实验二_____土壤中放线菌的分离

第一篇：实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。

实验6

土壤中放线菌的分离（实训）

实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。

2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料：

药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O 作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验步骤：

1.高氏一号合成培养基的制备

高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。

2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备

选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-

3、10-

4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分别从10、10菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10、10的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌

取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-

4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4）平板划线法分离土壤中放线菌

取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。（5）培养

接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。

准备实验内容：

问曾老师借 无菌刮棒 打火机 酒精灯

无菌报纸包（1个）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的试管

培养皿6套 枪头（1mL/0.1mL）

高氏一号培养基500mL（150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题：

1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。

2.观察与记录以下内容。

大小

形状

边缘颜色

表面代谢物

种类 3.如何区分放线菌和真菌、细菌？

放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够，放线菌会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。

第二篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验

土壤中放线菌的分离和纯化实验

一、实验目的

1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培养基的灭菌方法。

掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。

4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一号培养基的配制方法；

6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。

7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。

二、实验材料

高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀

三、实验原理

植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）

第 1 页 或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。

四、实验步骤

1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制 母液。

2、配制培养液时应注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；

③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。

需要注意的是，在加热琼脂，制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，第 2 页 否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH，一直调到培养基的pH为6（5.8~6.5）左右为止。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸（每块大小约为9 cm×9 cm）中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。

3、高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。

第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。

第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用报纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。

第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固后再使用。

第 3 页 4,、再在操净工上进行消毒，先用紫外线照射30MIN，然后送风，关闭紫外灯，改 用日光灯，对手用酒精进行消毒，对培养基表面也要用酒精进行消毒。准备工作好了，就进行接种。并且要在酒精灯旁边进行操作，避免污染。镊子要在双孔灭菌器上进行灭菌。

4、接种完成后要整理工作台，并且把培养瓶拿到培养架上进行日光培养。

五、放线菌的提取步骤

5、（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。

6、（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）

①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，7、分别将土壤悬液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀释液。

六、稀释涂布法分离土壤中放线菌

8、（1）倒平板

9、将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁

第 4 页 边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。

12、（4）倒置平板

13、将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d14、15、5、放线菌的纯化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板划线

18、将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。

6、放线菌的观察玻璃纸法

19、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。

第 5 页 20、将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。

21、（3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。

22、（4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。

23、（5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。

7、放线菌保藏

斜面低温保藏法

长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 个月，移种一次。

将纯化培养后的放线菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生

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第三篇：实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集 1 目的

1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。3 材料 3.1 培养基

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。3.2 仪器或其它用具 取样铲、塑料袋、记号笔、1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。

2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。

3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。2)面积中等，地势平整，有些肥力差异的田块采用棋盘式采样法。3)面积大，地势又不平坦，肥力不匀的田块采用蛇型线采样法。土样由20个样点组成。样点分布范围不少于3亩（各地可根据情况确定）。每个点的取土深度及重量应均匀一致，土样上层和下层的比例也要相同。采样器应垂直于地面，入土至规定的深度。采样使用不锈钢、木、竹或塑料器具。样品处理、储存等过程不要接触金属器具和橡胶制品，以防污染。每个混合样品一般取1kg左右，如果采集样品太多，可用“四分法”弃去多余土壤。

4．样品编号和档案纪录：做好采样记录：土样编号、采样地点及经纬度、土壤名称、采样深度、采样日期、采样人等。

第四篇：土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取

实验目的：

1、从土壤中分离产抗生素的放线菌

2、放线菌的培养

3、放线菌的发酵产生活性物质

4、放线菌产生的活性物质提取。实验原理：

放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。实验器材：

1、土壤

2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基

3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。实验步骤：

一、土壤放线菌株的采集

采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

样品（土壤）处理：室温风干

二、土壤中放线菌的分离、培养

1、配制淀粉培养基

淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释

① 将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。

② 用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

③ 按1：:1稀释至10-

3、10-

4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-

3、10-

4、10-5，稀释过程应在无菌条件下进行。

3、将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入3%的重铬酸钾数滴（大约100ml加0.3ml），混合均匀。分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。

4、平皿倒置于培养箱28℃恒温培养一周左右。

5、将平皿上的放线菌菌落跳去在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。

6、将纯化好的菌落转入到斜面，4℃条件下进行保存。

三、抗菌谱的测定

1、挑取一个放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周左右。

2、将2ml培养8h的大肠杆菌分别加到200ml灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培养皿中均匀放入4个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液。培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h。

