第一篇：western blot失败经验总结
western blot失败经验总结1 我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。
另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。
最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。
western blot失败经验总结2 我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；
2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ心得
１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：
组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml.再加入PMSF(7.4mg/ml)0.1ml.(现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存 ２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行
（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液.加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.（2）离心机 1000rpm，4℃ 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃ 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜后，分装至 EP管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4℃ 离心 30min。（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。
考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：
考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。
BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。
配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)： 1 2 3 4 53 6 G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 0.5mg/ml
BSA------20ul 40ul 60ul 80ul 100ul ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul-----待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。）
紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线, 标准方程及R值（R值应大于0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。（若加入2ul样品，则浓度值需除2，方为真正浓度； 若加4ul样品，则除4）聚丙烯酰胺电泳：
1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。2．配胶：
凝胶储备液（30% Acr/Bise）：
丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉）
10%APS：0.1克过硫酸铵，加 ddH2O至1 ml.(4度保存,一周内使用)，本人都是配新鲜的用。10%SDS: 1克SDS,10 ml ddH2O.(不溶时,可加热50度左右助溶.)TEMED: 原液即可.0.5M Tris-HCl(PH6.8)；
1.5M Tris-HCl(PH8.8): 9.0855克Tris, 加入ddH2O溶解后,用HCL调PH至8.8,加ddH2O到50ML 配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！
本人做的是70KD 和17KD 的分子量，分别配了10%和12%的分离胶，4%的浓缩胶。摇动溶液充分混合（不要过于剧烈以免引入过多地氧气）灌入2/3的分离胶后（估计距梳子底1CM）应立即用ddH2O封胶。等到能看清水和胶的分界线，则可配浓缩胶。用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。插入梳子，不要有气泡。蓝色字体是从别人贴子上看到的
