端粒酶及端粒与放射敏感性的研究进展---杨军平

第一篇：端粒酶及端粒与放射敏感性的研究进展---杨军平

端粒酶及端粒与放射敏感性的研究进展

据世界卫生组织(WHO)统计,每年世界有1000万人患上癌症,而死于癌症人数约6万,占全球死死人数的12% [1]。我国每年新增癌症患者180万,死亡140万,平均每3分钟就有1.3人死于癌症,而且癌症的发病率呈急剧上升到的势[2]。目前对于肿瘤治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗，近年来，随着放射肿瘤学(radiation oncology)的不断发展，放疗在肿瘤治疗中的地位愈显重要。放疗已成为当今治疗恶性肿瘤最常用的方法之一：中国肿瘤患者中约有70％接受放疗，日本新发现的患者中50％用了放疗，美国新发现的50％～60％用了放疗。根据1999年世界卫生组织(WHO)的统计，约有4 5％的恶性肿瘤可以治愈，22％为手术治愈，18％为放疗治愈，5％为药物治愈[1]。但传统放疗对一些肿瘤，尤其是一些中晚期肿瘤的疗效并不理想，肿瘤难以根治。为了解决肿瘤细胞的放疗抗拒问题、进一步提高放疗的治愈率，临床医生和科学家们进行了很多的研究和努力，使放疗疗效得到不断的提高。在放疗众多研究中，放射增敏剂的研究有着极其重要的地位和作用。其中端粒及端粒酶对放射敏感性的关系的研究成为放射医学的一个焦点，端粒及端粒酶结构及功能

端粒是位于染色体未端的特殊结构，在脊椎动物中[3]，端粒是由TTAGGG序列和shelterin蛋白复合物共同组成的[4]，它的主要功能是防止染色体降解和溶合，而这种保护的功能可能是通过端粒在染色体未端形成一个大的环形结构t环（t-loop）实现的[5]，除了上面的保持功能外，端粒也可能借助端粒酶功能使端粒延长来解决细胞染色体复制缩短问题[3]，端粒的延长是能过端粒酶来实现的，端粒酶通过识别染色体未端3-OH并且以端粒酶RNA分子为模板从头合成端粒未端重复序列[6]，当人或小鼠细胞中缺少端粒长度维持系统时，每一次细胞分裂，染色体未端就会失去50–150 bp [7]，当缩短到关键长度以下时，端粒就不能维持t环结构，从而染色体未端形成融合，使端粒未端去功能的共价融合是鐚过非同源染色体未端联接修复途径完成的（nonhomologous end-joining repair pathway）。

端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于''逆转录酶''。人类的端粒酶亚单位基因已被克隆出来，分别是端粒酶RNA（hTR）、端粒酶结合蛋白（hTP1）、端粒酶活性催化单位（hTERT）[8]。它以自身的RNA作为端粒DNA复制的模版，合成出富含脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)的DNA序列后添加到染色体的末端并与端粒蛋白质结合，从而稳定了染色体的结构[9]。端粒酶的分布

许多证据表明，除了生殖细胞、胚胎干细胞、活化的淋巴细胞、月经期的子宫内膜组织及表皮的基底层细胞外，大部分的体细胞端粒酶呈阴性，而在约80％ ～90％ 的人类肿瘤中端粒酶激活。调查表明，端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为：中腔鳞状细胞癌80 %～90 %，食道癌87 %，胃癌85 %，肺癌80.11 %，肝癌85 %，乳腺癌85 %，肾癌71 %，胰腺癌95 %等[10]。最近一些研究发现端粒酶仅存在于细胞核内，也存在细胞质和细粒体中。haender和他的同事分析hek293细胞中端粒酶分布发现细胞核60%，线粒体20%，细胞质20%，一个肿瘤细蓞中大约有20-5а个hTERT，也就意味着线粒体中有3-10hTERT，把绿色荧光蛋白接到野生型hTERT的C 端上时，在线粒体内发现重组端粒酶，而且Haendeler 用免疫印记和免疫共沉淀方法发现hTERT位于线粒体基质中，不仅在人某些细胞线粒体提取物中也能检测到端粒酶的活性，例如在脐带静脉的内皮细胞中发现线粒体中存在hTERT，而且大鼠小鼠的细粒体中发现也存在TERT，而且donsa研究表明除了hTERT可从细胞核内穿梭到细粒体内外，HT也可以穿梭到细粒体内，并且在细粒体中可以测到端粒酶的活性，说明细粒体中存在端粒酶不是hTER葔过表达的人工假象，而是一个正常的生理现象，可能是蛋白质翻译后调节。放射线可能诱导端粒酶的表达，Finnon et al[11]研究发现恶性和非恶性细胞对于放射产生不同的生物学行为，人淋巴幼干细胞受放射线照射后不会出现端粒酶活性（TA）的改变，而恶性的肿瘤细胞受照射后端粒酶活性会出现增高，Leteurtre et al[12]在AML细胞系也会出现类似的现象。但是在受到丝裂原刺激的外周血细胞和造血干细胞受到照射后，TA 也会升高，恶性和非恶性细胞受到照射后表现出后的不同，可能从侧面反映出不同的PI3K/Akt信号激活途径，Jones, K[13]发现10GY射线并不能抑制P53 野生型MCF-7Р细胞，MDA-MB231细胞及MCF-7/hTERT细胞中的端粒酶的表达，端粒的缩短。Nakamura [14]发现用低剂量的X线照射人端粒酶诱导永生化的成纤素细胞，发现成纤素细胞相对照射前端粒酶活性增高。端粒及端粒酶对放射敏感性的影响

