lamp技术介绍以及在微生物检测中的应用

第一篇：lamp技术介绍以及在微生物检测中的应用

研究生课程论文

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微生物检测技术

LAMP技术及其在微生物检测中的应用

王 飞

生命科学学院

微生物

2011216016 11 年 12 月日

课 题姓 学

专

学

LAMP技术及其在微生物检测中的应用

摘要：环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增，且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观察或浊度计即可判定结果。因此LAMP是一种不需要热循环仪、肉眼即可判定结果的高度特异和敏感的DNA扩增方法。近年LAMP技术在病原微生物检测及食品微生物检测上已有广泛应用，本文就LAMP极其在这两方面的研究进展作一综述。关键词：LAMP；环介导等温扩增；核酸扩增

Application of LAMP in detection of microorganism

Abstract: LAMP(loop-mediated isothermal amplification)method, which develops in recent years, is a sensitivity, special and convenience nucleic acid amplification technique.To compare with the traditional PCR, LAMP, which needn’t hot circle, is constant temperature amplification.Because LAMP can produce a mount of coproduce, magnesium pyrophosphate, which is a white precipitation, the result can be estimated by eyes or nephelometer without electrophoresis.In recent years, the application of LAMP in detection of disease pathogen and microorganism in food had been wide studied.These articles summarize the studies in these two aspects.Key words: LAMP;loop-mediated isothermal amplification;nucleic acid amplification

1.引言

核酸体外扩增技术是分子生物学领域最重要的研究手段之一，以检测核酸为基础的分子诊断技术已广泛应用于临床医学和微生物检测等领域。目前，核酸体外扩增技术主要包括常规PCR扩增和等温扩增两大类。常规PCR包括单一PCR[1]、[2][3][4-8]复合PCR、套式PCR、竞争性PCR和实时荧光定量PCR，等温扩增包括核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[9]、滚环DNA 扩增(rolling circle DNA amplification，RCA)[10]、指数式扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)[11]、连接酶链扩增反应(ligase chain reaction，LCR)[12]、链置换扩增反应(strand displacement amplification，SDA)[13]和环介导等温扩(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[14]技术等。常规PCR扩增由于快速、灵敏度和特异性高等优点广泛用于分子诊断领域，但由于常规PCR扩增需要配套的控温精密的仪器和复杂的实验程序，大大提高了检测成本。等温扩增技术是近年来发展迅速的一类核酸体外扩增检测技术，其区别于常规PCR扩增技术的关键在于扩增反应的温度不同，无需控温精密的实验仪器和复杂的实验程序。上述几种等温核酸扩增技术中，LAMP技术由于具有快速、高效、灵敏度高、特异性高和可定量分析等优点已经广泛用于临床和微生物分子诊断领域。本文就LAMP技术的原理、引物设计及其在分子诊断和检测领域的应用进行综述。

2.LAMP的技术特点

2.1 LAMP技术的定义

LAMP是一种敏感的链取代核酸扩增技术,这种方法能在恒温条件下(约65℃)、一个小时内,将目的DNA从几个拷贝扩增到109个拷贝。LAMP技术扩增、检测目的核酸片断,一般以200~300bp为宜,一般实验流程包括:GenBank检索目的基因片断(并通过BLAST确定该片断与其他物种基因的同源性),人工或在线设计引物组,引物合成、Bst DNApolymerase large fragment(若进行RT-LAMP扩增,还需加入AMV反转录酶)及相关缓冲液准备,确定反应体系、扩增,反应结果判定等[15]。2.2 LAMP引物

LAMP技术的引物设计，比PCR技术要复杂[16]。它针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，包括对内引物FIP和BIP，和一对外引物F3和B3。若再增加一对环引物(1oop primer)，便可使反应加速，提高扩增效率。相关文献[17,18]对引物设计的技术做了详细的报道，并且目前已开发出用于LAMP引物设计的相关软件，如Primer Explorer version 3软件，使引物设计更加简便。2.3 LAMP扩增原理

60～65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，是一种动态活性温度，因此，DNA在此温度下合成是可能的。利用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环[19]。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段，上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换DNA聚合酶作用下向前延伸启动链置换合成，外部引物F3与模板F3c结合并延伸,置换出完整的FIP连接的互补单链，FIP上的F1c与此单链上的F1为互补结构，自我碱基配对形 成环状结构。以此链为模板，下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链，迅速以3`末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA 合成延伸形成茎环状结构，该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。第2 阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，迅速以3′末端的B1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB,它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。2.4 LAMP产物的检测

(1)电泳检测：LAMP的产物可以用琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，由于产物是混合物，故呈现出特异的梯状条带，经限制性内切酶酶切之后呈现单一靶序列条带[20]。

(2)荧光检测：SYBR Green I 荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA

［21］双链结合时，肉眼观察荧光染料由橘黄色变为绿色，紫外线下可以发出荧光，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA 分子的数量，荧光强度检测可以用实