这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用。胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。按照想要的浓度加入LOADING BUFFER配制。本人按每孔总体积20ul, 终浓度1* RSB，含50ug蛋白混合样品，不足的体积用1* PBS补足。短暂离心后，沸水中煮5分钟，放室温，用时再短暂离心。例如.50ug/20ul，做2.5孔, 即50ul，125ug 1
蛋白浓度 10．33 ug/ ul 13．91 ug/ ul 14．87 ug/ ul 19．03 ug/ ul 所需体积 12.1 ul ul
8.4 ul
6.6 ul 5*RSB 10 ul ul ul
ul 1* PBS 27.9 ul
ul
31.6 ul
33.4 ul 5*RSB: 1.89克 Tris-HCL(PH 6.8), 5克 SDS, 0.125克溴酚蓝, 25ML 甘油.(很粘稠)Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例.10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4.12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ML 约30分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔.微量进样器逐个加样,空泳道加入1* RSB.两胶板之间的电泳液要满.接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V.观察MARKER的情况, 适时终止电泳.建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内.如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.不好溶,可用搅拌器.可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.转膜
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.另一块可用做转膜.放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的）。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色.后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱).丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。后来换成NC膜，0.22um，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是5分钟，但也有人说不过30秒，不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的，晃30分钟左右。
滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各15张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。
因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸》膜》胶.他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记.转膜后的胶可用考染看看转膜情况.考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML 10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克).用时加入9 倍的ddH2O 10*转膜缓冲液: 70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水 17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水 封闭
用5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床1小时.5%封闭液: 1克脱脂奶粉, 20ML洗膜液.洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20 抗体孵育
将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及ECL要求来定.4度,过夜.最好有那种4度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇3个小时左右.洗膜液洗3次,每次10分钟.二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1小时.洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了.杂交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配.点蛋白试验:
在正式作WESTERN之前可先做这个,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和ECL试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度.取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去.加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色 ECL显影
将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上.不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好,压片.若肉眼可见发光,可压10-20秒;若看不到,可压30分钟.(再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.)转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了.小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。
具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。显影:转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。
显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。
蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？ 解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。转膜时何为湿法，何为半干法？
解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？
解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。western显色的方法主要有以下几种： i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
DAB好还是ECL好？
答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。
western blot的实验步骤及注意事项的资料
1.把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2.将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3.用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4.膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5.室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6.用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10． 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11． 按步骤9洗涤。
12． 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。
注意事项：
western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。
western blot试验心得
前两天做了一个western blot,现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜，不要漏掉任何一个小角落哟。洗膜的时候，最好将膜放在平皿中，置于水平的试验桌面上，不时用手晃动一下平皿，这样洗膜会比在脱色摇床上更完全。因为在脱色摇床上晃动，有时洗涤液不足以完全没过膜，在最后显色的时候，会发现液体流过的一道道痕迹，使背景值增加。其实在western blot中，以上操作都是小问题，最主要的是一抗的质量和待检测蛋白的提取质量。在试验之前，最好先用阳性对照与一抗做免疫学沉淀检测（如ELISA），看看其效价和质量，以便确定在后来的杂交试验中一抗的选择和加量。另外，在做杂交之前最好也先跑一块PAGE胶，染色，检测一下待检蛋白的提取质量。在加一抗温育之前，最好先将等量的一抗与野生型（即阴性对照）的蛋白在37摄氏度作用30分钟，这样可以封闭掉一抗的一些非特异性结合位点。一定不要忘记做阴性对照和阳性对照，特别是阴性对照，不然结果出了什么问题，就无从分析了。全程做下来，最后的显色就像是个一锤定音的时刻，分外激动，但也应该尤为专注，一旦目的条带出现了，就要马上对显色进行终止，要不然杂带就要出来了。
主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
第二篇：软件项目失败经验总结
项目失败经验总结
1、在项目初期没有进行风险的管理探讨，项目远景定义和功能集合的详细定义。