大量研究表明端粒酶及端粒与放射敏感性呈负相关性。而且在大部分情况下，端粒酶活性与染色体未端的端粒的长度呈正相关性，也就是说端粒酶活性越高，端粒的长度就越长。目前认为端粒酶参与细胞核内的DNA损伤的修复[15]。端粒酶除向端粒末端添加端粒序列外，它还可催化断裂的染色体末端非端粒DNA合成端粒重复序列，使断裂的染色体重新获得稳定。Sawant [12]通过细胞离体培养和肿瘤裸鼠模型证实端粒酶在照射前后的变化与肿瘤的放射敏感性呈负相关。最近Yoshikon [16]通过E6/7E转染SCID（免疫缺陷细胞）细胞后，转入hTERT基因序列(端粒酶的催化亚单位)后，使端粒酶活性上升，出现放射抗拒，亦表明端粒酶活性与肿瘤的放射敏感性呈负相关。Kagaka [17]等通过研究头颈部癌细胞中端粒酶活性，发现不同的放疗疗效，其端粒酶活性不同，放射或化疗抗拒肿瘤细胞中似乎端粒酶活性非常高的，而通过端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性则能提高肿瘤细胞的放射敏感性。因而Gomez-Millan[ HYPERLINK l “_ENREF_18” o “Gomez-Millan, 2007 #43” 18]用MDA-MB-231抑制GRN163L细胞端粒酶活性后增加了细胞的放射敏感性。而且最近国内外多项研究显示，用端粒酶抑制剂可提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，间接说明端粒酶与放射敏感性呈负相关。同样大量研究表明染色体未端的端粒的长度与放射敏性负呈相关，Castella??M[19]观察到健康人中的外周血中淋巴细胞端粒的长度越长，细胞对放射的抗抵性就越强，Rubio, M.[20]也在端粒酶阳性而端粒长度不同的成纤素细胞中发现，端粒酶不仅能抵抗射线对DNA损伤作用，而且还可以抵抗铂类，阿霉素等对细胞的损伤作用。Zhao, Z[21]把带有人端粒酶逆转录酶的质粒转染到细胞中，发现酶粒酶活性升高，端粒变长，对放射的敏感性就越差。Xiao, [22]用0, 2, 4, 8, or 12 Gy射线照射人喉磷状上皮癌细胞3次后，培养20代后，现在端粒酶的活性越高，端粒的长度越长，对放射的反应就越小，相反端粒酶活性越低，端粒的长度就越低。对放射的反应就越大。端粒及端粒酶影响放射敏感性的机制

端粒及端粒酶影响放射敏性机制目前还不清楚，但现在有一些研究表明细胞受照射后，端粒酶表达升高，通过逆转录酶的作用来保持或延长细胞中染色体未端的端粒的长度，使染色体未端避免融合，引起功能的丢失，或者是影响端粒、对DNA修复蛋白招募能力，端粒越长，结合和招募DNA修复蛋白的能力越强，放射敏感性越低。端粒与放射敏感性