4、测量抑菌圈的大小。

四、发酵

1、配制种子培养基

蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml，PH值7.2,121℃灭菌20min。

2、配制发酵培养基

蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml，PH7.2。121℃灭菌20min。

3、种子液的制备

将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-1 培养4天。

4、发酵培养

以6%的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-

1培养4天。

5、活性检测

发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取。

2、活性检测

将萃取液浓缩，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

第五篇：药用植物内生放线菌的分离和生物学特性

药用植物内生放线菌的分离和生物学特性

摘要:【目的】探索药用植物内生环境可培养放线菌的分离、培养方法，总结药用植物内生放线菌的生物学特

性，探讨其物种多样性，挖掘新的微生物资源。【方法】采用 10 种分离培养基对 37 个新鲜的药用植物样品

进行内生放线菌的分离;通过比较，选择适合植物内生放线菌生长的培养条件;根据菌落形态和细胞特征观 察结果，选择其中 174 株菌测定 16S rRNA 基因序列，分析药用植物内生放线菌的多样性;应用 Biolog GEN III 微孔培养、API 50CH 以及 API ZYM 试剂条测试 27 株代表菌株的生理生 化特性。【结 果】分 离 得到 940 株植物内生菌，分属于 47 个属，30 个科，其中放线菌 600 余株，分属于 34 个属，共发现潜在的新分类单元有 个;本研究中药用植物内生放线菌的培养条件是:PYG 培养基、pH7.2、28℃ － 32℃;菌株间的生物学特性的

差异与菌株系统进化关系呈正相关关系;不同环境植物的内生菌菌株的生物学特性差异较大，相同环境的不

同植物内生菌的生物学特性差异较小。【结论】药用植物内生放线菌物种丰富多样;药用植物内生放线菌在 唯一碳源利用、发酵碳源产酸及酶学活性等生理生化特性方面没有表现出和宿主植物的直接相关性，而是呈

现出和宿主植物的地理分布有一定的相关性。

关键词:药用植物，内生放线菌，生物学特性，多样性

中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2013)01-0015-09 药用植物有着独特的药理活性，特别是在治疗

一些疑难病症上有着不可替代的作用。如茵陈主治

黄疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等肝病;狼毒主治结核、气喘等，还具有抗肿瘤的作用。药用植物的有效成

分的提取和研究一直是国内的热门课题。1993 年，美国蒙大拿州立大学的 Stierle 研究小组首次从短叶

紫杉(Taxus breviforlia)中分离得到一株能合成抗癌

物 质 紫 杉 醇 的 内 生 真 菌 新 种 安 德 氏 紫 杉 霉 菌(Taxomyces andreanae)［1］，并证明内生菌具有合成

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起了对药用植物内生菌研究的热潮。《微生物学通

报》编辑部的郝荣乔于 2009 年初对 2008 年的 点评中报道“植物内生菌成为我国当前微生物研究

领域的热点” ［2］

。的确，药用植物内生菌的研究和 有效开发对药用植物资源、特别是濒危植物资源的

保护具有重要的意义。

本研究选取采集自北京、贵州、云南和西藏等地 的药用植物样品 37 份，经过表面消毒处理后，应用

放线菌分离培养技术从中分离放线菌菌株;根据菌

株的 16S rRNA 基因序列信息以及系统进化关系，探讨药用植物内生放线菌的物种多样性;通过生理

生化实验测定，揭示药用植物内生放线菌的生物学 杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)ordination analysis，NTSYSpc v． 2.02)进行分析，构

建表型数值分类聚类图，分析实验菌株的生物学特 性。2 结果

2.1 菌种分离结果

从 37 份药用植物中共分离、纯化得到 940 株纯

培养物(表 1)。从云南、贵州和西藏来源的植物样

品中分离得到的放线菌的比例稍高于北京的植物样

品;来源于植物根、茎、叶的菌株数量基本相当，没有

明显差异;和其它 9 种分离培养基相比较，丙酸钠分

离培养基(M7)分离得到的放线菌数量占显著优势。

表 1 药用植物内生菌分离结果统计

Table 1 The strains isolated from the medicinal plants Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates Plant number Number of isolates P1 34 P11 6 P20 10 P29 64 P2 40 P12 18 P21 15 P30 2 P3 46 P13 10 P22 4 P31 8 P4 43 P14 1 P23 3 P32 44 P5 17 P15 8 P24 77 P33 45 P6 44 P16 15 P25 12 P34 31 P7 8 P17 14 P26 73 P35 34 P8 4 P18 1 P27 98 P36 12 P9 6 P19 12 P28 59 P37 3 P10 19

