猪源TTV论文：猪源TTV ORF 荧光定量PCR 多克隆抗体

第一篇：猪源TTV论文：猪源TTV ORF 荧光定量PCR 多克隆抗体

猪源TTV论文：猪源TTV转录本的鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立

【中文摘要】TTV(Torque teno virus)属于环病毒科指环病毒属成员,为单股、环状、负链的DNA病毒,正20面体对称结构,无囊膜。人源TTV基因组大小约为3900bp,猪源TTV约2700bp。到目前为止,尚未发现猪源TTV与任何一种猪病有必然联系,但是与一些猪病的发生有一定的相关性,如断奶猪多系统衰竭综合症、猪皮炎肾炎综合症等,因此,研究猪源TTV对于预防其潜在的致病性有重要意义。

1、由于还没有找到适合在体外培养TTV的细胞系,其基因组结构及复制转录机制尚不清楚。本研究利用本实验室构建的含有TTV2基因组三种不同拷贝数的质粒pSK+1TTV2(含有1个TTV2基因组拷贝的pSK载体)、pSK+1.3TTV2(含有1.3个TTV2基因组拷贝的pSK载体)、pSK+2TTV2(含有2个TTV2基因组拷贝的pSK载体),将其转染至张氏肝细胞,48小时后,提取总的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用预测的阅读框ORF1、ORF2、ORF3的扩增引物,确证其中的DNA已经消除干净。RNA经反转录后,用这三对引物扩增基因片段,经克隆和测序,结果发现:ORF1确实发生了转录,但转录产物并非O...【英文摘要】TTV(Torque teno virus), a small, non-enveloped virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae.Viral DNA of both porcine TTV species(TTV1 and TTV2)has a high

prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes or subtypes of the same species has been documented in China.Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp.So far, no porcine diseases have been found a reason...【关键词】猪源TTV ORF 荧光定量PCR 多克隆抗体

【英文关键词】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody 【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848 同时提供论文写作一对一辅导和论文发表服务.保过包发

【目录】猪源TTV转录本的鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立摘要6-817-29

Abstract8-9

第一章 绪论

1.2 人TTV 的研

1.2.2 1.1 TTV 的发现及概况17-19究进展19-251.2.1 人TTV 流行情况的调查19人TTV 的分子生物学特征19-242

41.2.3 人TTV 的致病性

1.3 猪源TTV 研1.2.4 人TTV 感染的诊断24-25究现状25-272

51.3.1 猪源TTV 的流行病学调查

1.3.3 猪源TTV 1.3.2 猪源TTV 的基因型25-26

26的分子生物学特征26-27

1.3.4 猪源TTV 的致病性

1.3.6 TTV 研究第二章 猪源TTV

2.1.1 质1.3.5 猪源TTV 的检测方法

1.4 目的和意义的前景展望2727-29转录本的鉴定29-472.1 材料与方法29-37

粒、菌株和细胞2929-3030

2.1.2 试验试剂和主要仪器设备2.1.3 CaCl_2 法制备大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞2.1.4 阳性质粒转化至DH5α感受态细胞30

312.1.6 阳性质粒的酶切鉴定

2.1.8 阳性质粒转

2.1.5 小量制备阳性质粒312.1.7 大量制备阳性质粒31-33

33-3

42.1.9 提取总染至张氏肝细胞系RNA34-3535段362.1.10 总RNA 中残余DNA 的检测

2.1.12 PCR 扩增目的基因片

2.1.14 目的基因2.2.1 含TTV2 2.1.11 反转录35-362.1.13 PCR 产物的回收36-37

2.2 结果37-45片段的克隆与测序FJ2 基因组不同拷贝数的三种质粒的酶切鉴定结果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因组不同拷贝数的三种质粒的大

2.2.3 总RNA 反转录后目的基因的扩增结

2.3 讨论量抽提结果38-39果39-4145-4747-614747-48482.2.4 测序结果分析41-45第三章 猪源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗体制备3.1 材料与方法47-543.1.2 试剂与仪器47

