PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型

第一篇：PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型

PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型

陆韵玲

（广东 广州 510303）

摘要：本实验随机抽取菜市场上的8头猪的猪肉，通过PCR-RFLP技术进行氟烷基因检测。结果表明，被检测到猪的基因型均为NN，未出现Nn和nn基因型，即市场上的猪肉是不含氟烷基因的。PCR-RFLP技术可准确诊断猪氟烷基因，在种猪选育过程中及时淘汰携带氟烷基因的个体，提高猪种质量。

关键词：PCR-RFLP；基因分型；SNP；氟烷基因

随着人民生活水平的不断提高，猪肉品质问题日益受到关注。SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），单核苷酸多态性，指DNA发生了单个碱基的变异。这种变异可能会引起性状的改变或者导致疾病的发生。如猪的兰尼定受体（Rynodine receptor, RYR1）基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸（Arg,CGC）变成了半胱氨酸（Cys, TGC），引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，猪呼吸急促，心跳亢进，肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。对于商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白、质地疏松和有液体渗出等，大大降低了猪肉的经济价值。而氟烷基因是导致猪的应激敏感综合征的主效基因之一[1]。其杂合子（HalNn）虽然在生产性能上有一定优势，但其隐性纯合子（Halnn）是导致发生猪应激综合征。

本试验采用PCR-RFLP技术对随机取自市场的8头猪进行氟烷基因检测，旨在研究氟烷基因对猪的影响，以及检测市场上猪肉的品质。实验材料与方法

1.1实验材料

8头猪的猪肉样本（来自广东第二师范学院附近的市场）。

1.2实验试剂

（1）PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。（2）凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，100×TAE或者100×TBE

缓冲液等，DNA分子量标准，上样缓冲液（6×Loading buffer），溴化乙锭（EB）或者替代物。（3）酶切相关试剂：HhalI限制性内切酶，酶切缓冲液，等。

1.3实验方法

1.3.1猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

取200mg猪肉组织样本，剪碎，置于1.5mL离心管中，加入裂解液650μL,蛋白酶K25μL，混合均匀，50℃恒温孵育14~20h，直到看不到组织块，加入Tris饱和酚400μL，氯仿384μL，异戊醇16μL，室温震荡10~15min，12000r离心10min。取上清液于1.5mL离心管，加入700μL异丙醇（与上清液体积相当），轻轻晃动，直至白色絮状DNA出现，12000r离心10min。弃上清，留沉淀，75%乙醇漂洗，再离心，弃上清，加100μLddH2O（灭菌双蒸水）。

配制1%琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取1μL DNA溶液与5μL上样缓冲液混匀后加入点样孔，将胶放在电泳槽内，200V电泳15~20min后将凝胶取出放在紫外灯下观察并拍照，亮橘色条带表明DNA提取成功。

1.3.2猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

猪HAL基因的结构分析： 登录GenBank查阅获得猪HAL基因序列，分析并设计引物，目的片段包括含有CDS序列第1843位碱基。目前，两条特异引物已经广泛用于检测猪HAL基因，该对引物位于第16和18内含子上，PCR扩增范围包括了HAL基因的第17外显子，具体如下：

上游引物：5’ TCCAGTTTCC CACAGGTCGT ACCA 3’ 下游引物：5’ ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 3’

已有文献报道扩增产物为659bp，根据登录的参考序列，扩增产物实际为660bp。引物由生物公司合成。

PCR反应体系的配制：按照如下比例配制，反应体积为20 μL。各成分的初始浓度和用量如下表1：

表1 PCR反应体系（20μL）

成分

10×Buffer含Mg2+）dNTPs Taq DNA聚合酶 上游引物

最初溶度或者含量 10× nM/mL

体积(μL)2 1.6 0.2 0.4

下游引物 DNA模板 ddH2O 总体积 nM/mL 50 ng/μL

0.4 0.4 15 20 在配制上述溶液时，一般将除了DNA模板外的所有成分混合，均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中（0.2 mL规格）。在分装好的Ep管中加入DNA模板，盖紧盖子，瞬时离心，使各成分混合均匀。

PCR反应程序: 设置如下PCR程序：首先95 ℃预变性5min，然后94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸40s进行35个循环，最后72 ℃延伸5min后冷却到4 ℃。