时定量PCR仪进行。

(3)浊度检测：是其特有也是最常用最便捷的检测方法，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2＋结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。反应方程式如下：

（DNA）n-1 ＋ dNTP＝（DNA）n ＋ P2O74－ P2O7 ＋ 2Mg ＝Mg2P2O7（沉淀）

其具有极高的特异性，只要用肉眼观察[22]或浊度仪在400nm光下检测浊度就能 够判断扩增与否，并对起始模板定量，达到实时定量的检测[23]。2.5 LAMP的特点

LAMP 与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点：

(1)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断，对于RNA 的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行（RT-LAMP）,不需要特殊的试剂及仪器。

(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，核酸扩增在1h内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20～30min均可检测到扩增产物,且产物可以扩增至109倍,达0.5mg/mL，应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。

(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。同时LAMP还有一些不足的地方。由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度 好在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链DNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，故要特别注意严谨操作，以及在产物的回收鉴定、克隆、单链分离[21]方面均逊色于传统的PCR 方法。

4－

2＋3.LAMP技术在人类传染病病原检测中的应用

3.1 DNA病原检测

DNA类致病病原主要为DNA病毒和DNA细菌。相对而言，LAMP技术对DNA病毒的检测研究相对较多。

2005年Enomoto等[23]对单纯疱疹病毒的I型和II型分别设计LAMP引物，彼此之间保持高度特异性，并发现琼脂糖凝胶电泳比沉淀直接观测在灵敏度上高2～10倍；对18份病人拭子进行检测，I型和II型检出率分别为50％和56％.特异性为

[24][25]90％和100％。Yoshikawa和Ihira等分别建立了人疱疹病毒6型和7型的LAMP检测方法，他们设计的LAMP引物具有高度的特异性和敏感性，且对人疱疹病毒 6型的研究还发现，当提高引物浓度时，灵敏度可提高一倍。Suzuki等[26]对巨细胞病毒进行了LAMP技术的研究，不但证实了该技术用于巨细胞病毒检测敏感、特异，还对构建巨细胞病毒质粒cDNA标准品的定量检测进行了探讨，其检测标准曲

线的相关系数达到99．4％。Yamada等[24]对细小病毒B19也进行了相应检测，证实LAMP技术比常规PCR技术灵敏100倍，还成功尝试了SYBR Green I直接染色判定检测结果。

在细菌病原检测方面，Hara-Kudoa等[27]对沙门氏菌的39个血清型220个菌株进行了LAMP检测，运用了3种结果判定方法；灵敏度达到2．2cfu／管，明显高出常规PCR。Maeda等[27]在对牙龈卟啉单胞菌的检测中也运用了3种结果判定方法，发现琼脂糖电泳和SYBR Green I的检测极限相近，直接沉淀观测法则低10倍；此外，通过real-time PCR和real-time LAMP的比较发现，后者在快速性、便捷性上有较大优势。最近，Yano等[23]对肠毒素大肠杆菌的LTI及STI基因的LAMP研究再次验证了该法的特异性(非LTI及STI基因型的Ecoli及其他细菌均不扩增)及高灵敏性，加人环引物后扩增时间可以从60分钟缩至35分钟。3.2 RNA病原检测

人类传染病的RNA病原主要是指RNA类病毒。RNA类病毒的基因组有变异大和进化快的特点，它不但是许多重大传染病的病原，也是当前人们研究的重点。Thai等根据SARS冠状病毒的保守序列1b Rep gene开放读码框设计了包括环引物在内的6条引物，进行了一步法RT—LAMP检测；检出时间早至11分钟，检测极限达到0.01PFU，灵敏度比RT-PCR高100倍；对49例临床鼻、咽拭子进行RT-LAMP和RT-PCR对照检测，RT-LAMP的灵敏性达到100％,产物经限制性内切酶酶切及测序验证其特异性达到87％。Shirato等[26]对59例人呼吸道合胞病毒进行了RT-LAMP、病毒分离和免疫学检测，检出率分别为61％、34％和56％;此外，还对RSV的A、B亚型分别设计特异引物，并进行产物酶切鉴定。研究表明，RT-LAMP是一种稳定可靠、敏感度高的实用型检测技术。今年Yoshida等[27]建立了从临床病样中检测腮腺炎病毒的LAMP方法，其引物组针对腮腺炎病毒基因组中血红球凝集素一唾液酸苷酶编码区域设计，可用于鉴别腮腺炎Hoshino疫苗株和循环野生株。

Pafida等[28]建立了不同血清型登革热病毒的一步法real-time RT-LAMP检测，该法的检出率达100％,而常规RT—PCR和细胞培养分离的检出率只是87％和81％ 且不与黄病毒科其他病毒有交叉反应。Kumsaki等[28]对危害性很大的埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)也进行了real-time RT-LAMP检测研究。在体外转录得到高浓度