通过菌落形态以及菌株细胞显微形态的初步观

察结果以及菌株来源，选择 174 株代表菌株进行

16S rRNA 基 因 序 列 测 定 和 比 对，结 果 显 示，174 株

分离菌株隶属于 30 个科、47 个属，其中的放线菌 139 株，分属于 34 个属(图 1)。以菌株的16S rRNA

基因序列与 NCBI 数据库中有效描述菌种相似性 ＜

98.2% 作 为 操 作 分 类 单 元(taxanomic operational

units，OTU)的划分 界 限 ［12 － 13］，其中有 22 株菌代表

了 7 个新的操作分类单元。

2.2 药用植物内生菌的生物学特性

为了比较研究药用植物内生放线菌的生物学特

性，选择了 27 株分离菌株进行了生长温度、pH 值、唯一碳源利用、利用碳源产酸以及酶学特性测试，其

中包含了 2 株药用植物内生细菌。来源于韩国菌种

保藏中心的 3 个典型培养物 KCTC 19272 T、KCTC 19469 T

和 KCTC 19037 T

(分离自不同土壤环境)同时 做了平行对照实验(表 2)。起初，分离菌株在对应的原始分离培养基和继

代培养基 PYG 上生长良好，但是随着传代次数的增

加，部分内生菌生长变弱，甚至无法继续传代，而 3 株来源于土壤样品的对照菌的生长状态则几乎不受

传代次数的影响。内生菌菌株的温度生长范围是

10℃ － 37℃，在 28℃ － 32℃ 生长 较 好;多 数 菌 株 在

pH 6.0 － 10 范围 内 都 能 生长，在 pH 中 性 至 弱 碱 性 条件下生长最佳。

本实验中 27 株植物内生菌对碳源的利用呈现

以下趋势:菌株对二糖和多糖类的利用率最高，接下

来依次是单糖，脂类，氨基酸及衍生物。27 株植物

内生菌中，50% 以上的菌株都能利用以下底物作为

唯一碳源和能量来源:亚碲酸钾，丁酸钠，甘露醇，纤

维二糖，葡萄糖，麦芽糖，松二糖，甘油，果糖，海藻

糖，蔗糖，水 杨 苷，甘 露 糖 和 醋 酸。在 菌 株 I10A-01402 的分类学研究 时，用 来 源于 土壤 环境 的近源

菌 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T，N． alkalitolerans KCTC 19037 T 作为参比进行

了 Biolog Gen Ⅲ 唯 一 碳 源，API 50CH 产 酸 和 API ZYM 酶学特性测定和比较分析。植物内 生 菌 I10A-

01402 以及其 它 26 株 内 生 菌 都 能 够利用 Biolog 微

孔板中葡聚糖和 D-麦芽糖，但是，来源于土壤环境 的 N． koreensis 19272 T，N． ginsengisegetis KCTC 19469 T

和 N． alkalitolerans KCTC 19037 T

等 3 株类诺

卡氏菌属的菌株都不能利用这两种糖;I10A-01402

不能利用 N-乙酰类化合物，其它 26 株内生菌也都

不能或很少利用此类化合物，而这 3 株土壤来源的

菌株则全部能利用 N-乙酰类化合物作为唯一碳源

和能量来源。27 株药用植物内生菌和 3 株土壤来

源的参比菌株同化 API 50 CH 中的碳源并产酸的情

况以及酶学特性上也表现出较大的差异。本实验中 株药用植物内生细菌和 28 株 放线菌 相 比较，细菌

能够更多地利用 Biolog GenⅢ中列举的唯一碳源，并且同化 API 50 CH 中单个碳源并产酸实验的阳性 率也高一些，但在 API ZYM 酶学特性测试结果中没 有明显差异。

16S rRNA 基因 序 列 相 似 性 越 高 的 菌 株 的部 分

生理生化特性也趋于相近。例如，草药菌属菌株

(Herbiconiux sp．)I10A-01569、草 药 菌 属 菌 株

(Herbiconiux sp．)I10A-02268、草 药 菌 属 菌 株(Herbiconiux sp．)I10A-02292、寒 冷 杆 菌 属 菌 株 171 材料和方法 1.1 材料

1.1.1 植物样品:玉竹、黄精、知母、蒙古黄芪、肥皂

草、藿香、薄荷、金银花、仙鹤草、樱桃、大叶玉竹、白

芷、紫苏、喷瓜、金银木(橘色果实)、红色果实金银

木、虎杖、薯蓣和穿龙薯蓣等 19 份植物样品采集自

北京(编号 P1 － P19)，大狼毒、狼毒大戟、瑞香狼毒、橙黄瑞香、藏茵陈和云南重楼等 6 份采自云南(P22 － P27)，贵 州重 楼 和 三 七 采 自 贵 州(P28，P29)，绵