PCR扩增片段的检测:配制2%琼脂糖凝胶，取3μL PCR反应产物与3μL上样缓冲液混匀将其点入梳孔中，同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准，80V电泳15min后，最后在紫外灯下或者凝胶成像系统下进行观察或拍照。1.3.3PCR产物的RFLP: 按HhaI内切酶说明书要求，取10uL PCR产物，10× Buffer 2uL，0.5uL HhaI内切酶(10U/uL)，加水至20uL，37℃温3h，3％琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。

2结果与分析

2.1猪基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果

提取的DNA检测结果如图1，条带为亮黄色，说明提取的基因组DNA含量较高且蛋白杂质含量较少。

2.2 PCR扩增氟烷基因琼脂糖凝胶电泳结果

氟烷基因PCR产物HhaI酶切结果见图2A。PCR扩增产物经测序其全长大部分为659bp。与GenBank[2]已发表的序列比对后，确认为目的片段。且目的条带清晰明亮且无杂带,表明目的基因扩增效果良好。

2.3氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果

由图2 B可见，在各样品中均没有发现氟烷基因阳性纯合子（HaLnn）；而阴性纯合子（HaLNN）在样品中有4头。这是由于目的基因是含氟烷基因第1843位点、长度为659 bp的片段，HhaI内切酶可识别5-' GCG|C-3'序列，即正常氟烷基因（HalN）序列的第1843位点。酶切后进行电泳、染色,根据电泳图谱中的带型判断个体氟烷基因型。

基因型为HalNN时,由于第1843位碱基为胞嘧啶（C）而有酶切位点，因而PCR产物被酶切为493 bp和166 bp两部分，琼脂糖检测为2条带。如图2 B1，2，3，5条带。

基因型为Halnn时,由于发生了CyT的突变，酶切位点消失，PCR产物为659 bp不变，琼脂糖检测为1条带。

基因型为Halnn杂合子时，琼脂糖检测为659 bp、493 bp和166 bp 3条带。而图2 B4，只有一条亮带，在2000bp处，说明该DNA氟烷基因Hhal酶切不成功，该条带实验失败。

图1 猪基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果

图2 实验结果

A：PCR扩增氟烷基因琼脂糖凝胶电泳结果

B：氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果(M-DNA marker B1,2,3,5-阴性 B4-实验结果失败)3讨论

猪应激综合征检测的传统方法是用氟烷麻醉法，但该方法不能识别杂合子和阴性猪，且操作误差较大。而通过提取DNA利用PCR-RLFP进行检测，可以准确地检测出纯合子和杂合子，这样就克服了用氟烷检测费时、费力而且不能测出杂合子的弊端。本实验进一步验证了该技术在试验过程快速，简便。结果更科学准确，且对猪的创伤性小，节省人力，物力和时间。

此外，国外一些专家认为氟烷基因的存在弊大于利，因此近年来国外一些育种公司纷纷推出无氟烷基因的种猪。但我国学者对此持不同观点。上海农科院的屠宰试验已经初步证明,Nn基因型比NN基因型在瘦肉率、眼肌面积等方面更具优势,这与蒋思文报道的结果一致[3]

。但是，现代的育种手段还不能准确定位和分离及其遗传规律，对瘦肉率的选择更多的依靠常规育种。所以在种猪的选择过程中，携带氟烷阳性基因的猪种容易被选种，使得Haln基因在群中的扩增，给养殖业带来巨大的经济损失。

本实验虽然所检测的猪基本不含氟烷基因，但是，由于样本量少，不能全面地说明问题。另外，实验存在实验误差及有实验的结果是失败的。所以，实验存在很多可以改进的地方，例如：在取样时，能够给不同的猪编号，以防后面实验样本是取自同一头猪的；在提取DNA时，要尽量提高提取出的DNA的纯度，使后面的实验效果更明显。

参考文献：

[1]刘锐.嘉兴市凤桥镇猪氟烷基因检测对PSE肉的影响[J].江苏农业科学, 2011, 39(2): 298-300.[2] Brenig B, Brem G.Molecular cloning and analysis of theporcine/halothane0gene.Arch.Tierz., Dummerstorf 3215,1992.129~135 [3]蒋思文,熊远著,邓昌彦等.猪RYR1基因的PCR-RFLP分析和氟烷基因利用的研究.中国畜牧杂志,1997,33(2):9-10

第二篇：乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎现状如何？

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义

HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

乙肝的治疗方式有哪些？

HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么？

HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种：

（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；

（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；

（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。

HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。

核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。

HBV对NA的耐药分析

1.拉米夫定(LAM)

LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。在LAM初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。LAM主要的耐药突变位点是rtM204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rtL180M联合出现，rtM204V／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他的突变位点有rtL80V／I、rtI169T、rtV173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。

LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。

2.恩曲他滨（FTC）

FTC属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。体内与体外研究均表明FTC耐药位点与LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M变异，FTC治疗1年的基因型耐药发生率为13%～16%，但缺乏长期的耐药数据。

在开始FTC治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。首次出现ALT升高的CHB患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。FTC治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。排除依从性问题后，应及时进行HBV基因型耐药检测以明确FTC耐药情况，相应调整治疗方案。

目前对于FTC耐药挽救治疗证据尚不充分。参照LAM耐药挽救治疗情况，可考虑加用ADV或TDF抗病毒治疗，亦可考虑换用TDF抗病毒治疗。

3.阿德福韦酯(ADV)

ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。

与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rtA181T、rtA181V和rtN236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。4.恩替卡韦(ETV)

ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。

其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2)rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。

5.替比夫定(LdT)

LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。

6.替诺福韦(TDF)

TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。体外实验发现，rtA181／T或rtN236T突变的ADV耐药株对TDF的敏感性下降34倍；若此位点与rtL180M+rtM204V联合出现，则能增加TDF半数抑制浓度10倍以上。

乙型肝炎病毒耐药基因检测的临床意义

（1）在初始治疗前检测，有助于判断是否感染耐药突变株，可以帮助选择初治药物；

（2）在治疗过程中检测，有助于及时发现基因型耐药，从而采取预防措施，避免发生病毒反弹；

（3）耐药发生后检测，可根据耐药情况及时换药加药或更改治疗方案，使患者获得更好的治疗效果。

我们可以提供的乙型肝炎病毒耐药基因和分型检测项目有哪些？

1.2.检测血液中乙肝病毒的DNA浓度（被称为乙肝病毒载量）。这项检测用于监测乙肝病毒在体内复制水平，从而衡量病人的受感染情况以及监测治疗情况。

检测乙型肝炎病毒耐药基因，与六种用于乙肝抗病毒治疗的核苷（酸）类药物相关的11个耐药位点的基因变异情况。

3.检测乙型肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G、H八种基因型。

HBV耐药检测建议

    在使用核苷（类）药物治疗前，先做一次耐药检测，以确定用药种类 在治疗的最初两年，对于轻微肝病患者，推荐每6个月检测一次 两年后建议每3个月检测一次，因为这个时候耐药出现的可能性更高

对病情较重的患者来说，耐药的后果会迅速表现出来，并可能威胁生命，因此建议每3个月检测一次

检测的技术

1.即时定量PCR检测： 用于检测血液中乙肝病毒的DNA水平。

可以使用的试剂盒：GeneProof Hepatitis B Virus(HBV)PCR Kit

2.HBV基因分型检测

采用测序法，对HBV基因S区进行扩增及测序，获得病毒的型别信息。

3.HBV耐药基因检测

采用测序法，对HBV基因P区进行扩增及测序，获得核苷（酸）类药物相关耐药位点的变异信息，从而分析病毒变异情况。

第三篇：基因扩增实验室检测项目及意义

基因扩增实验室检测项目及意义

核心提示:基因扩增实验室检测项目及意义

项目临床意义标本种类EB病毒DNA定量检测（EB鼻咽癌早期筛查，恶性淋巴瘤传染性核细胞增多症血清，鼻咽拭子

肺炎 支原体DNA检测（MP）非典型肺炎全血，咽拭子，肺泡灌洗液 肺炎衣原体DNA检测非典型肺炎全血，咽拭子，痰液 流行性出血热DNA检测流行病学调查报告全血

幽门螺旋体DNA检测（HP）慢性胃炎，胃溃疡，胃癌辅助治疗血清，胃液 呼吸道合胞病毒 DNA检测呼吸道疾病，肺炎全血咽拭子，肺泡灌洗液 轮状病毒RNA检测腹泻粪便 乙肝病毒DNA耐药检测 乙肝患者，病毒携带者,手术前后 常规体检血清