3目标RNA后实施定量RT—LAMP检测，26分钟内可以测到10拷贝，30分钟内可以测到104个拷贝。Toriniwa等[25]也成功地将real-time RT-LAMP应用到日本乙脑病毒的检测上。

由于诺如病毒(Nomvirus)基因型间的多样性和型内的高变异性，其RT—LA MP引物的设计难度较高，操作也相对复杂。Fukuda等[26]对I型和Ⅱ型诺如病毒分别设计了9条和13条特异引物，并对26份临床粪便进行一步法单管RT-LAMP扩增，结果RT-LA MP对I型和Ⅱ型诺如病毒的检测极限分别达到100个拷贝／管和1000个拷贝／管；与传统的RT-PCR相比，RT-LAMP对工型诺如病毒的特异性为94％，I型诺如病毒为100％。[25]4.LAMP在食品病原微生物检测中的应用

4.1食品中大肠杆菌的检测

肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)是指能够引起人类出血性肠炎的一类大肠杆菌,主要经口传播。该菌引起的食物中毒首先在美国于1982年爆发,之后在世界各地相继发现病例。即使在卫生条件较好的国家,大多数肠道传染病已基本得到控制,但EHEC感染问题仍日益严重,越来越受到各国的高度重视。在美国、加拿大、英国和日本等发达国家,都发生过E.Coli O157的暴发流行。2001年卢林秋等进行的调查表明,我国食品中也存在E.Coli O157菌株。EHEC类型多,血清型复杂,常规检测方法难以有效实现快速、灵敏地进行全面检测。2003年Maruyama[27]等用原位LAMP方法检E.ColiO157∶H7O27(有一个stx1基因和两个stx2基因)的stx2基因,并用FITC标记抗E.ColiO157∶H7抗体,在紫外下照射。试验结果显示,较原位PCR而言,温和的渗透性及低等温条件使得原位LAMP引起较少的细胞损伤,并且在DNA扩增中允许使用荧光抗体标记。此外,Maruyama还发现LAMP方法的背景颜色较浅。因此,LAMP方法是一种特异性强、敏感性高、省时、省力的EHEC检测方法。

侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli EIEC)是一种肠道侵袭性细菌。它侵入肠黏膜上皮细胞,在细胞内繁殖引起细胞变性,使肠上皮出现损伤,导致黏膜固有层发生炎症、溃疡、出血,临床上表现出细菌性痢疾症状,所以当初称之为志贺痢疾样大肠杆菌(Shigelloid E.coli)。国内于1984年首次报道了EIEC引起的食物中[28]毒。可见EIEC是一组较重要的腹泻病原菌。然而,由于其生化反应不典型,部分血清型与志贺菌属间存在抗原交叉,从而给鉴定工作带来了很多困难。因此,在日常检测工作中往往被忽视或误报为志贺菌属。从流行病学方面来考虑,准确的病原学诊断是必不可少的。2005年Song[29]等用LAMP方法对EIEC和志贺氏菌的同源基因ipaH进行检测。作者从病人的腹泻样便中分离出38株肠病原体用于检测LAMP方法的特异性,一株志贺氏菌YSH6000用于比较LAMP和PCR的敏感性。LAMP方法对所有的致贺氏菌及EIEC呈阳性,对其它菌呈阴性;整个LAMP实验在2h以内完成,其最小检测限达到8个菌落单位。相比较而言, PCR的检测限为8×102个菌落单位。LAMP方法是特异性强、敏感性高的EIEC快速检测方法。4.2沙门氏菌的检测

沙门氏菌(Salmonella)是引起食品中毒和伤寒的主要病原菌,主要通过污染食品和水源而传播。沙门氏菌引起的食物中毒最常见。约占细菌性食物中毒的42.6%-60%。目前所使用的沙门氏菌分离培养、生化反应、血清学和传统PCR技术等检测方法操作繁琐、费时、灵敏度低、易污染,已不适于食品和水源的卫生监测和流行病学调查。2005年,KayokoOhtsuka[30]等对疑被感染沙门氏菌的水样鸡蛋中进行抽样(110个样品)检测并与分离培养及PCR做比较。结果显示, PCR漏检了10%, LAMP及分离培养的检出率为100%;LAMP是比分离培养更快速、灵敏的检测技术。因此, LAMP方法是快速、灵敏、特异的沙门氏菌检测方法,是鸡蛋车间管理的可靠监控手段。4.3白斑综合症病毒的检测

白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是世界水产养殖业危害最严重的病原之一,它不仅存在对虾中,而且存在于其他的甲壳类动物中,例如,螃蟹、小龙虾等。该病毒分子量较大、结构特异,是已知动物病毒中最大的病毒。