端粒通过维持染色体稳定性影响放射敏感性

当细胞不断的复制，染色体未端的端粒不断缩短，当端粒缩短到小于5KB关键长度时，染色体未端的端粒T环结构（T-loop）被破坏，不能保持染色体的稳定性，从而使染色体未端非同源染色体未端融合，使细胞非成熟性复制性死亡。研究发现在放射敏感的细胞中，射线通常可以诱导端粒加速缩短，提示了端粒的长度可能与放射的敏感性相关，在动物实验中，端粒长度与放射敏性得到了证实，敲掉小鼠中mTerc 基因后，使小鼠细胞中缺失端粒酶RNA成份，从而失去DNA修复能力[23]，在放射线照射下，既使在非同源染色体连接和同源修复功能正常的情况下，这种小鼠（mTerc-/-)与野生的小鼠（mTerc+/+)相比，长度缩短的更快，寿命更短[23]，由于端粒酶缺乏引起端粒长度缩短小鼠表现出对放射敏感性增加的原因可能是由于放射引起双链断裂，染色体失功能的溶合，从而干扰细胞正常的修复能力。端粒通过shelterin保护DNA降解位点影响放射敏感性

端粒是保护染色体未端的核蛋白结构，而这种保护作用是由shelterin复合物完成的，它可以结合端粒DNA，使端粒未端DNA降解位点隐藏，不被识别，从而避免DNA损伤反应的激活和不正常的DNA降解。在这个过程中TRF2起着重要的作用，TRF2可以结合到端粒DNA序列上，阻止ATM-P53-P21途径介导的细胞死亡过程[24]，Wu, Y研究表明在正常的成纤维细胞中或端粒酶阳性的肿瘤细胞中，过表达TRF2会使端粒缩短，而且发现TRF2与介导DNA修复染色体重组的XPF-ERCC1蛋白有关，在XPF-ERCC1表达阴性的细胞中看不到TRF2会使端粒缩短的现象，相反当端粒缩短到一定程度时，会使DNA 降解蛋白位点暴露在外面，从而引起DNA双链断裂介导的细胞凋亡过程，在这个过程中，ATM可能识别暴露在外面的DNA降解蛋白位点，引起后面一系列P53介导的细胞降解过程[13]，引起细胞生长周期阻制，从而导致细胞死亡，在这一个过程中ATM识别损伤的DNA 双链断裂，ATM能过磷酸化被激活后，它会直接或见接使P53 N端的酪氨酸磷酸化，从而激活P53，接着P53去激活P53下游基因 P21，引起P21的表达，P21蛋白可以抑制细胞结周期依赖激酶CDK2，从而阻滞CDK2/cyclinE复合物合成，抑制细胞从G1进入S期，因而细胞被阻滞于非成熟的G1期[13]，同时端粒酶结合端粒DNA序列，通过逆转录作用保持端粒的长度，最终延迟ATM应激反应和P53的激活[13]。放射导致辞细胞阻滞也是通过上面的过程，射线先引起细胞内DNA双链断裂，通过激活ATM-P53-P21途径引起P21介导的G期生长阻滞[25]，放射2---4小时内，P53量增加，并且其色氨酸15被磷酸化[24]，Tang, T[26]研究端粒相关蛋白基因的表达改变和放射抵抗性的关系，在不同放射敏感性的人喉磷状上皮瘤细胞系(Hep-2 and Hep-2R)中，端粒相关蛋白基因的表达及生物学特征发生了改变，其中POT1 和TPP1表达升高，而且Hep-2R细胞通过减少G2/S期的细胞阻制从而加速细胞增生复制，从而使端粒加速缩短，增加放射的敏感性。端粒酶与放射敏感性