结核杆菌DNA耐药检测TB 流行病学调查肌疗效观察，早期诊断全血，痰液，尿液，胸腹水脑脊液

庚型肝炎RNA检测HGV庚肝患者病毒携带者血清 端粒酶RNA检测肿瘤血细胞 TTV病毒DNA检测输血传染病毒全血 流感病毒DNA检测流感鼻咽分泌物 肿瘤Ras基因诊断肿瘤早期筛查白细胞 肿瘤p53基因诊断抑癌基因检测白细胞

人乳头瘤病毒HPV16.18高致变性尖锐湿疣病理活检组织或渗出液 腺病毒DNA检测Adv腹泻咽拭子，咽喉洗液，脑脊液呼吸道合胞病毒RNA检测RSV呼吸道感染咽拭子

柯萨奇病毒RNA检测CVB病毒性心肌炎血清，咽拭子，尿液 性传播疾病(STD)检测性病，泌尿感染分泌物，渗出物，尿液 支原体同上同上 衣原体同上同上 淋病性传播疾病同上 梅毒性病血清

尖锐湿疣同上渗漏出液，破溃组织 单纯疱疹病毒DNA感染（HSV）疱疹感染，优生优育全血，分泌物，脑脊液 owtext.5pt" width=221>

尖锐湿疣

同上

渗漏出液，破溃组织

单纯疱疹病毒DNA感染（HSV）

疱疹感染，优生优育

全血，分泌物，脑脊液

第四篇：南宁市兴宁区婚检人群地中海贫血筛查及基因检测情况分析

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南宁市兴宁区婚检人群地中海贫血筛查及基因检测情况分析

作者：秦陆军 陆凤莲 蒙燕

来源：《华夏医学》2013年第02期

地中海贫血是广西地区发病率最高、分布最广、危害最大的遗传性疾病，目前尚缺乏较好的治疗方法，多数是对重型患者进行对症治疗，且疗程长、费用高，给家庭和社会带来沉重的负担。为加强广西地区地贫的预防控制，广西于2010年2月开始在全区范围内实行免费婚前医学检查，并将地中海贫血筛查纳入免费婚检的范畴，同年5月自治区政府、卫生厅又公布了《广西地中海贫血防治计划》及实施工作方案，指出地贫防治工作要与免费婚检相结合，充分合理利用卫生资源，建立完善的地贫防治体系。笔者现将2011年1月至2012年9月南宁市兴宁区免费婚前医学检查中地贫筛查及双方阳性者地贫基因检测情况报告如下。

第五篇：猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

【中文摘要】猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或(和)感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-

1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。(2)用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【关键词】猪细小病毒 伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 多重PCR 【英文关键词】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目录】猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用综述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文献

第一章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒

12-26

1.1 猪细小病毒

1.1.2 猪细小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型检测方法研究进展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 猪细小病毒病流行情况14-1

51.2 伪狂犬病病毒19-22的检测方法研究15-19概述191.2.2 伪狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 伪狂犬病病毒检测方法

1.3.1 概述

1.2.3 伪狂犬病流行情况2020-2222-231.3 猪圆环病毒22-261.3.2 猪圆环病毒的特性231.3.3 猪圆环病毒检测方法23-26检测上的应用26-31PCR 技术26

第二章 聚合酶链反应(PCR)技术在动物病原

2.1 PCR 技术概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技术的发展26-27

PCR 技术27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常规PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二温式PCR27-28转录PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反转录一复合套式聚合酶链反应

2.2.7 竞争PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 标记PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31试验研究31-45重PCR(Multiplex PCR)猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2 型 PCR 检测方法的建立31-38313232-333.1 材料与方法31-3

33.1.1 主要试剂

3.1.3 引物设计3.1.5 PCR 反应33

3.1.7 PCR 产物3.1.2 毒株、菌株和细胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反应条件的优化的测序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反应的敏感性和特异性分析

3.2.1 最佳PCR 退火温度的确定3.2 结果33-363.2.2 PCR 反应最佳引物体浓度的确定3.2.3 PCR 产物的鉴定3

43.2.4 PCR 反应的敏感性3.2.5 PCR 反应的特异性试验和重复性试验3.3 讨论36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料与方法检测方法的建立与临床样品检测分析38-39384.1.1 主要试剂38

4.1.2 毒株、菌株、细胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 结果4.1.3 临床样品及病料的采集反应条件的优化384.1.5 样品检测38-39

39-424.2.1 两重PCR 反应条件的优化39-40

4.2.3 样品检测41-42

参考文献46-56

4.2.2 4.3 讨致谢多重PCR 的建立40-41论42-4556-57结论

45-46作者简介57