Lightner报道,WSSV在所有对虾病毒中,毒力最强,危害最大。2003年Tomoya Kono等根据WSSV-DNA序列设计4条引物F1、F2、B1c、B2c(大小分别为20nt、19 nt、22 nt、20 nt),用LAMP方法和巢式PCR对对虾组织中分离的WSSV-DNA进行扩增,比较了两种方法的检测限。结果表明,LAMP的检测限达到1fg,一步法PCR的检测限是100pg,二步法PCR是10fg,说明LAMP方法的灵敏度远远高于PCR。由此可知, LAMP方法是WSSV的快速、高效检测方法。4.4检测传染性造血器官坏死病毒

LAMP方法不仅可以扩增DNA,而且可以扩增RNA。只要在原反应体系中加入RNA反转录酶(15U/μL)即可传染性造血器官坏死病(infectioushematopoietic

necrosis virus, IHNV)是一种RNA病毒,主要引起大马哈鱼和虹鳟鱼苗和幼鱼的传染性造血器官坏死病,造成脾脏和前肾造血器官坏死。IHNV是迄今为止世界上已经报道的共约50种鱼类病毒中危害极为严重的一种。2004年Gunimaladevi等首次发表了用LAMP方法检测虹鳟鱼及鲑鱼中的IHNV。作者同时用LAMP及RT-LAMP方法检测虹鳟鱼的IHNV,并比较LAMP与巢式PCR的检测灵敏度。研究结果显示, LAMP和RT-LAMP方法的检测限相似,而比PCR高一个10的数量级。此研究表明LAMP方法具有简便、快速、特异性和灵敏度高等特点,是极具前途的快速检测IHNV的方法。

5.LAMP技术前景展望

LAMP 是本世纪发展起来的一种分子生物学技术，虽然还存在诸多的缺点和不足，但它在不断地改进和完善，它最主要的优点是不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单、扩增快速高效，适合各种条件下的快速检测，实用性强，故其应用范围越来越广泛。综上所述，我们有理由相信LAMP 作为一种核酸扩增的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。

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第二篇：微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用

微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用

msw生物处理技术主要包括好氧和厌氧生物处理。好氧生物处理如：好氧堆肥、生物反应器填埋等，其工艺中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等微生物种群。厌氧生物处理，如：厌氧消化、厌氧填埋等，其工艺中的微生物又称“瘤胃微生物”，主要有水解细菌、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等。

在msw好氧生物降解过程中，细菌凭借强大的比表面积，可以快速将可溶性底物吸收到细胞中，进行胞内代谢。总的来说，其数量要比放线菌和真菌多得多。当然，在不同的环境中分离的细菌在分类学上具有多样性，主要有假单胞菌属（pseudomonas）、克雷伯氏菌属（klebsiella）以及芽孢杆菌属（bacillus）的细菌。在堆肥过程中，细菌总数的变化趋势是高-低-高。堆肥初期，有机废物中携带有的大量细菌分解有机物质释放能量，使堆体温度上升，此时，常温细菌受到抑制，嗜温细菌活跃；当堆温升至高温阶段，只有少量的嗜热细菌可以活动；高温期过后，随着有机成分的减少，堆体温度降低，嗜温及常温细菌又开始活跃，使细菌总数上升。整个好氧降解过程中，嗜温细菌是堆肥系统中最主要的微生物。

现代生物技术与环境保护

现代生物技术是以DNA分子技术为基础，包括微生物工程，细胞工程，酶工程，基因工程等一系列生物高新技术的总称。现代生物技术不仅在农作物改良、医药研究、食品工程方面发挥着重要作用，而且也随着日益突出的环境问题在治理污染、环境生物监测等方面发挥着重要的作用。自20 世纪 80年代以来生物技术作为一种高新技术，已普遍受到世界各国和民间研究机构的高度重视，发展十分迅猛。与传统方法比较，生物治理方法具有许多优点。

（1）生物技术处理垃圾废弃物是降解破坏污染物的分子结构，降解的产物以及副产物，大都是可以被生物重新利用的，有助于把人类活动产生的环境污染减轻到最小程度，这样既做到一劳永逸，不留下长期污染问题,同时也对垃圾废弃物进行了资源化利用。

（2）利用发酵工程技术处理污染物质，最终转化产物大都是无毒无害的稳定物质，如二氧化碳、水、氮气和甲烷气体等，常常是一步到位，避免污染物的多次转移而造成重复污染，因此生物技术是一种既安全又彻底消除污染的手段。

（3）生物技术是以酶促反应为基础的生物化学过程，而作为生物催化剂的酶是一种活性蛋白质，其反应过程是在常温常压和接近中性的条件下进行的，所以大多数生物治理技术可以就地实施，而且不影响其他作业的正常进行，与常常需要高温高压的化工过程比较，反应条件大大简化，具有设备简单、成本低廉、效果好、过程稳定、操作简便等优点。

所以，当今生物技术已广泛应用于环境监测、工业清洁生产、工业废弃物和城市生活垃圾的处理，有毒有害物质的无害化处理等各个方面。

第三篇：微生物检测技术复习资料

名词解释

1病原微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物。

2无菌操作：用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作 3灭菌：用物理和化学方法杀灭或清除传播媒介上一切微生物的方法

4菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。

5大肠菌群：寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，随大便排出体外。食品中大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。微生物：一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。包括病毒、细菌、真菌、原生动物和某些藻类。

7微生物检测：基于微生物学的基本理论，利用微生物实验技术，根据各类产品卫生标准的要求，研究产品中微生物的种类、性质、活动规律等，用以判断环境、产品等卫生质量的一门应用技术。菌落：将细菌接种在固体培养基上经18∽24小时培养，长出肉眼可见的来源于一个细胞的细菌集团。荚膜：在某些细菌细胞外壁外存在着一层松散透明、厚度不定的胶状物质叫荚膜。10消毒：杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的FF。

填空简答

1饮用水的微生物检测

大肠菌群是指示水质受粪便污染的指示菌，细菌总数指示水体受污染物污染的情况。我国GB5749-85《中华人民共和国国家标准 生活饮用水卫生标准》中规定生活饮用水细菌总数每毫升不得超过100个，大肠菌群每升不得超过3个。培养基的分类（按物理性质）：液体、固体、半固体、脱水培养基

3病毒的组成：核酸和蛋白质革兰氏染色：阴红阳紫 5 细菌特殊结构的功能：

鞭毛：是细菌的运动器官，鞭毛菌在液体环境下可自由移动，速度迅速，抗原性 1化学趋向性运动，有助于细菌向营养物质处前进，而逃离有害物质.2.与细菌致病性相关

3.可用以细菌的鉴定和分类

菌毛：菌毛是在某些细菌表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物，须用电镜观察。特点是：细、短、直、硬、多，菌毛与细菌运动无关，根据形态、结构和功能，可分为普通菌毛和性菌毛两类。前者与细菌吸附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有关。

芽孢：芽孢是细菌的休眠体，对不良环境有较强的抵抗能力。耐热性、抗逆性强（抗热、抗辐射、抗化学物质和抗静水压等能力）

荚膜：①抗吞噬作用②黏附作用③抗有害物质的损伤作用④抗干燥作用⑤当缺乏营养时，荚膜可被利用作碳源和能源，有的荚膜还可作氮源。肺炎双球菌：光滑型(简称S型)产生荚膜，有毒；粗糙型(简称R型)不产生荚膜，无毒。7 芽孢：抗逆性强

8疯牛病

牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy, BSE），又称疯牛病，是一种侵犯牛中枢神经系统的慢性的致命性疾病，由一种非常规的病毒——朊病毒（Prion）引起的一种亚

急性海绵状脑病，这类病还包括绵羊的搔痒病、人的克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakob Syndrome , CJD）（又称早老痴呆症）、库鲁病以及最近发现的致死性家庭性失眠症等等。

朊病毒是一类非正常的病毒，它不含有通常病毒所含有的核酸，而是一种不含核酸仅有蛋白质的蛋白感染因子。

朊病毒属于亚病毒，亚病毒包括：类、拟、朊病毒三类。人类三大流行病原：线虫（原生、无脊椎动物动物）分类：包括自由生活线虫（海洋、淡水和土壤中）和危害植物的病原线虫人类病原真菌的分类：

1）浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，顽固性，但影响身体较小；

2）深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。

3）此外，有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。12原核微生物常见类群

1）真细菌：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体

2）古生菌 13真菌类群

鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门、半知菌亚门细菌的基本形态

细菌的种类虽然很多，但其基本形态只有三种：球菌（葡萄球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌）、杆菌、螺旋菌（弧菌和螺菌）。15 病毒的分类