端粒酶延长端粒影响放射敏感性

在细胞复制过程中会出现端粒不断缩短，端粒酶可以与染色质3-OH未端结合并以自身的RNA为模板通过逆转录酶的作用延长染色体未端的端粒，使端粒始终保持一定的长度，解决染色体复制问题，从而起到抗凋亡的作用[27]。染色体复制问题是指细胞不断进行有丝分裂，染色体未端的端粒会不断的缩短，当端粒缩短到一定的程度时，端粒不会形一个完整T环结构，不能维持染色体的稳定性，从而出现染色体未端非同源性融合，引起细胞凋亡。端粒酶缺乏或功能障碍导致细胞凋亡的机制可能是通过抑制端粒酶催化亚基的功能从而导致端粒的不断缩短导致的，但是依靠端粒的缩短导致细胞凋亡是相当缓慢的，因为需要经历很长的几代复制时间后，端粒才有可能缩到邻近致死长度以下，出现复制问题，从而导致细胞死亡。Holt et al[28]研究表明拥有长端粒的细胞比父代拥有短端粒的细胞相比有更强的抵抗凋亡的能力，Shin, K[6].把端粒酶逆转录基因导入人成纤素细胞中，发现转入端粒酶逆转录基因的成纤素细胞比未转入成纤维细胞中端粒酶活性升高，端粒的长度更长，而且增加了DNA损伤修复能力，增加了对放射线的抵抗性。同样Nakamura [29]通过RNAi 的方法抑制端粒酶活性后，被抑制细胞中的端粒的长度相对没有被RNAi抑制或被博来霉素抑制拓扑异构酶的对照组中细胞端粒酶长度更长，而且对放射线更加敏感。端粒酶通过影响细胞周期影响放射敏感性

André O von Bueren [30]发现在成神经管细胞瘤中通过siRNA 抑制c-MYC表达会抑制细胞的增生，使细胞停止在G1-S期，降低端粒酶逆转酶的表达及端粒酶的活性，同性也会增加对放射线，顺铂，依托泊苷的敏感性[31]。Naka, K [32] 对hTERT表达阳性的共济失调综合征病人的成纤素细胞进行X线照射后，发现细胞停止在G期，并且p53, p21(WAF1), and p16(INK4A)大量积集，对p38 丝裂素蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化后，细胞的死亡更加明显。

ALT途径延长端粒影响放射敏感性

端粒的长度除靠端粒酶以RNA为模板复制维持端粒酶的长度外，最近好现在一些端粒酶阴性的细胞中，端粒也可以保持很长的长度，而且继持端粒酶长度的机制不同于传统的途径，Silvestre, D.C.[33]发现在神经胶质瘤细胞TG20中，端粒酶是阴性的，而且端粒很长，进一步研究发现端粒长度的继持是靠端粒辅助延长途径（alternative lengthening of telomeres ALT)，而且在体内及体外实验发现，ALT表型阳的神经胶质瘤细胞（TG20）比端粒酶阳性神经胶质瘤细胞的对放射线更加敏感，进一步分析DNA损伤位点，DAN双链断裂修复及染色体不稳性提示ALT途径可能干扰DNA损伤修复反应有关，ALT具体的分子机制还不详，Zeng, S[23]发现一种对DNA复制和重组起重要作用的分子MUS81在ALT细胞中对端粒的延长起重要的作用，而且MUS81特异性定位在白血病核体上（promyelocytic leukemia nuclear bodies APBs)与端粒相互作用，去除MUS81会引起细胞生长阻止，增加染色体未端溶合，总之ALT途径在端粒酶阴性的细胞中保持端粒长度起着重要的作用。

在端粒酶缺乏的小鼠和细胞中，端粒的长度与放射敏性显负相关，但Zongaro[34]发现在端粒酶丰富纤维瘤细胞中，端粒的长度与细胞放射敏感性没有明显的相关性，Zongaro[34]培养三组纤维素癌细胞系cen3tel4，cen3tel5和cen3pci16，这些细胞特征是端粒酶丰富，然而端粒很短，端粒长度分别为13，10 和4kb，受到照射后，三组细胞系并没有表现出明显的端粒长度与放射成负相关，说明端粒酶可能除了通过延长端粒来实现对放射线的抗拒外，还存在其它的途径。

端粒酶在体细胞中不表达或表达量很少，而约有80%肿瘤细胞阳性表达，因而对疾病的诊断[5]及治疗有重有的价值，正因为上述的原因，端粒酶成到一个倍受人们观注作用靶点，人们想试图寻求各种方法来抑制端粒酶或改变端粒长度和功能来达到直接杀死肿瘤或改变对化疗放射的敏感性的作用，但是端粒及端粒酶和放射敏感性呈负相关的具体机制目前还仍不清楚，但一些研究提示端粒酶可能通过逆转录来保持或延长端粒的长度，维持染色体未端未端的稳定性，避免染色体的融合，或者端粒的长度直接影响到细胞及时招募DNA修复蛋白的能力，从而影响细胞的放射敏感性。

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