桂基硫酸盐(TLS)法

由于 常 规 方法中使用的蛋白酶K的水解条件不好掌握，采用TLS来提取组织、细胞以及外周血DNA可以克服这一弊端。TLS是一种较强的表面活性剂，将其直接作用于细胞或组织匀浆，可迅速溶解细胞膜、核膜，而且蛋白质与其结合后即失去对DNA 的结合，进一步的纯化可采用常规方法。

1.6 临床病理标本的DNA提取方法

由于 PC R技术不仅可用于基因分离、核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控研究、基因病的诊断及肿瘤发生机理的探讨等。近年来，PCR技术已广泛应用于病理学研究，尤其对福尔马林固定石蜡包埋病理标本进行相关的研究更成为关注的焦点。对于从这些病理标本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，该法虽然效率较高，但费时费力，而且其操作中要求多次离心，增加了样品污染的可能性。近年来很多高效灵敏的方法在实践中得以采用，这些方法通常采用加热或微波法〔s〕去除包埋的石蜡，使用Sephadex G-5。柱色谱或盐析法[s7等去除蛋白质。高文涛[71等在研究福尔马林固定石蜡包埋组织 DNA提取方法对PCR的影响时，发现在组织切片中加人鳌合树脂(Chelating Resin，亚氨基二乙酸)提取获得的DNA可取得较好的PCR扩增结果。Coombs等〔s〕则采用热循环方法，将标本上的蜡融人样品溶液，在酶的作用下进行裂解，然后用Chelex-100进行吸附，离心去蜡，这种方法安全、简便、有效、经济。1.7 盐析法

该 法用 饱 和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的DNA质量可以满足PCR模板的要求，但产率相对较低，纯度较差。谭建明等[9]对上述盐析法进行了改进，即将处理过的样本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质，并经离心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤，可用于人体各种样本DNA的提取，所获DNA的纯度可以满足各种检测的需要。植物来源的DNA提取

利用 基 因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组总 DNA的制备，不同植物的核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代谢产物— 多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物DNA纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性。因此要从富含多酚和多糖的植物组织中分离获得高质量的基因组 DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下几种。

2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法

CTAB 是 一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使DNA和多糖分开，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在该法中使用的聚维酮(PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解[121。王卓伟等[13〕在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVI〕还能有效地去除多糖。罗志勇等[14〕在研究中对这种方法进行了几点改进: ①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中琉基乙醇的含量，同时加人PVP使其与多酚类物质结合形成复合物;③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA, Porebski等[1s]在沉淀粗提 DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5m o卜L-’以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16] 对传统的CTAB法进行了优化，创建了一种从新鲜草本植物样本中提取DNA的方法。首先在特制的有96个孔的托盘上种植植物样本，并依照不同样本在托盘中的位置进行编号，然后取适量植物叶子分装在充满提取液的塑料袋中，除去袋中的空气并封口，再用特制的手工匀化器将各袋中的样本混匀，56`C孵育 1h后将袋中的液体取出进行离心以及DNA 的沉淀。Xin等〔17〕则采用简易的96孔托盘作为提取时的容器，将多种植物样本经研磨处理后分别放在不同的孔中进行提取，在一天内由一人就可完成上千个样本的DNA提取，为高通量植物基因分析及筛选提供了极大的便利。

2.2 SDS法

为 了避 免 CTAB法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDSTris-Cl--EDTA等直接裂解细胞使其释放出DNA的方法]。在该法后续的DNA纯化过程中通常采用酚/氯仿处理，但对于植物 DNA纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低DNA的提取效率和纯度。在用该法提取DNA的过程中采用较大的离心力和较长的离心时间，然后用氯仿一异戊醇代替酚来去除变性蛋白质，从而克服了由于酚的掺人及残留对以后酶切带来的困难。用琉基乙醇代替SDS，对大豆DNA分离提取能够更有效地去除蛋白质，而且可以有效防止褐变，获得天然双链高分子量的DNA产物，并且减少了SDS对 PCR、随机扩增多态性DNA技术(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影响。在对辣椒DNA进行提取时为了提高DNA的产率将待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且针对辣椒叶子中多酚类物质极少的特点将其中的加人PVP的步骤省去，消除了PVP对以后操作的影响.2.3 氯化千法在对称猴桃的基因组DNA 提取过程中选用了氯化节法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能是氯化节不仅可与植物细胞壁上的多糖经基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的All基反应，起到破坏糖链的作用，利于DNA的释放和提纯。