当项目走了很远，出现很多问题的时候，领导总算想起要做一个边界定义，但这个时候已经迟了，项目已经变得不可控制。
经验总结：
由于客户一般对计算机不是很了解，和他们交流是用软件行业的专业俗术语，他们根本就不懂，如果用文档也很难把需求写得那么明白，而且文档很多的话，客户都看烦了，很不直观。
如果让客户一看就可以看出这个就是他们想要的，我认为最好的方式就是做系统原形（界面的功能模拟）。
系统原形应该在需求分析师的指导下完成，当然开发只是界面的功能模拟，没有底层代码的实现。这样做的目的有三个好处，一是客户很直观的看到他们的系统是什么样子的以及怎么操作，二是这些开发的成果是可以二次利用的，三是可以更好的激发客户的需求。
2、不注重用户参与。
没有一开始就让用户参与详细需求的制定的做法，大部分都是靠需求采集人员的猜想，猜想往往和实际有差距，造成系统功能不切合实际，与项目实际需求差距大，运行效果差。
经验总结：
项目的开始和结束用户是需要一直参与进来的，我们每做个可以运行的功能等就需要和用户交流，这样可以避免很多风险也可以尽早发现需求的误解的等等。
需求调研前期的《信息化规划》、《目标与范围》和需求调研末期的《软件开发需求规格说明书》都要跟客户签字确认，这样既能保证我们所理解的需求就是客户所要的，也使得项目末期跟客户验收时有据可依。
3、集团化以后，项目经理没有意识到信息化核心问题是管理变革问题，还跟着原来的思路开发软件。
在组织架构、权限、供应商等方面与力和集团理解不一致，没有分别按组织进行区分。
经验总结：
要根据企业业务需求制订策略,调整软件组织结构, 详细设计软件各组织架构之间的逻辑关系，做好这些最基础的功课，避免信息化项目成为无本之木。
4、软件开发人员、设计人员能力的低下、项目经理的管理能力不足。
低素质开发人员由于没有接触过实际业务，无法跟客户沟通，甚至害怕客户提出需求，总是担心客户
第1页，共5页 的需求会增加自己的工作量，不愿配合。导致无法理解真正的需求，也无法改进系统功能。
设计人员能力的低下，设计系统结构时过于定制，系统的可扩展性较弱，给后期维护带来巨大的负担和维护成本的激增。
当出现严重问题时，项目经理没有根据现阶段状况重新评价需求分析结果、开发人工数估算、设计结果等就匆忙采取头痛医头、脚痛医脚的措施，致使问题更严重。
经验总结：
实行双项目经理制度：为开发项目设定两个项目经理岗位，一个负责技术岗位，另一个负责管理岗位。目前，国内的软件开发企业的项目经理一般都是一名，而且是技术出身的占绝对多数，他们主要擅长的是技术研发，在管理方面先天不足，这不利于项目风险管理和控制。通过增加专门的管理经理岗位，可以弥补技术出身的项目经理的不足，提升软件开发项目的管理水平。而且这样的经验也已得到了国外业界大多企业的认可。
技术岗位：负责技术框架的稳定性和可扩充性、质量的保证、风险的预测以及数据库的设计，模块测试、接口测试、白盒测试等；
对于该项目具体需要多少人员、时间；到底需要什么层次技能的程序组组长和具体开发人员给出详细的计划；
对程序组每周具体的开发目标的进行检测验收，保证开发进度。以及其它需要考虑的问题等，如网络速度，服务器访问量，数据库查询优化，都需要整体考虑。
管理岗位：掌握行业知识、项目的前期调研、需求分析、功能模块架构设计、人员的管理、实施计划的安排执行和跟踪。提交《目标与范围》和需求调研末期的《软件开发需求规格说明书》。
一个项目在前期的工作非常重要，就算是一个错误的话，后面有再强大的开发团队也是白搭。我们还是一个年轻的团队，很需要公司来培养这样的人才，如果是遇到项目，再招外来人员来担当这样的工作，风险是可想而知的。
而且这样的人员肯定是从项目实战中成长起来的，不是有其他软件项目管理经验的人员或者技术开发人员转过来就可以做好的，更不是从书本或者参加某些培训就可以学到的。
5、一味的追求快速开发，时间进度。
每天都加班加点地工作，造成人员流动的扩大以及工作效率的降低。最后无论客户，还是开发人员，都想早点结束项目。
经验总结：
项目中有个不变的金三角法则，即时间、功能和资源。我个人的意见是用我们的实际能力按照一个正常的进度去做，一个项目在功能、时间和资源一定的情况下，没有捷径可以走的，必须一步一个脚印。
6、胡子眉毛一把抓，不分主次。
整个项目没有指定里程碑或规定设计评审期，没有计划什么时间节点完成某一个组织或部门的信息化评审后，再进行下一个阶段的开发计划与实施。摊子铺得太大，软件人员和准备严重不足。
经验总结：
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根据企业不同的发展阶段，按照规划逐步深入，这样一方面可以避免投资的盲目性，另外一方面在前期的投入收到效果后，再进行下一阶段投入的同时，员工和企业领导也容易接受，软件人员的压力也会相对减少。
7、开发结果不验收测试，开发技术水平低下。
开发结果没经过测试就给客户上线使用，造成报表的数据很多对不上账目，已经打印出来的报表，过几天再打印数据就不一样了。
由于项目经理没有明确要求技术水平，寄希望于员工自己努力，造成打印的单据上，‘毛重’减去‘皮重’ 不等于‘净重’的情况。
经验总结：
必须做好充分准备的开发计划，对于该项目具体需要多少人员、时间；到底需要什么层次技能的程序组组长和具体开发人员给出详细的计划。
8、没有项目总结会议，不重视项目质量。