3.1.1 质粒、菌株与载体3.1.3 实验动物3.1.4 TSS 法制备BL21(DE3)pLysS 感受态细胞3.1.5 ORF1 全长的体外表达48-49

3.1.6 ORF1 的3.1.7 B 细胞表位富集区和ORF2 全长的体外表达49-53ORF1a 和ORF2 的多克隆抗体的制备53-54ORF2 多克隆抗体的ELISA 效价测定54

3.1.8 ORF1a 和3.2 结果

54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析结果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 扩增5555-5656-5959

3.2.3 重组质粒的鉴定3.2.4 ORF1a 和ORF2 重组蛋白的表达与纯化3.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗体的ELISA 效价测定3.3 讨论59-61

第四章 猪源TTV 荧光定量PCR 检4.1 材料与方法61-644.1.2 试剂和仪器61-62

4.1.1 病4.1.3 引物

4.1.5 测方法的建立61-69料与核酸样品61和探针设计62阳性标准模板的制备63636464-65验结果67结果67-6869-7081

4.1.4 病毒基因组DNA 的提取6262-63

4.1.6 标准曲线的绘制

4.1.8 敏感性试验4.1.7 特异性试验634.1.9 重复性试验63-644.2 结果64-68

4.1.10 病料的的检测

4.2.1 标准曲线的建立

4.2.3 敏感性试4.2.5 样品检测4.2.2 特异性试验结果65-674.2.4 重复性试验结果4.3 讨论68-69参考文献70-80

第五章 全文结论 致谢80-81

作者简历

第二篇：猪源长生态猪养殖经验分享

看到快乐养猪有的人可能会说，我听说过生态养猪，但是什么是快乐养猪呢?养猪还能 快乐吗，其实，快乐养猪更多的是改变人们养猪的一种观念和态度。

一、快乐养猪的关键点

快乐养猪的三个关键点是生态养猪、高效养猪和掌控市场，那么怎样才能做到呢，下面 分别介绍一下。

(一)生态养猪

对于猪场是否做到了生态养猪就看猪场的兽医一天工作几个小时，如果一天工作十几个 小时的话，就赶紧开除，而对于每天无所事事的兽医则要赶紧涨工资，因为养殖场主要做的 就是让猪群健康成长，而不是动物医院。

作为猪场有的一个兽医主要做到三个方面就可以了，一是要有理论知识和操作技巧，对 于平时的疾病感染和疫苗接种要做到位：第二就是要有科学的数据和报告，不能凭着感觉说 话。三是不能有自己的观念只要执行即可，而不能擅作主张。

(二)高效养猪

要想能做到快乐养猪，高效养猪很关键，比如，目前，我国的母猪的生产能力都很低，外国一头母猪能提供23.8头仔猪，而我国大多是提供 11-12 头仔猪，能提供 15-16 头的就属

于较好的，17-18头那是绝对的优秀，生产性能这么差养猪亏本就是很正常的事情了，所以 要做到快乐养猪就要做到高效养猪。

(三)掌控市场

在这里想为大家讲一个“老虎的故事”。有两个人在森林里赤脚散步，有一个人随身带 着鞋子另一个人则没有，突然有一只老虎从远处冲了过来，带了鞋子的人穿上鞋子跑的更快，他的朋友对她说“别穿了，你穿上鞋就能跑过老虎?”!正在穿鞋子的人说能不能跑得过老虎 并不重要，重要的是能够跑得过你!”

其实养猪也是一样，打比方说，如果猪价上涨是别人的猪都生病死掉，你的猪只要存活 就能买的好价钱，所以说我们大家养猪你不要养到最好，只要能比你周围的人养得好就行了。

那怎样才能比别人养得好、亏得少呢，有两个方法：

一是节流，即降低工资标准或奖金或使用便宜的产品如饲料、疫苗，但是我需要说明的 是小节约=大浪费。有一个搞房地产的老板改行去养猪了，他就问我，我怎样才可以降低成 本呢，喂点便宜的饲料，用的便宜的疫苗可不可以，后来我就问他，你以前搞地产的时候怎 么节流呀，是不是把粗的钢筋换成细的，他说，那可不行，那是要出人命的。其实养猪也一样，钱是省不了的。

