甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

第一篇：甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施

发布日期:2007-7-31 热门指数:5511 收藏

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施

亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：

(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5．0；

(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；

(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；

(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。

只要遵循以上几点基本上能保证99％ 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96％已经降解。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象)。

二、甲基化特异PCR可能出现的问题与对策

1．引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。

MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C—U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计，同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，网址为http：／／www．urogene．org／methprimer／index1．html。根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5．0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30％ 的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。

2．MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260／A280在1．8～2．0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg“浓度一般在2．0～2．5 mmoL／L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及Taq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka—ra公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

3．MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况：(1)产物电泳为阴性；(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带)；(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95。C，10 rain)和变性温度(>95℃，1 min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。

总之，在MSP全过程中，影响结果的因素较普通PCR要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。

对于该文章的一些观点，我也提出一些意见和大家讨论。

(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好。（我们实验室就答亚硫酸盐就大于这个浓度）

(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底。（这点我深有体会，因为如上所述，我当时也怀疑4h可能修饰不完全，分别就做了6h,12h,16h.确实发现修饰时间过长，模板破坏加剧，可能不倒2个星期就降解了，当时P处M的，后来居然只能P出U.(4)DNA模板量应控制在<2 g为宜。(这个我想大家应该都理解，主要是为了修饰完全）

第二篇：林业行政处罚案件案卷中易出现问题与分析

在林业行政处罚案件文书制作中容易出现的问题

1、没有使用统一的法律文书或法律文书混用

在办理林业行政案件中，使用公安行政等其他法律文书，林业行政案件只能使用林业局的法律文书。

2、案卷装订顺序不正确，要按照下列案卷装订顺序办理:

3、未按规定办理立案手续

（1）没有填写《林业行政处罚登记表》。

（2）“案件来源”填写不规范或一个案卷中前后不一致（常见案件来源有下列几种：执勤巡逻发现、电话举报、受害人控告、有关单位移送、上级机关指定和违法行为人主动交代）。

（3）案件性质前后不一致。

（4）受案机关错误（以林业局名义处罚的案件，受案机关为阿旗林业局、以森林公安机关处罚的案件，受案机关为阿旗森林公安局，不可再填写各办案所、队）。

（5）受案时间错误（受案时间以案件介入时间为准）。

（6）简要案情不能缺项（时间、地点、人员、事实经过）。

（7）没有承办人的受案意见、签名、时间。

（8）举报、控告、移送案件没有行政负责人审批(除执勤巡逻发现案件外案卷内都必须有出处警登记表)。

（9）立案时间超过七日。

4、案件名称不准确

是指不符合有关法律、法规或条例规定的案件名称的情况（常用案件名称有：封禁期内放牧、自然保护区内放牧、擅自进入保护区、盗伐林木、滥伐林木、非法运输木材、非法加工木材、擅自开垦林地、非法开垦林地、擅自改变林地用途、未完成更新造林任务、毁坏林木、保护区内采挖药材、非法采集野生植物、非法收购野生植物、非法狩猎、非法倒卖野生动物产品）。

5、执法人与案卷皮上不一致（卷皮上案件主办人必须与卷内承办人一致）。

6、意见书上的查处截止时间为提出意见时间一致（从案件介入时间至提出意见时间）。

7、处罚依据、条款准确、前后一致。

8、作出处罚的种类顺序前后要一致；结案时间以罚没款上缴银行时间为准。

9、告知笔录不规范

（1）大额罚款没有使用《林业行政处罚权利告知书》。（第三条：《新疆维吾尔自治区行政处罚听证程序实施办法》对当事人依法作出责令停产停业、吊销许可证或者执照、对公民处以500元以上、对法人或者其他组织处以20000元以上罚款等）

（2）告知单位混淆（以林业局名义处罚的案件告知单位是森林公安的）。

（3）告知笔录没有规范填写拟作出行政处罚决定的事实、理由及依据，以及告知人有对上述告知事项进行陈述和申辩权利。

10、当事人陈述和申辩不规范

（1）没有记录人进行陈述和申辩。

（2）没有当事人签名或盖章的。

（3）当事人放弃陈述和申辩权利的没有文字表述和记载。《中华人民共和国

行政处罚法》第三十二条“当事人有权进行陈述和申辩。行政机关必须充分听取当事人的意见，对当事人提出来的事实、理由和证据，应当进行复核；当事人提出来的事实、理由或者证据成立的，行政机关应当采纳。”