软件从实施开始就产生了很多问题，但遗憾的是从开始到结束没有组织过一个项目总结会议，问题日积月累，最后导致项目失败。
不重视项目质量。在代码和数据库设计中时间投入很少，这些工作本来就是比较抽象的，需要不断的研究和推敲才能设计好的，但是我们为了时间进度，很快就赶出来了。
经验总结：
每日必须召开项目总结会议，随时捕获风险，当日事当日毕。
软件开发初期的时候，就开始猛抓质量，而不是走“先上线、后优化”的项目常规实施方法。若发现质量不合格的地方，就让开发人员重新返工。
9、软件版本发布周期频繁。
几乎每天都需要进行一次版本更新，有时候1天更新几次。更新完成后，客户无法登陆，软件功能无法使用，以前录入的数据看不见等情况。让客户怨声载道，骂声一片。
经验总结：
发布周期为1周1次或2周1次，在版本更新前，必须做好充分的测试，方可交给客户使用。
10、不重视客户体验，缺少抵御风险的奖励机制。
系统不以客户为中心,不能提高业务部门的工作效率,忽视了客户体验；通常10分钟能完成的工作，工作人员操作软件1小时才能完成。
很多时候加班是没有加班费的，并且在实施过程中又没有任何奖励。所以，员工认为是这套系统拖累了他。虽然项目对公司有益，对他个人就没有多少好处了。
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经验总结：
公司应该拿出一部分预算，有计划有规模地组织用户进行测试，对操作员给出的体验意见做好详细的记录，并给予充分的重视，对其中有用的软件改进意见给出相应的奖励。做好足够的风险应对计划，抵御这种影响所带来的对系统本身的顺利实施以及实施人员的信心和工作激情的冲击。
11、缺少数据风险意识。
在系统的并行阶段，没有统一的基础数据，如材料编码、单据标准等。数据录入的缺少合理安排，缺少数据风险意识。
用户总是反映报表数据与小票单据帐目对不上，录入的小票数据丢失了。
软件系统是一个高度集成的系统，一个环节的出错将可能导致一系列的错误，所以，对数据的准确性提出了很高的要求。
经验总结：
必须制定《公司基础信息编码》，搭建了整个信息化制度。在项目实施过程中，针对类似的问题也不能光靠人工对账减少错误，而应该采取一定的控制措施，利用系统设置，做好问题的预防措施。比如我们可以建立每日审账制度，在系统中进行设置，每天录入完成的票据都进行核对，核对完成后进行锁账。出台《操作规程》，《操作员奖惩办法》等等，规避风险。
12、不注重细节。
天下大事，必做于细。1%的错误往往会导致100%的失败。力和项目在开发的时候，仅仅是满足于“软件可以使用”或“功能能够实现”的情况，并没有关注到每个设计、每次改动、每天的操作。
经验总结：
在此对之前开发过程中一些可以改进的细节列出，进行总结，在今后的开发中将进行改进。（1）软件每一个打开的窗体都应该写上标题，而不能是默认的标题。（2）操作按钮位置、操作顺序必须一目了然。
（3）软件的功能都加上快捷键，使它适应不同操作习惯的用户。
（4）每一个窗体都加上“关闭”快捷键，当用户需要关闭窗体时，只需要点“ESC” 键就可以退出，方便用户的操作。
（5）所有输入文本框都必须按照用户的业务要求进行排列，使用户可以更快更好地输入数据。
（6）进入系统以及退出系统时，如果程序执行比较耗时的代码，应该给出个提醒，而不能让用户傻等，最好放到线程中处理，不能让主线程出现假死状态。
（7）用户登陆的窗口，应该自动帮用户记住用户名，用户可以自己确定是否要记住密码。
（8）复杂的查询条件，错误提示之后，原来的输入是否都还保存？如果都没有了，用户要再输入一遍会很烦。
（9）查询错误或无结果，必须有提示。（10）下拉框中的数据必须有排序。
（11）系统中的各种提示必须要合理，不能有误导用户的情况。
当然，还有许多需要注意的技术和非技术的细节问题，往往我们技术人员觉得不重要的东西偏偏是用户觉得最重要的。我相信，在软件开发的过程中，你只有琢磨你的用户是怎么想的，你才能使我们的软件
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更加完美，付出得越多，得到的越多。
13、没有结果的结束。
我们几乎听不到有人出来说项目失败了，我们听到的是延期、暂停、取消等等形容词，但是其实，我们其实应该承认，我们有做了一个失败的项目。
经验总结：
我们花了钱，项目失败了，但至少应该买到教训。
项目的成败是变数多多，既有技术的，也有管理的，也有关系的，既有自身的，也有客户的，但是只要我们把我们可以控制的做好了，至少这个项目成功了一半。
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第三篇：4个月餐饮创业失败经验总结
为期4个月的创业活动，在汗水与欢笑中渡过，4万6的投入，换来的是对创业的理解和尝试后的释然。虽然项目最终以资金链断裂而失败告终，但我还是觉得这一过程给我的成就感，远远超过失败给我的挫折感。收获部分已经融入了我的意识中相信对我的二次创业会产生很大影响，教训部分我总结如下，希望能给初次尝试创业者一些帮助：资金链，重要，很重要，非常重要
比书本里强调的还重要的多，创业你需要一个清晰的资金使用安排计划，并且需要留有足够的备用金，我觉得至少需要能维持你半个经营周期的数额，以餐饮为例，一个小的经营周期为一个月。这样你就需要至少半个月开支为底限的备有金，我觉得一个月为最优。2 投入不能太理想化