二是开源，越是在行情差的时候，越是要涨工资，以提高大家的生产积极性，从而达到 提高生产性的目的，如 7 日龄、20 日龄时仔猪受环境污染，很容易发生腹泻性疾病，而且 一旦发生就很难控制，但是仔猪的蹋腹泻病控制好了，断奶时体重增加0.5千克，出术加5 千克，也就是说经济效益能够增加10 倍。

仔猪出现腹泻时，其实前 2 天天就已经有了炎症，这时可能只;只有一些细微的变化，一旦发病后，要 2 天以后才能修复，结果就是本来体重会增加 1 千克，结果反而减少 0.25 千克。

如果猪场技术人员能够提前发现病情，那么按 1窝猪 10头来计算，每头猪断奶时体重 能增加 1.25 千克，出栏时每头猪就能增加 12.5 千克，2 窝猪(20 头)就，就可以增(增加加250

千克，如果以当前的行情按每千克 12 元来计算的话，那么 250 x 12=3000 元，养这两栏猪

就可以增加3000元的效益。如果能做到这一点的话，虽然你不能掌控市场的价格，但你可 以做到比别人少赔钱，或比别人多挣钱。

二、实现快乐养猪的方法

(一)努力学习科学养猪技术

应用科学技术是第一生产生产力，学精通的目的就在于应用，一定要活到老，学到老，而且还要用到老。

(二)建立正确的观念

1.表面的节约往往是透支未来

永远不要在节约上面做文章，节约往往会透支未来。

2.敢于应用新技术和新产品

新产品只有最先使用者才能额外受益，因为产品价格=该产品的平均社会成本(使用普通 方法产生的成本)+该产品的平均社会利润，产品的平均社会成本是可以变化的，比如，养一 头猪的利润是150元，目前使用普通方法养一头猪的成本，也就是平均社会成本是800元。那么猪这个产品的价格就是 800+150=950 元，如果这时你采用热水猪的话成本可以降低为 700元，也就等于你比别人多盈利100元;

但是随着大家对一种新事物的熟知，如果大家都采用 1水养猪的话，那么养猪的平均社 会成本就变为 700元，么这时的产品价格就是 700+150=850元，所以对新

产品的使用，受益的往往是最先使用者。

3.效果不好的才是最贵的有人买东西总是衡量价格的贵贱，其实效果不好的产品才是最贵的，比如有人送给你一

吨消毒剂(其实就是水)，你回去后拿去消毒，因为产品本身不好，所以就起不应有的效果，这时候可不仅仅是没花钱，有可能损失的是50 万，所以说效果不好的才是最贵的。

(三)改变态度

要想做到快乐养猪就要改变态度，怎样改变态度呢?那就是把猪当人待，比如，母猪的产房有没有问题，就自己去睡一晚上，这时候猪舍的空气质量、温度、湿度是否合适，就都 明白了。

1.把仔猪当儿女

给仔猪喝温水猪是恒温动物，所有的猪都应随时随喝到温水，最适合的水温就是猪的体 温，水温过高或过都会对猪产生负面影响，断奶后喝冷水，会带来严重后果，打个比方说，谁会给自己家的小孩子喝冷水，其实对猪是一样，一旦喝冷水，就会对仔猪产生不利影响，主要有下几个方面：

产生冷应激，使免疫力下降，抵抗力差，猪只易生病;

冷水刺激胃肠，还会引起腹泻甚至脱水;

因冷水的口感差，可使小猪减少饮水量，从而影响采食量，直接影响生长速度;

饮用冷水还会用饲料提供的热能把冷水加热到体温(40℃左右)，从而消耗大量饲料，降 低经济效益。

给保育猪喝温水，可使仔猪精神状态好，很少生病，成活率显著提高，日增重明显提高，料肉比显著降低。

为小猪提供最适生长温度 因为猪是恒温动物，只有在适宜的温度条件下才能正常生长、发育，充分发挥其生产潜力，达到多成活、快生长、多增重、少耗料、增产增效的目的。低温会使仔猪成活率低，生长发育慢，饲料利用率低、健康状况差，容易发生疾病，因 此，做好保温很关键。

