土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

第一篇：土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取

实验目的：

1、从土壤中分离产抗生素的放线菌

2、放线菌的培养

3、放线菌的发酵产生活性物质

4、放线菌产生的活性物质提取。实验原理：

放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。实验器材：

1、土壤

2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基

3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。实验步骤：

一、土壤放线菌株的采集

采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

样品（土壤）处理：室温风干

二、土壤中放线菌的分离、培养

1、配制淀粉培养基

淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释

① 将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。

② 用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

③ 按1：:1稀释至10-

3、10-

4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-

3、10-

4、10-5，稀释过程应在无菌条件下进行。

3、将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入3%的重铬酸钾数滴（大约100ml加0.3ml），混合均匀。分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。

4、平皿倒置于培养箱28℃恒温培养一周左右。

5、将平皿上的放线菌菌落跳去在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。

6、将纯化好的菌落转入到斜面，4℃条件下进行保存。

三、抗菌谱的测定

1、挑取一个放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周左右。

2、将2ml培养8h的大肠杆菌分别加到200ml灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培养皿中均匀放入4个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液。培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h。

4、测量抑菌圈的大小。

四、发酵

1、配制种子培养基

蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml，PH值7.2,121℃灭菌20min。

2、配制发酵培养基

蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml，PH7.2。121℃灭菌20min。

3、种子液的制备

将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-1 培养4天。

4、发酵培养

以6%的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-

1培养4天。

5、活性检测

发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取。

2、活性检测

将萃取液浓缩，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

第二篇：放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取

一、实验目的

1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法

2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法

3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论

4、了解小型发酵罐的基本结构

5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养

6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法；

7.掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基

本原理和操作技术

二、实验原理

①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。

②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌 培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。

③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。

抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。

常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入供试品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。先测量出四点的抑菌圈直径，按下列公式计算出检品的效价。

（1）求出W和V： W=（SH+UH）-（SL+UL）(式 2.10-1)V=（UH+UL）-（SH+SL）(式 2.10-2)式中：UH：供试品高剂量之抑菌圈直径； UL：供试品低剂量之抑菌圈直径； SH：标准品高剂量之抑菌圈直径； SL：标准品低剂量之抑菌圈直径；

（2）求出θ： θ=D·antilog（IV/W）(式 2.10-3)式中：θ：供试品和标准品的效价比；

D：标准品高剂量与供试品高剂量之比，一般为1 I：高低剂量之比的对数，即log2或log4。⑶求出

Pr

：

Pr

=

Ar

×

θ

(式 2.10-4)式中：Pr：供试品实际单位数； Ar：供试品标示量或估计单位

④甲醛滴定法测定氨基氮含量：水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物，使NH3+上的H+游离出来，这样就可用碱滴定NH3+放出的H+，从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸，由甲醛滴定的结果即可算出氨基氮的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值保持恒定。

甲基红的变色范围是PH4.4~6.2,意思是说: 1.其pH值在4.4~6.2区间时,呈橙色, 2.其pH值≦4.4时,呈红色,因是靠近酸性强的一边时的颜色,故又称之为酸色。

3.其pH值≧6.2时,呈黄色，因是靠近碱性强的一边时的颜色,故又称之为碱色

二、仪器与材料

（一）培养基

高氏一号培养基：

可溶性淀粉 20.0g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g FeSO4.7H2O 0.01g 蒸馏水 1000ml，PH 7.4，发酵瓶培养基：

淀粉3%,葡萄糖2%, 黄豆饼粉2.5%, 蛋白胨0.5% ，酵母粉0.5%, MgSO4 0.1%,(NH4)2SO4 0.3%, KH2PO4, 0.03%，CaCO3 0.4%, PH 6.0。

黄豆饼粉 4g, 淀粉10g, 酵母粉0.25 g , 蛋白胨1.5g，MgSO4 0.025 g, CaCO3 0.4g,(NH4)2SO4 0.3 g，α-淀粉酶（105u/ml）0.01ml.100ml PH7.4-7.6 可溶性淀粉 2.0g，NaCl 0.05g，KNO3 0.1g, K2HPO4 0.05g，MgSO4.7H2O 0.05g，FeSO4.7H2O