2.4 高盐低pH法

该 法 中 所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。通常采用的无机盐为醋酸钾，低pH的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。与一般氯仿一异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作相比该法操作更方便省时，所需样品量少，适用于 濒危植物DNA的提取。

2.5 果胶酶法

Ste ve n等 [2s采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理使与DNA共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与DNA一起沉淀下来，降低了DNA的纯化难度，提高纯化效率。微生物来源DNA的提取

常规 的微 生物DNA提取多是根据某种微生物的具体特点选择合适的方法。在实际的科学研究过程中，很多科学工作者通过实践总结出许多快速实用的提取方法，现择其中比较典型的加以总结。

3.1 细菌质粒的提取方法

质粒是独立于细菌染色体DNA之外的环状DNA，它能携带外源基因进人细菌进行扩增，或表达外源基因，是基因工程中常用的载体，在DNA重组技术、DNA测序、转基因等方面具有广泛的应用。对于细菌质粒的提

取比较经典的方法有:碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。这些方法的选择取决于质粒的大小、细菌菌株的性质等。Keunosky等GE_发展了一种以 Zn'+诱导DNA沉淀的方法，在该法中利用一定浓度的ZnCl:溶液使一定体积的细菌菌液质粒DNA大量沉淀，无需多次离心，大大简化了抽提的步骤。

近年 来，一些生物技术公司，比如Promega公司及Qiagen公司等纷纷推出质粒抽提试剂盒，这些试剂盒多运用树脂材料或硅胶来特异性的吸附质粒DNA，提取过程用时少，效率高。

3.2 真菌DNA提取方法

对 真菌 DNA的提取关键是破碎细胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷冻处理增加细胞壁脆性的物理破壁法。在这两种方法中酶解破壁法较为简单，易于操作和控制，而物理破壁法在处理过程中容易造成细胞核的大量破损。在提取获得核酸一蛋白质复合物后，对其中蛋白质的沉淀也多采用传统的氯仿一异戊醇沉淀法或高盐沉淀法。韩利刚等C25用CTA13法直接从丝状真菌的新鲜菌丝中提取DNA，并将所提取的DNA进行 RAPD，得到了较清晰的扩增图谱。Loeffler 等[Z6为满足快速灵敏准确的临床检验的需要，利用MagNA Pure LC系统建立了一种实用的快速提取方法，该法自动化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等[z7〕在对真菌进行DNA抽提时采用几个循环的快速制冷、煮沸以破碎真菌细胞壁，并通过Qiagen 公司的QIAquick DNA纯化柱，迅速从极微量的真菌中获得高纯度的DNA大分子。3.3 结核杆菌DNA的提取方法

利用 PC R微孔板杂交技术检测临床标本中结核杆菌DNA是诊断结核杆菌感染的一种快速灵敏和特异的方法。从不同的临床标本中获得DNA是检测准确和成功的关键。而不同来源的结核杆菌又分别受到不同来源材料的影响，所以提取方法各不相同。同时由于结核杆菌的细胞壁比较厚不易破碎，一般的微波法、异硫氰酸肌法、冻融法等难以破坏结核杆菌的细胞壁。通常采取的方法有:经典酶一酚一氯仿法，碱一SDS裂解法，碱裂解煮沸法，超声裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。杨正林等[28〕通过对以上几种方法的比较发现玻璃粉一硅吸附法操作简单，假阳性低，适合临床检测使用。3.4 土壤微生物总DNA的提取方法