保温应解决好三个方面的问题：一是满足仔猪不同阶段对温度的不同要求;二是保持恒 定温度;三是要二次加温，解决方案是利用微电脑技术或全自动恒温地暖系统。

仔猪创造干燥的环境仔猪环境的卫生指标有两个，分别为干净和干燥，因为病原增殖的 四大条件分别是空气(氧气)、营养(有机物)、温度和湿度，所以创造干净和干燥的环境条件 即有利于减少病原的增殖。

2.把母猪当老婆待确保母猪健康母猪健康的标准是什么?就是能吃、能睡、排泄好、皮肤红润有弹性，皮

毛有光泽，没有生殖系统炎症。

疫抑制的重要原因是什么?主要有以下三个方面：

第一，免疫抑制性疾病普遍存在，如蓝耳病病毒、圆环毒会直接破坏免疫系统，目前越 来越多的学者认为猪瘟、支原体和猪流感也是免疫抑制性疾病;

第二，霉菌毒素会干扰免疫系统;

第三，滥用抗生素破坏机体抵抗力、形成耐药菌株、破体微生态平衡。目前很多猪场用 抗生素来做保健，要知道在人的保健品中没有一个是抗生素，抗生素是用来治病的，不到万 不得已是不能用的，目前由于抗生素的大量应用使猪的肝肾严重受损，从而使机体产生免疫 抑制，抵抗力下降，容易被大量病毒感染，从而继发细菌性疾病，造成严重的损失，而出现 这种发病情况后，又不得不大量使抗生素，从而使养猪业形成恶性循环。

解决措施就是解除母猪的免疫抑制、修复受损的免疫系统，提升母猪自身的抵抗力，方 案是实施真正意义上的保健，逐渐减少直至彻底取消抗生素的使用。

控制便秘，便秘是健康的杀手，它直接导致毒素在体内的蓄积，进而给机体带来一系列 的严重危害，同时还会害母猪健康、使毒素危害胎儿、造成子宫炎症和难产、引起产后泌乳 综合征、仔猪频繁下痢。

便秘的主要原因有饮水不足、膳食纤维不足、长期大量投喂抗生素、某些营养元素严重 不足、运动量不够。

对于便秘的解决方案可以补充纤维素，补充青绿饲料，每天以 1-2 千克为宜，可适当调 高纤维素含量较高的料的比例，如麦麸等;使用复合微生态制剂对便秘有一定的改善;也可以 饲喂无机盐类制剂，如人工盐及其衍生物。

第三篇：猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

猪细小病毒论文：猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

【中文摘要】猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或(和)感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-

2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-

1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。(2)用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。

【英文摘要】Porcine parvovirus , porcine pseudorabies and porcine circovirus are three main threat to the development of swine-breeding industry.Beacause sigle or mixed infection of the three virus both can cause diseases which can give rise to reproductive failure or(and)immunosuppression, it provides a convenient chance for secondary infection by other pathogens

and enven causes epidemic diseases in pigs wich can lead to tremendous economic losses ,and may arise public health problems.PCR with rapid,specific and sensitive advantages exhibits obvious preponderance in specificit detection of infectious agents in animals since it was invent.And it is applied widely in animal disease diagnosis and pathogen detection which has made important contributions to disease prevention and control.At present,the cases of mixed infection of pathogen are increasing,and common分子molecular detection of pathogen has show its own shortage of time consuming ,high cost and labour power when we need detect one specimen repeatedly.Mutiplex PCR not only preserve advantages of routine PCR,but also owns advantages of convenience shortcut and sensitiveness which meet the need of fast diagonosis for multiple diseases in production.We found that sigle or mixed infection of PPV、PRV and PCV-2 is common in the course for the survey of viral pathogen in some breeding enterprises in this research.So we plan to establish the mutiplex PCR for detection of PPV、PRV and PCV-2,in purpose for providing fast detection of the three pathogens an available method.(1)Specific primers for DNA viruses, namely, porcine parvovirus(PPV), pseudorabies virus(PRV), porcine circovirus type 2