0.001g，加蒸馏水至100ml，PH 7.4，牛肉膏蛋白胨

牛肉膏(5.0g），蛋白胨（10.0g），NaCl（5g），蒸馏水（1000mL），pH 7.2~7.4

发酵罐培养基(2L)：

黄豆饼粉 80g 淀粉 200g 酵母粉 5 g 蛋白胨 30g MgSO4 0.5 g CaCO3 8g(NH4)2SO4 6 g Ɑ-淀粉酶（105u/ml）0.2ml（二)流加补料

碳源：葡萄糖（10%）300ml,控制1%；2000*1%=20g,200ml 氮源：硫酸铵（10%）250ml,控制16% 调PH值：0.1MHCl 0.1MNaOH（三)分析指标及方法所用试剂及溶液

测残糖-DNS法

1.3，5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：将6.3g的3，5二硝基水杨酸和2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000ml

2.1.0mg/ml葡萄糖溶液：称取1g葡萄糖，加蒸馏水定容到1L。

3.6mol/l氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠24g,加蒸馏水定容到100ml。

4.6mol/l的盐酸：取浓盐酸49.68ml,加蒸馏水定容到100ml。

测残氮的方法-甲醛法

1.甲基红：0.1g甲基红，用95%乙醇定容100ml。2.0.3mol/LHCL：取浓盐酸2.48ml,加蒸馏水定容到100ml。3.0.02858mol/L NaOH：称0.11432g,定容100ml。4.1%酚酞指示剂：称取1g酚酞指示剂粉末。溶于100ml 95%乙醇溶液中。

5.95%乙醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml。

6.18%中性甲醛：取48ml 38%的甲醛加入小于100ml容量瓶，往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红，定容到100ml。

（四）器材

玻璃试管、试管架、吸管（1ml，2ml，10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（250 ml，500ml）、量筒（250ml，500ml，1000ml）、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲（针）、振荡培养箱、恒温箱、台秤、5L-发酵罐，无菌室、培养皿（直径9 cm）、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台，无菌培养皿，酒精灯，牛津杯，镊子，移液器等等

（五）.生物效价测定所需材料

（1）菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），菌液浓度约为

106个/mL。菌株保存的时间过久，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。

（2）抗生素标准品和供试品：头孢拉定标准品和供试品。（3）培养基：效价检定用培养基1号。

（4）无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，加水1000mL，即为pH 7.8的磷酸盐缓冲液。制备缓冲液的试剂应为分析纯，配制后的缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121℃蒸气灭菌30 min备用。（5）草酸，10 M NaOH

四、实验步骤

⑴筛选高产放线菌

从土壤里筛选出高产放线菌，于斜面培养基中保藏

⑵接种

在超净工作台上，将长好的斜面孢子用无菌接种针挖块约0.5×1cm，接种于灭过菌的高氏一号培养基中。

⑶培养 2 将接种好的种子摇瓶于28℃恒温室摇床上，转速为200r/min，培养48小时左右。

⑷实罐灭菌

1、将冷凝水管路断开，拔下电极，打开罐盖，将发酵培养基装入发酵罐及补料瓶，易产生泡沫的培养基尽量不要超过两升。

2、连接管路：取样管路连接，补料管路连接；空气过滤器用硅胶管与罐盖空气管连接，并用弹簧夹夹紧；排气口与过滤器用硅胶管连接；安装温度电极、pH电极、溶氧电极，pH电极用们帽盖紧电极上端口，溶氧 电极用铝铂纸包裹电极上端口，防止受潮。盖紧其它罐盖接口。

3、提起玻璃罐体及补料瓶放入灭菌锅，盖好牛皮纸，盖好锅盖，确定发酵温度及时间。

4、灭菌结束后，尽快将罐放回原位并尽快通入空气。

⑸发酵操作

1、将灭菌后的罐体放回原位，连接冷凝水管路，通入冷凝水，连接通气管路，调整通气量至3～5L/min。

2、将温度电极、pH电极、溶氧电极与控制器连接。

3、补料管连接：打开补料蠕动泵防护盖，搬开进出口处的白色管夹，将硅胶管嵌入入口处的管夹并夹紧，用手转动泵头，将硅胶管沿凹槽安装直至出口处，开手动开关约十秒后夹紧出口处管夹，关手动开关；将酒精棉球放在罐盖补料口内，将针头插入并穿透密封盖； 打开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液，置于自动状态。