土壤 中 细 菌的含量丰富，种类齐全，从中提取细菌DNA可用于检测不可培养的细菌，跟踪某些目标菌或重组基因在自然环境中的行为，也可用来解释土壤微生物生态系统中的基因的多样性及其随环境的变化。从土壤中提取和纯化DNA是最关键的技术之一。Courtoi:等[29]对比了在土壤中直接裂解微生物体、然后提取DNA和先将微生物菌体通过梯度离心与土壤颗粒分开再进行提取的方法，利用PCR技术以及杂交技术检测不同方法获得DNA的种类和纯度，发现前一种方法具有更高的效率，能够提取获得较多微生物物种的 DNA。张瑞福等[30]采用SDS高盐提取法和透析袋回收法对9种不同来源的土壤进行微生物DNA的提取，与通常采用的对菌体细胞的超声破碎法以及对粗提DNA的微型柱纯化法相比，既保证了一定提取与回收效率，又兼顾了DNA的质量，使DNA在提取和纯化过程中不会受到损伤。4 海洋生物DNA的提取方法

海洋 是 地 球上最大的生物资源库，同时由于海水的保护使海洋生物变化很少，物种得到较好的保存，这样就为研究生命现象的基本问题提供了丰富的资料。在利用这些资源探讨诸如生命的起源、生物进化、生物与环境的关系、改造海洋生物以为人类服务(如生产某种药物)时离不开对生物核酸的研究。对于海洋来源的动物、植物、微生物由于其不同于陆生生物的组织和细胞结构特点往往采用不同的DNA提取方法。

张海 琪 等 [31_在对不同方法保存的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)肌肉样品基因组 DNA进行提取时发现，经福尔马林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的样品可以同鲜活样品和冷冻样品一样获得基因组DNA，但相比之下采用乙醇作为固定剂更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，获得了满意的效果。杨文新等[32〕利用75%的乙醇固定鲍鱼(Haliotis discus)样本并进行DNA的提取，证明用乙醇固定海洋动物组织是一种切实可行的方法，材料处理后可同步提取，增加了实验的同步性、可比性，适用于大量样本的提取。由于组织中含有许多DNA酶，绝大多数DNA酶需要一个二价阳离子作为辅助因子，因此采用含适量EDTA的乙醇固定剂是野外标本采集和运输的一种更简便有效的方法。

韩兵 社 等 33:针对传统的有机溶剂提取工艺进行改进，应用多种萃取液体系从废弃物鱿鱼肝脏中提取核酸，与原工艺相比，核酸提取产量提高30%-60%，整体工艺得到简化，而且避免了有机物的残留。

赤 潮 是 在特定的环境前提条件下，海水中的某些浮游生物、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象，对海洋渔业、水产资源以及人类的健康造成很大的威胁。发生赤潮的生物类型主要为藻类，铜绿微囊藻(Microcytis aeruginosa)是造成赤潮的藻类之一。陆源等[34〕用乙醇乙醚混合液对纯化的铜绿微囊藻作预处理，破坏了其胶质鞘，从而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其细胞壁，细胞内的DNA释放完全，提高了总DNA的得率。通过提取获得的DNA有助于开展对有害藻类的研究，为防范赤潮提供依据。在对 紫 菜(Porphyras p.)进行DNA提取时，郭宝太等[35〕先用海螺酶处理样品制备紫菜体细胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解细胞提取总DNA，再用Wizard DNA clean-up;树脂进行纯化。经海螺酶处理的紫菜细胞解决了通常采用的液氮破碎细胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有严重的多糖污染等难题。但这种方法对植物组织需求量较多，不适于个体体积小的紫菜。刘必谦等[36〕采用美国Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ-10小量柱式基因组DNA提取试剂盒对个体体积较小的圆紫菜(Porphyra suborbiculato)、铁钉菜(Ishige okamurae)等进行DNA 的提取，获得高纯度的基因组DNA，完全能满足酶切片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技术的需要。