(PCV-2),were synthesized according to the published virus conserved gene sequence of PPV, PRV and PCV-2 in GenBank and used by DNAStar and Oligo 6.0 software.We establish a mutiplex PCR method for the detection of PPV, PRV and PCV-2 by optimizing concentration of primers,annealing temperature and component of PCR.Sensibility test shows that the susceptibility of PRV and PCV-2 reach the level of pg.With PCV-1, bovine viral diarrhea virus, classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine transmissible gastroenteritis virus, Escherichia coli, PPV, PRV, PCV-2 as a template for multiple PCR were detected,the results show that the only PPV, PRV and PCV-2 virus in a single or multiplex PCR were amplified by their specific band.(2)The blood samples collected from 286 pig farms in Shaanxi Province were viral detection by this method.Clinically healthy pigs from a blood sample PPV, PRV and PCV-2 test results indict that PCV-2 in normal pigs have a certain percentage of presence, meanwhile several farms also exist the phenomenon of the PRV and PCV-2 dual infection.Swine from the clinical illness were detected compound, It was serous of PRV+PCV-2 combined infection in diseased pigs,and PPV+PRV+PCV-2 combined infection also were detected in diseased pigs.The coincidence

rate of multiplex PCR test and single PCR test is more than 99%, illutstrating that The developed novel multiplex PCR will be a tool used for the detection of clinical samples for diagnosis reference.【关键词】猪细小病毒 伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 多重PCR 【英文关键词】Porcine parvovirus(PPV)Pseudorabies virus(PRV)Porcine circovirus type 2 multiplex PCR(mPCR)【目录】猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用综述12-

31摘要6-8

ABSTRACT8-9

文献

第一章 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒

12-26

1.1 猪细小病毒

1.1.2 猪细小病毒的特性

1.1.4 PPV

1.2.1 2型检测方法研究进展12-1913-141.1.1 概述12-131.1.3 猪细小病毒病流行情况14-1

51.2 伪狂犬病病毒19-22的检测方法研究15-19概述191.2.2 伪狂犬病病毒的特性19-20

1.2.4 伪狂犬病病毒检测方法

1.3.1 概述

1.2.3 伪狂犬病流行情况2020-2222-231.3 猪圆环病毒22-261.3.2 猪圆环病毒的特性231.3.3 猪圆环病毒检测方法23-26检测上的应用26-31PCR 技术26

第二章 聚合酶链反应(PCR)技术在动物病原

2.1 PCR 技术概述26-27

2.1.1 2.2 主要的2.1.2 PCR 技术的发展26-27

PCR 技术27-31PCR(nested PCR)

2.2.1 常规PCR272.2.2 套式

2.2.4 反

2.2.3 二温式PCR27-28转录PCR(RT PCR)2828

2.2.5 反转录一复合套式聚合酶链反应

2.2.7 竞争PCR(compete

2.2.9 定量2.2.11 多

第三章 2.2.6 反向PCR28PCR)28-29PCR29

2.2.8 标记PCR(LP-PCR)292.2.10 玻片PCR(Slide-PCR29-30

31试验研究31-45重PCR(Multiplex PCR)猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2 型 PCR 检测方法的建立31-38313232-333.1 材料与方法31-3

33.1.1 主要试剂

3.1.3 引物设计3.1.5 PCR 反应33

3.1.7 PCR 产物3.1.2 毒株、菌株和细胞31-323.1.4 病毒DNA 的提取323.1.6 PCR 反应条件的优化的测序分析333333-343434-3636

3.1.8 PCR 反应的敏感性和特异性分析

3.2.1 最佳PCR 退火温度的确定3.2 结果33-363.2.2 PCR 反应最佳引物体浓度的确定3.2.3 PCR 产物的鉴定3

43.2.4 PCR 反应的敏感性3.2.5 PCR 反应的特异性试验和重复性试验3.3 讨论36-38

第四章 PPV , PRV和PCV 2多重PCR

38-4

54.1 材料与方法检测方法的建立与临床样品检测分析38-39384.1.1 主要试剂38

4.1.2 毒株、菌株、细胞38

4.1.4 多重PCR

4.2 结果4.1.3 临床样品及病料的采集反应条件的优化384.1.5 样品检测38-39

39-424.2.1 两重PCR 反应条件的优化39-40

4.2.3 样品检测41-42

参考文献46-56

4.2.2 4.3 讨致谢多重PCR 的建立40-41论42-4556-57结论

45-46作者简介57