1）按感染的对象分

动物病毒、植物病毒、细菌病毒、昆虫病毒及真菌病毒，另外尚有亚病毒——类病毒(Viroids)拟病毒(Virusoid)和朊病毒(Prion)。

2）按遗传物质分类分

DNA病毒和RNA病毒两大类

（噬菌体寄生于细菌中病毒的总称。）高压蒸汽灭菌指标： 0.10MPa，121℃，20min左右纯种分离的技术方法

1）固体培养基纯种分离技术:① 稀释倒平板法；② 涂布平板法 ③平板划线分离法；④稀释摇管法——厌氧微生物的分离

2）液体培养基纯种分离技术——稀释法（不可靠）

3）单细胞（孢子）分离——显微分离

4）选择培养: ① 选择平板培养② 富集培养

问答题

1、微生物有益方面

1）微生物与粮食增产

固氮、解磷、解钾、生长激素、分解大分子碳源等促生产功能，抗病虫害。

2）微生物与能源供应

产乙醇、产甲烷、分解长链烃或脂肪酸为短链燃料，微生物电池、微生物采油。

3）微生物与资源开发

发酵产乙醇、丙酮、水杨酸等化工产品。

4）微生物与环境保护

微生物修复:重金属、降解塑胶废品、净化污水、监测环境污染等。

5）微生物与人类健康

生物制品：菌苗、疫苗、类毒素等；

代谢产物：胰岛素、白细胞介素、干扰素、链激酶及青霉素等抗生素。

2、微生物有害方面

1）人类疾病

1347年，鼠疫造成欧洲约2500万人死亡。

2）动植物疾病，降低食物产量及品质

1843-1847年，欧洲马铃薯晚疫病，饿死100万人，164万逃往北美。

3）污染水源、加工食品、医药

完达山刺五加致死事件、太湖蓝藻污染等。

4）破坏人类生活用品

家具、化妆品等损害、污染

3样品采集的原则

1）根据检验目的、样品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。

2）采样、保存、运输、接收过程应遵循无菌操作程序，采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中原有微生物的种类、数量变化(避免采样引入新的污染或者对微生物的杀灭因子)。

3)采样要讲究方法、有代表性，不同的样品有不同的要求，特别是某些特殊样品。

4)注意采样时间和种类：一般原则是根据不同疾病的特点和临床表现，确定采样时间和标本种类。

5)注意生物安全：采样中避免造成人员感染、标本和环境的污染。采用防护装备，注意安全操作和安全包装样品。

6)样品的包装、密封标志要明确，以备查询。（用于卫生质量评价的样品，应标明样品名称、编号、采样时间、采样量、采样者、检测项目等。）

利用某一特定微生物特有的基因序列，设计特异性引物进行PCR扩增。若有条带，则说明待测样品中含有目的菌，且目的菌的含量与条带的亮度呈正相关；若无条带，则说明待测样品中无目的菌。微生物检验的任务

1）研究各类产品的样品采集、运送、保存以及预处理方法，提高检出率。

2）根据各类产品的卫生标准要求，选择适合不同产品、针对不同检测目标的最佳检测方法，探讨影响产品卫生质量的有关微生物的检测、鉴定程序以及相关质量控制措施；利用微生物检验技术，正确进行各类样品的检验。

3）正确进行影响产品卫生质量的有关微生物的快速检测方法、自动化仪器的使用，并认真进行检验结果的分析和试验方法的评价。

4）及时对检验结果进行统计、分析、处理，并及时准确地进行结果报告。

5）对影响产品卫生质量及人类健康的相关环境的微生物进行调查、分析与质量控制。微生物的特点：个体小、比表面大；分布广、种类多；代谢强、繁殖快；易变异、抗性强 7 科赫法则:①分离、纯化单菌落;②分别接种寄主;③从致病寄主分离出相应菌株 8 微生物检测的意义

1）衡量动植物性产品卫生质量的重要指标，也是判定被检产品能否食用的科学依据。

2）可以判断产品加工环境卫生状况，对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项

卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。

3）“预防为主”：可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身

体健康。

4）对提高产品质量、避免经济损失、保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。*微生物检测与植物检疫

植物检疫目的：发现、检出和鉴定有害微生物、昆虫、杂草等，作为出证或检疫处理的依据。外来有害生物爆发的因素：天敌、环境、寄主、潜在危害的认识（人为因素）。

关系：植物检疫的一部分，主要负责检测引起植物病害的微生物，防治病原物的进入或流出，保证农林园艺业安全。

设计题

病原微生物采集、分离、鉴定方案

第四篇：PCR技术在微生物鉴定中的应用

昆虫分子生物学

课程论文

学

院: 课

程: 学

号:

姓

名:

植物保护学院

昆虫分子生物学

任课教师:

职称:

教授

成 绩:

2015年8月29日

PCR技术在微生物鉴定中的应用

摘要 随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，特别是在微生物检测中的应用。细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，从鉴定的准确率来看，其具有的优势毋庸置疑。同时，随着微生物检测技术的不断发展,BOX-PCR技术在微生物的多样性研究中也已得到应用。使用真菌ITS区域序列通用引物PCR扩增和DNA序列测定的方法，简便快速、成本低稳定性好、结果可靠，适合实验室常规使用，可用于常见的和疑难真菌菌种快速鉴定。

关键词 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；细菌；真菌

PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成扩增特定DNA片段的方法，1985年美国Karray等学者首创了PCR技术并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖、环境科学、食品安全等领域，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库、遗传病传染病的诊断、法医学鉴定、物种起源、生物进化分析、流行病学调查等。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR（mutiplex，PCR）技术[4]、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技术[5]、单分子PCR技术[6]等。PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列，人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸，引物在体外将待检DNA序列模板在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’~3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后合成了新链可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中扩增产物的量，以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR技术在细菌鉴定中的应用