刚创业者往往抱住理想去做事，想要打造品牌，树立形象的心情很迫切。在这种情绪下，很容易忽视实际财务状况。什么都要正规，什么都要最好的。这种做事的出发点没有问题，但创业不仅仅是创，其实更重要的是能立业。理想能带领我们飞的很高，但也很容易让你忽略眼前。而恰恰眼前是你立业的基础。所以抱着理想去规划，正视眼前去经营。3 老板的心态
谁都希望放手让自己的创业项目能不断钱生钱，而自己有大把时间的去享受生活，定期去看看收收钱可就行。这样的好项目我想应该有，但可能轮不到你我这样的小本经营者。这个社会不缺钱，这种好事轮不到你，就算你撞上了，我相信也会很快被拷贝。所以创业初期，别抱住老板的心态去做事，相反当自己是名员工。亲力亲为不说明你不懂管理，而是初期的必须。做好了员工，再去想做老板的事。对各层级的员工的心理定位
对于厨师之类相对专业型的员工，心理上要当作合伙人，这样有助于去权衡一些事情，对于服务员，心理上要当作临时工。她们的工资及年龄只能承受你这样一个定位。随时做好她们将离职的心理准备，高流动性在她们身上很常见。以上说得只是心理层面，表现上要一视同仁，可以无成本的去表现关心!成本压缩，再压缩
这点好像有很多人提到，但我不得不再重复提一遍。因为我是第N个知错不改的人，这也是初次创业者很大的一个心理共性就是不关注小钱。在开支上一定要有葛朗台式的着迷，要为能多省下一毛钱而窃喜半天，但不是让你去偷工减料，至少我不希望这样。君子爱财要取之有道。
以上五点是我感受最深的，希望我的失败总结能帮助更多创业者成功。创业真的是一种美妙的人生经历，虽然我失败了，但我享受这一过程。共勉！在路上的朋友们。
第四篇：ERP实施试运行失败的教训与经验总结
ERP实施试运行失败的教训与经验总结
公司希冀通过上线ERP倒逼公司管理提升，信心百倍慷慨地掏了真金白银将近20万买下了国内某品牌ERP，招聘了我们几个人进到公司，在这期间8个月的时间里，感触良多。长歌九天（我）和另一个女孩小霞是副总招进来，陈总面试的。陈总－－财务总监（ERP实施项目组组长）是老板/老板娘招进来的。在我们进来的时候，公司在进行组织架构调整。除了皇亲国戚没有人员流动之外，管理层和执行层都有一定的比例的流动，相反车间员工的流动性倒不是很大。
工作专注、激情一直是长歌九天的风格（缺点是有些认为不重要的事或棘手的事会拖拉），小霞是一个内向不擅执行的女孩。在进入公司1个月后就离职了（后面过了1个月，才重新招了一个还没毕业的女生进来）。
国家的变革、还是公司的变革都会遇到一定的阻力，或利益关系、或 工作压力（工作量增大）、或不适应新的事物。前者在公司应该不占太大比例可以忽略不计。后二者的因素比较大，员工素质参差不齐，开始最大的阻力来自于仓库，因为仓库之前直属于生产管理，上线伊始，基础数据收集，推三阻四，学着甘地的那一套非暴力不合作态度。其次是财务部本身，因为人事变动，新老员工的职能对立加剧了矛盾的不可调和，导致2个月后的曲未终人先离。再其次是销售，哪家公司销售都很牛B，我们公司的销售可不是一般的牛B，一个小小的接单员敢拒绝配合。当然销售部这一块的阻力，主导实施ERP的我们财务部有不可推卸的责任，后面会慢慢道来。
除了阻力，还有公司的管理水平，家具制造业典型的离散型产业，粗放式管理，就如同放羊一般，材料任君取之。转椅车间又是刚搬迁过来。公司管理仍然是家族企业的作坊式的管理，公司唯一一部法典－－－《***公司运营手册》也是不久前副总重新回到公司后主编的，可见执行的深度与力度及影响力肯定还没有伸到公司每一个角落。人事行政亦没有什么KPI考核，大家的工资都是入职的时候待价而沽的。产值是车间算，车间的工资也是车间算好，交给财务部进行加加减减报给老板娘就OK了。仓库的进销存报表是1个月上交一次，盘点也是1个月盘一次，而且要盘一个星期才能给出数据，仓库仓管人员每天下班前也不用清点单据、实物，收发完了准点下班，让人欲哭无泪的是一个车间仓库盘点时竟然用手一颗颗地数螺丝，哀哉，还停留在原始社会。公司内部里的一个车间还是独立核算的，业务往来都是借来借去。因为地理位置比较靠近地铁城区的原因，公司为了控制人工成本及这一行业的特殊性，公司一线员工基本都是老师傅，年龄均偏高，执行层的员工多是刚毕业的学生。
5月份进入公司的时候，财务部办公室在装修，哈哈，财务部所有电脑也是新配置的，看来老板是决心下本钱上ERP了。ERP在7月份上线跑单据，跑流程（比预计晚了一个月）追随着和蔼可亲的陈总到8月份的时候，由于某些原因，陈总离职了，看见他哭了，50多岁的人，出来这么多年还是第1次看见这个年纪的男人会流泪，天空似乎变得变幻莫测，剩下孤零孤零的两个。但路还得走，只要BOSS的信心在那里，剑指向前方，工作还得继续，完成陈总未能如愿完成的事。当地球转到2014年9月份的时候，强硬的副总也因“身体不适”离开了，ERP的路会走向何方？接下来的半个月时间里，陷入了迷茫，就如同杰克船长失去了航海罗盘。
之前曾看过一本书说，一个项目如果选了一个年轻人作项目经理或项目负责人，等于是扼杀了他在这个公司的职业生命。副总走后（项目推动、跨部门沟通协调的主要责任自然落到了长歌九天的身上），感到一切显得不再那么纯净，在传统文化熏陶的公司里仍就有你死我活的职业斗争，派系之争。副总走了过后，公司下决心整顿仓库，高薪空降聘请了一位仓储经理，在他的要求下，公司又作了一根本性的组织架构调整，仓库矛盾进一步放大，在之后的2个月时间，材料仓与成品仓的主管相继离职。又主张废除仓库手工进销存账，仓库陷入了深度混乱，同时也打乱了长歌九天的布署，交期变得无限期延长，订单量直线下滑与仓库发货效率是密不可分的，仓库数据无法按期提交财务部。