⑹接种

将培养48小时的摇瓶种子接种于发酵罐中，使用接种圈放置酒精棉点燃，进行无菌接种，接入100ml种子。接种后立即进行第一次取样。

⑺发酵生产

⑻发酵过程的测定：

发酵液状态观察：粘度、颜色、气味、菌丝形态

发酵中残糖的测定-DNS法：

1.取1.0mg/ml葡萄糖标准溶液，按下表加入试剂。沸水浴加热5min，冷水冷却定容至25ml摇匀，在520nm按波长测吸光度。

编号

葡萄糖标准溶液/ml

水/ml

溶液糖含量/mg

DNS试剂/ml 0 1 2 0 2 0 0.2 0.4 0.6

1.5 1.5 1.5 1.5 0.2

1.8 0.4

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3

0.6 4

0.8 5 1.0

0.8

1.5 1.0

1.5 1.2

1.5 1.5 1.5 6

1.2 7

1.4 8

1.6

0.6

1.4 0.4

1.6

2.取发酵液0.5ml置于50ml容量瓶中，加6mol/l的盐酸溶液2ml，在沸水溶液中加热15min水解，冷水冷却后及时6mol/l氢氧化钠溶液1.8ml，并定容到50ml的总糖水解液。

3.取总糖水解液2ml于25ml比色管中，加入DNS试剂1.5ml沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25ml摇匀，以空白作对照在520nm波长测吸光度。

氨基酸氮的测定：甲醛法(陈钧鸣和徐玲娣,1991)。取2ml发酵液滤液于三角瓶内,加蒸馏水10ml,甲基红指示剂2滴,用O.3MHCI调节pH至溶液呈红色,再用0.02858MNaOH溶液调pH至溶液呈橙色(中性),加18%中性甲醛溶液4ml,摇匀,静置10min,加l%酚酞指示剂8滴,用0.02858NNaOH标准溶液滴定至微红色为终点。氨基氮的计算公式为:氨基氮(mg/l00ml)=滴定体积*20。

⑼放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的

1、配制培养基高压灭菌。

2、倒平板。

3、涂布指示菌。

4、以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。

5、收集发酵液，缓缓加入草酸将发酵液酸化至pH 1.4-3.0左右，70 ℃，2 min，以10000 rpm离心20 min。

6、取上清加入水稀释20%左右，在4℃，用10 M NaOH中和至pH6.4-6.8。

7、吸取中和液100 μL 加入牛津杯中，37℃培养16hr，观察结果。

⑽效价测定 1.称量

称量前，将抗生素标准品和供试品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30 min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强的抗生素在称量前1~2小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20 mg，取样后立即将称量瓶或适宜的容器及被称物盖好，以免吸水

称样量的计算W=V*C/P(式 2.10-4)式中：W：需称取标准品或供试品的重量（mg）

V：溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（mL）

C：标准品或供试品高剂量的浓度（U/mL，μg/mL）P：标准品的纯度或供试品的估计效价（U/mg，μg/mg）2.稀释

从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。标准品或供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2 mL，稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2~3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，（预计不够时，应事先与另一瓶混匀后再用），以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1，但所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。3.双碟制备

在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20 mL），取已融化的培养基20 mL注入双碟内，作为培养基的底层，等凝固后更换干燥的陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。取出试验用菌悬液，按已试验适当的菌量（高浓度所致的抑菌圈直径18~22 mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48~50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌大口5mL吸管，吸取菌层培养基5 mL，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上待凝固，用陶瓦盖覆盖，放置20~30 min，备用。4.放置钢管

用钢管放置器，或其他方法将钢管一致、平稳地放入培养基上，钢管放妥后，应使双碟静置5~10 min，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液

每批供试品取5~10个双碟，滴加溶液用毛细滴管或定量加样器，在滴加之前须用滴加液洗2~3次。在双碟的4个钢管中以对角线滴加标准品与供试品溶液的高、低二种浓度的溶液，滴加顺序为SH→TH→SL→TL，也可用SL→TL→TH→SH。（S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度），滴加溶液至钢管口平满，注意滴加溶液间隔不可过长，因溶液的扩散时间不同影响测定结果。滴加完毕，用陶瓦盖覆盖双碟，平稳置于双碟托盘内，双碟叠放不可超过3个，避免受热不均，影响抑菌圈大小，以水平位置平稳移入35~37℃恒温培养室，培养至所需时间。