细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中

第五篇：免疫学检测技术在食品安全中的应用

免疫学检测技术在食品安全中的应用

杨明

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

食品安全问题在21世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题，对国家的经济发展和消费者的身体健康产生了重大影响。随着我国市场经济的的不断完善和发展，食品行业对外贸易与日剧增，食品的质量与安全问题已成为影响农业和食品工业产品竞争力的关键因素。同时，由于我国人民生活已由温饱型食物结构转向营业健康型食物结构，全民食品营业卫生知识得到普及。人民的饮食消费观念也由数量型转向质量型，对食品卫生质量标准的要求越练越高，这就对食品检测技术提出更高的要求。

由于食品种类丰富，食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多，需要检测的物质质量极低，样品中待检物的浓度常为μg、ng甚至 pg级，除此之外，许多检测物除需检测物质本身，还涉及其衍生物和降解物测定。区别同位异构体以及元素的价态等。因此食品检测要求检测方法更加准确、快速、方便，也使得其他学科的先进技术不断应用于食品检测领域中来，由于新技术的引入，食品行业开发出了许多自动化程度和精确度很高的检测仪器，这不仅缩短了分析时间，减少了人力误差，也大大提高了食品分析检测的速度、灵敏度和准确度。现代食品检测技术主要包括以下几个方面：①计算机视觉技术；②现代仪器分析技术；③食品物性的力学、声学和电学检测技术；④电子传感检测技术；⑤生物传感技术；⑥核酸探针检测技术；⑦PCR基因扩增技术；⑧免疫学检测技术。

免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分，特别是三大免疫技术——荧光免疫技术、酶免疫技术、放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。

免疫分析是抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础的分析技术。1959年，Yalow和Berson 将发射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法，从而开创了免疫分析这一崭新领域，次后又发展了许多替代或非同位素免疫免疫分析法。

1．免疫荧光技术在食品检测中的应用

免疫荧光分析（Immuno Fluorescence Assay , IFA）始创于20世纪40年代初，1942年Cons等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体，但此种荧光素标记物的性能较差，未能推广应用，20世纪50年代，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等对荧光抗体的标记方法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推广应用。1．1 基本原理

抗体与荧光素结合后，并不影响其与相应的抗原发生特异性反应，事先将待测抗原固定与玻璃载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应的抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，载荧光显微镜下可观察到荧光，否则荧光抗体被缓冲液冲掉，在显微镜下观察不到荧光。1．2 荧光免疫测定法的分类

根据标记荧光产生的方式不同分为底物标记荧光测定法、荧光偏振免疫测定法、荧光猝灭增强免疫测定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA应用较多。

1．2．1 底物标记荧光测定法

底物标记荧光测定法（SLFIA）使用一种酶的底物标记待测物，底物本身无荧光，在受到相应酶的催化时能转变为荧光物，当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间的接触，样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加。1．2．2荧光偏振免疫测定法

使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向各向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光（ploarized fluorescence）在反应液中，游离的标记物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散，不能产生偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记物分子体积增大，布朗运动速度减慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光，样品中的待测物的量越大，偏振荧光的强度越高。

1．2．3 荧光淬灭免疫测定法

荧光淬灭免疫测定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是当荧光标记物与抗体结合后发生荧光淬灭。荧光猝灭的机制尚不清楚，荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致电子振动状态的改变有关。1．2．4荧光增强免疫测定法

荧光增强免疫测定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理与荧光淬灭增强免疫测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。酶免疫检测技术在食品检测中的应用

酶免疫检测技术是在20世纪60年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术，最初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定和定位。随后发展为用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上的沉淀线，到1971年，Engrall等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），这一技术因其高度的准确性、特异性、应用范围广、检测速度快以及费用低等优点，是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。2．1 酶免疫技术的基本原理

用酶标记已知的抗原（抗体），然后与样品在一定条件下反应，如果样品中含有相应的抗体（抗原），抗原抗体结合形成复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以定性定量测定样品中的抗体（抗原）。2．2 酶免疫技术的分类

酶免疫技术发展迅猛，种类繁多，酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术，酶免疫测定技术又分为均相免疫测定和异相免疫测定技术，异相免疫测定技术又分为固相免疫测定技术和液相免疫测定技术。2．3 酶联免疫吸附测定技术 2．3．1 基本原理

抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合，将待测样品事先包被于固相载体表面，加入酶标抗体（抗原），酶将抗体（抗原）于吸附于固相载体上相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液冲掉，当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈颜色变化，颜色深浅与待测抗原或抗体的量有关，可定性或定量测定抗原或抗体。ELISA常用的方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法。2．3．2 ELISA技术在食品安全性检测中的应用及前景

ELISA技术把抗原抗体特异性与酶反应的敏感性相结合，使食品在未经分离的提取的情况下，即可进行定性和定量分析。近年来，该技术在食品安全检测中正逐步推广应用，用于细菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生虫的检测。还用于蛋白质、激素、农业残留、兽药残留和抗生素及食品成分和劣质食品的检测分析。ELISA技术由于灵敏度高、特异性强、检测费用低和易于商品化，具有十分广阔的应用前景。