回想走过的这些历程，前期准备工作有些地方是欠妥，但基本上是能按期完成，比如基础静态数据的收集、整理、校对、导入在陈总的指导下都在有条不紊地进行。动态数据随后也是基本导入完毕。选择通用型ERP软件，必然会遭遇与公司实际业务许多地方不相一致吻合，这是 一个漫长的磨合调试的过程。项目实施是项巨大的工程，全盘与细节均需要注重，全盘决定进度，细节决定关键用户的认同度。家具行业涉及五金件，材料的种类零散，种类繁多，再加上是家具行业内的特殊小行业，订制件远远超过标准件，基础资料的收集、归整、编码一定程度上带来了非常大的难度。关键用户人员岗位的缺失，在费了九牛二虎之力的游说和坚持下，终于把技术部专门负责编码的岗位人员落实了。仓库发料通常有两种方式，一种主动发料的方式，一种由生产领料的方式。前者一般在管理水平比较高的企业采取按BOM表需求发料这种方式。几番唇舌，又终于搞定了领料单制单岗位人员。
公司暂时还没上生产模块，只是上了供应链与财务模块，却上的如此之惨淡，仓库是所有环节的短板。在前期采购软件，计划实施的时候，首先是没有确定公司内部实施的具体人员，只有陈总1人，呵呵，长歌九天和小霞还没进来。再者是公司内部实施人员没有进行足够的培训，与对软件的透彻的熟悉，当然也就没有制定的出一个详细的进度横道图出来，曾经好像看到陈总做进度横道图的影子，不知何故却无疾而终，这也是陈总走了后的一周，长歌九天晕了一阵子，太多的事情需要去跟进，每个环节需要去盯着单据，几个部门都呼来唤去，几乎是忙得快晕头转向，公司的单据格式都是跑流程后才去调的，这也给销售牛B顽固抵抗留下了口实（因为她们得线下线上都做一遍，所以抗拒，哈哈）。所幸的事，对EXCEL还算比较精通，在前期数据整理、校对的时候，基础数据进去的都还比较准确。比较郁闷的是转椅车间的流程仍然是没有章法，处于人治社会。继而对转椅车间开刀，盯着他们跑流程。
下面说到数据，基础数据是ERP运行下去质量好坏的基石，没有准确完善的基础数据，想从ERP中获得有价值的信息，无异于空中楼阁，纸上谈兵。有了基础数据，还需要完整正确的单据录入进ERP中，单据就是大楼的砖头，这是上ERP的跑流程、跑数据的重中之重，单据不光要录进去了，而且要盯着是不是录对了地方，数据是不是与实际业务相吻合一致。供应链中的单据，供应链采购这一条链条的单据因为最开始就是我管，所以毫不谦虚的说，抓得蛮好，在跑单据的第2个月，单据基本完全录进去了，而且录对了地方。应付账款系统账与手工账基本是对的上的。比较难的而是销售客户这一链条，因为销售的阻力，没有BOSS的明确拍板，不敢贸然强制要求销售按ERP流程走，所以拖了几个月后，才艰难的走上轨道。最难的其实还是生产、仓库内部环节这一链条，有人说，最难战胜的不是敌人，而是自己，换言之，上ERP最难说服的不是供应商不是客户不是采购，不是销售，而是生产、仓库、财务自身。
最基础的数据基本上收集整理、导入都还算比较顺畅，但BOM表资料，公司相关部门还没有这一块完善的资料，经过了相关领导的努力配合终于在几个月后给出了数据。但采购价格档案资料提交似乎变得遥遥无期，这一点与家族企业的管理不无关系。前面说到为了对领料进行规范，确定了领料单制单环节，遗憾的是老板似乎对上ERP不再那么激情、坚定信心，信心一动摇，把领料环节废除了，又退回了老路，试图用BOM表领料，完善仓库管理又无从谈起。
公司上ERP试运行客观的说基本上是失败的，前期规划不足，公司内部实施人员对软件的熟悉程度不高，公司内部项目实施核心人员流失，老板信心不坚定是三大主因，次因是公司仓库管理簿弱，仓库数据不准，仓库材料与成品制单员岗位没有分离，却账物分离在公司目前的规模是不适合的，不现实的，这也是导致仓库库存数据一直不准的原因之一。
希望公司在梳理好了基础资料之后第2次上线ERP的时候能吸取这些教训，避免重蹈覆辙。
感恩公司，感恩公司的每一位员工，感恩BOSS,感恩何总赖总的支持,感恩陈总、梁顾问、庞顾问的指导。
长歌九天
2015年01月05日
第五篇：[经验总结] 研究生考试失败的十大常见原因 [
第一，报考条件不符合，盲目报考，竹篮打水一场空。l# m2 E)|.a' z
有些同学根本就不符合报考研究生的条件，也开始盲目的备考，很多咨询的同学中，发现很多专科生、本科生、少数民族考研的报考条件都不符合，若不是经过老师及时提醒，这一年真的是白白的准备了！!J“ T8 L” i# N4 O-E(o# F # x1 O, [% k7 R/ p: i0 a
您要仔细想一想，我符合报考条件吗！我真的喜欢这个专业吗！我是不是一时的兴趣呢，如果你不能解答，可以做一下专业方向在线测评，看看自己报考的专业，是否如心中所想！
第二，本末倒置，弄混专业课和公共课的关系。, N;A9 v.Q“ XA4 S8 })x9 N: l8 G-M& i* r# t
经过对学员的持续跟踪，最终入学的同学都是专业课分数比较高的，而公共课例如政治、英语过线即可，但是大部分同学都把精力花费在了公共课上，对提分最有帮助的专业课置之不理。或觉得很简单草草一看！2010年北师大心理学考研，刷掉了大部分专业课和总分不过关的同学，而公共课不过线的人比例实在是太少。* {6 [5 y2 u: Q7 v” M;]