6.抑菌圈测量

用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的直径，以毫米为单位，误差不超过0.1mm。

五、结果与计算

根据实验测量的抑菌圈大小，计算抗生素供试品的效价单位。

第三篇：实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集 1 目的

1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。3 材料 3.1 培养基

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。3.2 仪器或其它用具 取样铲、塑料袋、记号笔、1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。

2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。

3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。2)面积中等，地势平整，有些肥力差异的田块采用棋盘式采样法。3)面积大，地势又不平坦，肥力不匀的田块采用蛇型线采样法。土样由20个样点组成。样点分布范围不少于3亩（各地可根据情况确定）。每个点的取土深度及重量应均匀一致，土样上层和下层的比例也要相同。采样器应垂直于地面，入土至规定的深度。采样使用不锈钢、木、竹或塑料器具。样品处理、储存等过程不要接触金属器具和橡胶制品，以防污染。每个混合样品一般取1kg左右，如果采集样品太多，可用“四分法”弃去多余土壤。

4．样品编号和档案纪录：做好采样记录：土样编号、采样地点及经纬度、土壤名称、采样深度、采样日期、采样人等。

第四篇：实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。

实验6

土壤中放线菌的分离（实训）

实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。

2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料：

药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O 作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验步骤：

1.高氏一号合成培养基的制备

高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。

2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备

选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-

3、10-

4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分别从10、10菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10、10的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌

取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-

4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4）平板划线法分离土壤中放线菌

取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。（5）培养

接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。

准备实验内容：

问曾老师借 无菌刮棒 打火机 酒精灯

无菌报纸包（1个）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的试管

培养皿6套 枪头（1mL/0.1mL）

高氏一号培养基500mL（150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题：

1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。

2.观察与记录以下内容。

大小

形状

边缘颜色

表面代谢物

种类 3.如何区分放线菌和真菌、细菌？

放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够，放线菌会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。

第五篇：土壤微生物的分离培养技术实验报告

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学

院： 专业及类别： 学

号： 姓

名： 实验日期： 成绩：

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；；

3、学习习近平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

二、实验原理

1、培养基的种类

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。

已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。

2、接种方法与无菌接种

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。

划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。

穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。

混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。

涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。

本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。

三、实验器材

1、仪器

培养皿、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。

2、材料

土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品

四、实验步骤

1、土壤稀释液的配制

① 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为：在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤（10cm左右），然后将其混合均匀；

② 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液；

④ 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀释液。

2、土豆培养基的制备

① 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂；

③ 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用； ④ 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml；

⑤ 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121℃下灭菌20min；

⑥ 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60℃，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接种与分离

① 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上；

② 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基；

③ 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次；

④ 重复上步，接种10-

7、10-8的土壤稀释液的微生物；

⑤ 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。

五、结果与思考

1、实验结果

图1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。

学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色；细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。

2、思考题

⑴在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？

答：这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。

⑵为什么要把培养皿倒置培养？

答：①操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上；

②培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长;③如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。

六、实验总结 我本科所学专业是材料科学与工程，本次实验是我高中后第一次接触微生物方面的知识。在本次实验课里，段老师先给我们详细讲解了微生物分离培养方面的许多理论知识，然后才进入了理论环节。在实验操作过程中段老师一直在我们旁边观察我们的实验操作过程，一旦出现错误，会立即指出并耐心的给我们讲解应该怎么做，我担心自己从来没做过微生物培养方面的实验会做不好，段老师还一直在旁边鼓励我，并给我讲解了许多微生物分离培养方面的知识，最后我独立完成了本次实验。此次实验课，我真的是受益匪浅，学到了许多微生物分离培养方面的知识，十分感谢段老师。

图2 如图2所示，本次微生物分离培养实验中，有些培养皿里菌落很少，只有一个，有的甚至没有。我认为出现这种情况原因可能是：划线接种时，未等接种环冷却就开始接种，微生物可能被高温杀死；在接种时，酒精灯火焰太大，进行接种操作的全过程又离酒精灯火焰很近，这也可能将微生物杀死。