11、未履行听证程序

（1）适用听证程序的（大额罚款既对公民处500元以上、对法人或者其他组织处以20000元以上）作出处罚决定前，未向当事人告知其有依法要求听证的权利或者未依法向当事人出具《听证权利告知书》的。(新疆维吾尔自治区行政处罚听证程序实施办法)

（2）当事人要求听证，未按有关规定举行听证，直接作出处罚决定（处罚决定书上处罚时间在告知时间三日之后）。

12、要有被告知人亲笔签名和告知时间。

13、行政处罚填写不完整、不准确

例如：盗代、滥伐林木案件处罚决定书上没有填写责令补种树木的处罚，只填写罚款的处罚；非法运输木材案件中，没有填写没收非法运输的木材的处罚，只填写了罚款的处罚。

《中华人民共和国行政处罚法》第八条：行政处罚的种类：

（一）警告；

（二）罚款；

（三）没收违法所得、没收财物；

（四）责令停产停业；

（五）暂扣或者吊销许可证、暂扣或者吊销执照；

（六）行政拘留；

（七）法律、行政法规规定的其他行政处罚。

14、行政复议机关填写错误、复议时间填写错误

（1）以林业局名义作出行政处罚的，复议机关为：××人民政府或者××市林业局；以森林公安局名义处罚的，复议机关为：××人民政府或者××市森林公安局。

（2）复议时间为60日诉讼时间为3个月。

15、作出处罚决定的时间除大额罚款在处罚意见和告知时间的第三天后，其他案件的决定时间为提出意见的第二天。（不包括当事人当天自行交纳罚款）。

16、送达回证填写不规范

（1）大额罚款的案件需要2份回证，先送达《林业行政处罚告知书》后送达《林业行政处罚决定书》。

（2）送达时间前臵（送达时间必须在处罚决定书之后）。

（3）备注中填写：送达地点、送达方式、和送达人。

17、罚款收据上的人名要与被处罚当事人一致。

18、没收实物收据、没收物品审批表及发还物品缺一不可

例如盗伐林木案不仅要有没收实物收据、有没收物品审批表，还要有发还物品凭证。

（1）要对没收的实物有相应的说明。

（2）要有被处罚人签名盖章。

（3）没收物品审批表上的承办单位意见签名不得与案件主办人员重复（例如盗伐林木案件中承办人与承办单位负责人不可重复）。

（4）对没收物品要有去向，需填写《发还物品凭证》。《发还物品凭证》上

要有领取人签名或盖公章（盗伐天然林木的能返还给所在苏木、乡镇的，返还给所在苏木、乡镇，要有所在苏木、乡镇的负责人签名或盖公章；盗伐个人的林木可返还给林木所有人）。

19、证据不足

指只有当事人一份笔录，没有其他证据佐证或有关证据材料缺乏效力性等（封禁期放牧除外），如收集的证据材料与案件无关；影像、照片模糊，重点部位显示不清或没文字记录确认为证据的情况。

20、鉴定结论不规范

（1）未对案件专门技术问题进行鉴定，影响案件定性、处理。

（2）受委托鉴定单位或人员不具有鉴定资质。

（3）鉴定结论不明确。

（4）没有鉴定部门盖章和鉴定人员签名或盖章。

（5）没附鉴定人员资质证书。

21、没有现场勘查笔录、现场勘验检查笔录填写不规范

（1）指应当进行现场勘验、检查的没有进行勘验。

（2）没有见证人和有关当事人的签名或盖章，又没有说明原因的。

（3）勘查事项和结论填写不够完整。

22、没有现场示意图

除封禁期放牧案件外，每个案卷都要有现场示意图（简易图即可，能让人看出发案地点的大致位臵，但必须与现场勘验一致）。

23、除5cm以内的幼树都必须有立木测算表

24、执法证件出示错误

（1）没有出示林业行政执法证件的文字记录。

（2）按一般程序办理的林业行政处罚案件进行案件调查时，办案人员少于两人（询问人必须有民警及记录人签名）。

（3）在林业行政处罚决定书上没有填写执法证件号码。

25、询问笔录上每页都要有当事人的签名和手印、询问笔录为多页的要有当事人的骑缝手印。

26、没有页码

每本案卷都必须标有页码，标出的页码要与卷内文书目录上所标的页码一致。

28、坚持召开通案会

除封禁期放牧案件以外，对个人处罚500元以上对单位或组织处罚20000元以上的案件，需召开通案会，由通案会集体讨论决定（路远交通不便等特殊情况下，在作出处罚前必须同分管局长沟通，由分管局长同意后作出）。

29、卷内有书写的需要用黑色或蓝色墨水（建议用黑色签字笔）；

30、卷皮需整洁美观