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同学，我不知道你现在的备考策略，但是我们很负责的告诉你，不要忽略专业课，忽略了专业课，就等于放弃了考研！
第三，没有合理的复习计划，永远在原地踏步！# i1 S' V6 z& V+ q5 g.y
没有合理的 计划，你永远都在原地转圈，去年都到了五月份了，很多咨询的同学都说自己一本书还没看完，有的或者说自己看的比较精准，但是当我们的专业老师随机提了一个 问题后，好多同学都答不上来！其实这就涉及到一个复习计划的问题，如何制定一个合理的计划，对自己全年的考研都是非常必要的，你也不要随便从网上下载或者 复制一个别人的计划，别人的不一定适合你，根据自己的特点，制定自己的计划吧！
如果你现在还没有一个可行的计划，或者是自己从网上下载的计划，那你真的好好想一想了，也可以和我们在线的专业老师咨询，多了解一些，对自己备考总是有好处的！0 s7 ^' o& n7 D$ s)Q+ s6 z
第四，恒心不足，没人监督，中途放弃！
第一次在考研准备了一个月左右，同学这个时候遇到一些考研难题但是又无法解决，就会产生动摇。如果没有人来鼓励你坚持下去，60%的人都会选择放弃！第二次是在临考的时候，经过一年的准备，压力急剧增大，患得患失，这个时候就需要有专业的人来给大家做压力舒缓，如果度不过这段时期，考研也会夭折。1 ]!e2 N' w8 h% F& S0 z# S7 d
如果您独自备战，那您如果有朋友适时的监督你就好了，或者找几个一起考研的朋友一起考研，互相监督效果会好一些，如果你是个自制力很强的人，那恭喜你，此条略过！
第五，学习计划的完成质量低，半途而废！
# ~$ U2 l-W3 q+ y-z4 T& B9 |
有了适合的复习计划，但是完成情况不好，总是因为这样那样的杂事，耽误了学习进度，最常见的情况就是70%以上的同学上网找资料，学习的同时，都开着
QQ聊天窗口，一边听着音乐，或者看这电影，mygod！这样的学习效果能好吗。3 h;Dp* I& V0 X: Q
第六，盲目乐观，缺乏客观认识。
考研，我们都是第一次，我们都没有经验，也许你会说谁谁谁，也是那么复习的，也考上了，但是你光看到了人家的一方面，忽略了人家另外的努力。
拿一些同学为例子，当老师和他们沟通的时候，他们都说自己复习的很好，进度也完成的很好，但是我们随机问的一些问题，他们就回答不上来了，最后只能踏踏实实发的复习。0 T9 X& t-o-G9 I5 C% ?' @
第七，对报考院校与导师的信息缺乏。9 J(q(A: h4 g0 @
这个原因说起来有些可笑，有个同学给我们打电话，说要报考浙江大学某某导师，信心满满的样子，我们老师让他自信核对一下这个老师的信息，他就说在网上论坛里找到的，最后我们告诉他，这个老师早就不在浙江大学任教了，该同学这个郁闷啊！% X' s3 r9 Ul/ K” $ k
网上的信息可信，但是可信度不高，很多都是一些人发的不负责任的信息，如果你想报考某学校或者导师，那请你一定咨询清楚，或者找到该大学去，或者咨询一些相关的辅导机构！# a$ nz-C# i$ h3 ?# M: w6 k
第八，光说不练，从来不做习题！
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考研是需要做题的，光看书是远远不够的，例如心理学的心理学统计、心理学测量。教育学的教育科学研究方法，这些对于文科生来说都是比较难的，需要用到公式和计算，但是很多同学一到这里就自行忽略过去了，这这种掩耳盗铃的方法肯定会失败。.O, a# ^& b, E4 CX% ~& x# Z0 k5 W3 h
另外一些同学苦于找不到专业的习题库，还有同学自己买了习题集，但是做了以后也不知道过程和解答的具体方法，没人答疑，做了效果也不大。9 A7 x5 U4 N2 v' D-m, t6 a2 |
第九，复试信息不足，与报考院校失之交臂。
考研过了初试，你可以高兴一天，但是马上就要静下心来好好准备，复试还是要刷掉一批人的，很多机构都说自己过线率有多高，但是过线不等于考上，你总分考了全宇宙第一，你被刷下来，也毫无办法。/ ^/ a& Xn% g!_)K: a+ A+ t , E0 K4 C, o: c8 T-U2 ~, K& u
每年都有一大批杯具人物，当他们的分数被某些机构高调挂在网站上的时候，其实这些孩子心里却在流泪，为啥，分高，但是没考上！这就是不重视复试的原因。
所以你必须了解你所报考院校的复试情况，及早的做好准备，了解导师的一些著作文献等等。6 ~0 J/ Z# S# ?.F
第十，调剂信息，最后的救命稻草！+ n8 A% a;~* C” d.N, o)A' h1 @
也许你的分数不够高，但是你也能考上一所好学校，调剂信息能否把握好，使我们最后一根救命稻草！4 u;H-l!f4 W3 @, G2 W
# : T6 M1 C7 W0 O5 J* S
如果您是自己准备的话，请一定不要坐在家里等着调剂信息出来，一定要多方奔走，自己去联系院校，否则等到调剂系统出来的时候，其实调剂成功的名额差不多都满了，成功的希望不大了，这是对同学的一些建议！切记！切记！
总而言之，考研是一辈子的大事，如果要考，就认认真真的考，争取一次考过，两年考研、三年考研的想法就不要有，我们都是聪明人，为什么要多一年或者几年的时间、精力、金钱呢！
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