陈子 桂 等[371以海洋尾丝虫(Uronema marinum)为材料，针对纤毛虫难以建立培养以及个体丰度不高等特点，就微量条件下提取DNA的方法进行了探讨，成功地获得了活体直接提取、活体酚/氯仿抽提、固定标本直接提取以及固定标本酚/氯仿抽提等四种简便有效的微量DNA提取方法，解决了纤毛虫微量DNA提取的困难。

综合 DN A的提取方法，虽然不同生物 DNA的提取方法不尽相同，但各种提取方法也有很多相通之处，可以相互借鉴。随着生物技术的飞速发展，对这一技术的经验总结将会越来越多，一些生物领域新的DNA提取方法也将逐渐固定下来，更为简捷、高效的方法也必将出现，为基因工程提供更高纯度的DNA.1）学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。（2）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA样品。【实验原理】

DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。【仪器、材料、试剂】

（一）仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5．微量移液器 6．高压灭菌锅

（二）材料 1．生理盐水

2．十二烷基硫酸钠（SDS）3．三羟甲基氨基甲烷（Tris）4．乙二胺四乙酸（EDTA）5．饱和酚 6．氯仿 7．异戊醇 8．无水乙醇 9．75%乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase酶

12．手术剪刀、镊子、吸水纸 13．微量取液器

14．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL离心管架、记号笔

（三）试剂配制 1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2．生理盐水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法：

在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES缓冲液（释放DNA）100ml 配制方法：

将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5．10% SDS（变性剂 破细胞壁）100ml 配制方法：

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。6．蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。7．RNA酶（降解RNA）配制方法：

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于–20℃。8．氯仿：异戊醇=24：1 100ml 按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4℃保存备用。9．TE缓冲液（溶解DNA）PH8.0 50ml 配制方法：

将0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。【实验步骤】

1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。2．加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。3．放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。6．加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。7．12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。8．-20°C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。9．加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20°C保存备用。【注意事项】

1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。

4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。

第五篇：家庭困难住房公积金提取方法

提取额度

第十七条 职工或其直系亲属患重大疾病或遇到不可预见的事故、灾难，造成家庭生活严重困难时，可以提取住房公积金支付医疗费和事故、灾难费用，但提取总额不超过医疗费和处理事故、消除灾难费用个人负担的部分。

提供基础材料

第十九条 职工提取住房公积金时，均需提供以下基础性资料：

（一）职工本人身份证原件及复印件；

（二）《住房公积金提取审批表》（以下简称《审批表》）；

（三）银行出具的公积金个人账户信息单。

提供专项材料

（十四）职工患重大疾病或遇到不可预见的事故、灾难，造成家庭生活严重困难的，需提供 下列证明资料：

1.患重大疾病的，需提供二级甲等以上医院诊断证明和住院专用收据以及单位或街道办事处出具的家庭生活严重困难的证明原件及复印件。

2.如遇不可预见事故、灾难的，需提供单位、街道办事处或有关部门出具的事故、灾难证明材料和个人承担费用的明细发票以及单位或街道办事处出具的家庭生活严重困难的证明原件及复印件。

直系亲属患重大疾病或遇到不可预见的事故、灾难的，除需提供本款上述资料外，还需提供同一户口簿或公安机关、公证部门出具的直系亲属关系证明原件及复印件。

提取方式

转账支付，职工申请提取住房公积金，分支机构审批后，将资金转至其单位基本账户，无单位的将资金转至其个人储蓄账户；发放住房公积金专用卡后，将资金直接转至职工住房公积金专用卡内。

咨询电话：6653160

1所需材料汇总

1、职工本人身份证原件及复印件

2、《住房公积金提取审批表》

3、银行出具的公积金个人账户信息单

4、诊断证明原件及复印件

5、住院专用收据原件及复印件

6、单位或街道办事处出具的家庭生活严重困难的证明原件及复印件

7、同一户口簿或公安机关、公证部门出具的直系亲属关系证明原件及复印件