头雪莲(P20)、包叶雪莲(P21)以及其余 8 份(P30 － P37)等共 10 份采自西藏。共计 37 份药用植物样 品。

1.1.2 培养基:(1)内生菌分离培养基: 使用了 10 种分离培养基(M1 － M10)，其中 M1 － M8 培养基是

本实验室在红树植物内生放线菌研究中使用的 8 种

内生放线菌分离培养基 ［3］，M9 和 M10 的组成如下: M9(g / L): 柠檬酸 0.12，柠檬 酸 铁 铵 0.12，硝

酸钠 1.5，磷 酸 氢 二 钾 0.4，硫 酸 镁 0.1g，碳 酸 钙

0.05，碳酸钠 0.2，琼脂 12，pH 7.2。M10(g / L): 甘露聚糖 2.0，酪素水解物 0.3，硝

酸钾 0.1，海洋微量盐 微量，复合维生素 微量，琼

脂 12，pH 7.2。

(2)菌种纯化和继代培养培养基(g/L): 蛋白 胨 3，酵母浸膏粉 5，甘油 10，甜菜碱 1.25，丙酮酸 钠 1.25，复合维生素 微量，琼脂 12，pH 7.2。

1.1.3 抑制剂:抑制真菌和革兰氏阴性细菌的抑制

剂的种类和剂量参见文献［3］。

1.1.4 菌 株: 参 比 菌 株 人 参 地 类 诺 卡 氏 菌

(Nocardioides ginsengisegetis)KCTC 19469 T，韩国类

诺卡氏菌(Nocardioides koreensis)KCTC 19272 T 和 耐

碱类 诺 卡 氏 菌(Nocardioides alkalitolerans)KCTC 19037 T

来源于韩国典型培养物保藏中心(KCTC);其它实验菌均为本研究的分离菌株。

1.1.5 主要试剂:硫 代 硫 酸 钠、次 氯 酸 钠、碳 酸 钠、萘啶酮酸、制霉菌素、重铬酸钾等化学试剂均为国产

分析纯试剂;PCR 扩增相关试剂和引物测序均来源

于生工生物工程(北京)，Biolog GEN III 微孔板和基

础培养液购于美国 BIOLOG 中国代理，API 50CH 和

ZYM 试剂条及相关试剂购于生物梅里埃公司。

1.2 菌种分离和保藏 具体方法参见文献［3］。

1.3 菌种初步鉴定和多样性分析 菌种初步鉴定参照徐丽华等主编的《放线菌系 统学》 ［4］

相关方法操作。根据菌落和菌丝形态初步 观察排除重复菌株，选择代表 性菌 株测 定 其 16S

rRNA 基 因 序 列，并 将 结 果 提 交 EzTaxon 网 站

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杜慧竟等: 药用植物内生放线菌的分离和生物学特性． /微生物学报(2013)53(1)Isolation and physiological characteristics of endophytic actinobacteria from medicinal plants Huijing Du，Jing Su，Liyan Yu，Yuqin Zhang * Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College，Beijing 100050，China Abstract:［Objective］ To isolate，incubate and characterize cultivable endophytic antinobacteria from medicinal plants，and analyze the diversity of the endophytic antinobacteria，then explore the novel microbial resources． ［Methods］ Ten media were used to isolate endophytic antinobacteria from 37 fresh medicinal plant tissue samples． The optimal cultivation

conditions for endophytic antinobacteria were determined by comparison． Based on the morphology of the colonies and cells

of the new isolates，we chose174 isolates to analyze their 16S rRNA gene sequences and the diversity of the medicinal

plant endophytic antinobacteria． The physiological characteristics of 27 representative strains were studied using Biolog

GEN III MicroPlates，API 50CH and API ZYM kits． ［Results］ In total 940 endophytics affiliated to 47 genera of 30

families were isolated，among which more than 600 actinobacteria belonged to 34 genera and 7 unknown taxa． Good growth

of the endophytic antinobacteria on PYG(peptone-yeast-glycerol)medium with pH 7.2 at 28 － 32℃ was observed．

Physiological characteristics differences of these isolates related to their phylogenetic relationships． Greater differences

were shown among the strains from the same host plants than those from different plants grown in the same area．

［Conclusion］There are great diverse endophytic actinobacteria inside the medicinal plants． No direct relationship of the

endophytic actinobacteria from medicinal plants with the host plants in the sole carbon source utilization，fermentation of

carbon sources to produce acid and the enzyme activities was found，while it seemed that the physiological characteristics of the isolates related to the geographical distribution of their host．

Keywords: medicinal plants，endophytic actinobacteria，physiological characteristics，diversity