3．放射免疫技术在食品检测中的应用

放射免疫技术（Radio Immunoassay ,RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法灵敏度高，测定准确性良好，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。3．1 基本原理

放射免疫分析的基本原理是标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争结合反应。在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，抗体量一般采用能结合40％-50%的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的，根据标本中抗原的量不同，得到不同的反应结果。当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时在于一个反应系统时，由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，因此两者相互竞争特异性的抗体，由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应的结合较多的抗体，从而抑制了标记抗原对抗体的结合，是标记抗原抗体复合物的量相应减少，游离的标记抗原相应的增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。若将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开，分别测定其放射强度，就可计算出结合的标记抗原（B）与游离的标记抗原（F）的比值（B/F），这与标本中的抗原呈函数关系。用一系列不同的标准抗原进行测定，计算相应的B/F值，可得到一条剂量反应曲线，受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线是查出标本中的抗原含量。放射免疫测定 分为液相放射免疫测定和固相放射免疫测定。3．2 放射免疫技术在食品检测中的应用

RIA测定就是应用放射性物质代替ELISA中的标记酶作为抗原或抗体耦联物，在食品安全检测中最常见的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技术的基础上发展了放射免疫检测技术（RRA），放射免疫检测在快速检测方面最成功的是CharmⅡ6600/7600抗生素快速检测系统，该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。目前，CharmⅡ7600检测系统就β－内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA认可。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，对水产品、肉类产品、果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。还可检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫及小分子物质和大分子物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。

4．免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用

免疫胶体金检测技术又叫Rosa.Tests法，是利用胶体金颗粒进行标记的一项新技术。4．1基本原理

氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程，吸附机理可能是胶体金颗粒表面带有负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而行形成牢固结合，用已知还原法可以方便地从HAuCl4制备各种不同的粒径，不同颜色的胶体金颗粒，这种球形的颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共价结合。

免疫胶体金检测原理是利用了金颗粒具有电子密度的特性，当这些标记物在相应配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点。因而可用于定性或定量的快速检测方法中。这一方法可通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。4．2 免疫胶体金技术在食品检测中的应用

该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素，可在十分钟内快速检测牛奶中的抗生素，利用该技术可检测的抗生素种类有六种，β－内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素，可检测的β－内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素头孢噻呋、头孢霉素和青霉素G等。由于该技术结果直观、操作简单，在食品安全检测中有广阔的应用前景。单克隆抗体技术在食品检测中的应用

抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因，如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群，即克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体。1975年，Kohler和 Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成了杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创 立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术为医学和生物学基础研究开创了新纪元，是免疫学领域的重大突破。5．1 基本原理

B淋巴细胞具有专一性的合成针对某一抗原决定簇的抗体，但这种B淋巴细胞不能在体外生长，而骨髓瘤细胞可在体外生长，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞即杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞即具有专一性合成某一抗体的特性，也具有瘤细胞能在体外无限增殖的特性，用这种杂交瘤细胞培养的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异性单克隆抗体，这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体称为第二抗体，主要抗原能引起小鼠的抗体应答，应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体。5．2 单克隆抗体技术在食品检测中的应用

单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强，不易出现假阳性。在食品检测中有广泛的应用前景。目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、激素等的单克隆抗体并建立的检测方法。

磺胺二甲嘧啶和克伦特罗（瘦肉精）这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点，国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。这两种试剂盒具有特异性强、仪器化程度低、样品前处理简单、检测时间短，在实际生产中应用前景广阔，填补了国内空白。

单克隆抗体检测技术可在十分钟内快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及激素类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持。

英国建立了自动肉制品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方法，人们还制出了单核增生性李特氏杆菌的单抗，用单抗ELISA检测该菌。乳中氯霉素的单克隆抗体检测技术也被建立。

食品储藏过程中会受到霉菌污染，现已从青霉、毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆抗体用ELISA方法可检出加热和未加热食品中的霉菌。免疫测定新技术

6．1 脂质体免疫测定法

脂质体免疫测定法（LIA）是一种较新的免疫测定技术，脂质体是由磷脂或由其他类脂分子在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多层囊泡，脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子。这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其中的溶质（染料或酶），膜的稳定性可随免疫反应有规律变化。根据释放出的标记物的量进行测定，所以LIA具有很高的信号放大作用。目前LIA主要存在脂质体的稳定性和非特异性溶解问题。6．2 克隆酶给予体免疫测定法

克隆酶给予体免疫测定法（CEDIA）是一种新型均相免疫测定法。CEDIA中使用由重组DNA技术获得的半乳糖苷酶两个独立的蛋白质片段，这两个片段独立存在时无酶活性，但两个片段结合则显示催化活性。以此作为分析方法的基础。其中较小片段称为酶给予体片段（ED），另一片段称为酶受体片段（EA）。ED标记物与抗体集合后不再与EA形成酶，所以当样品中待测物增 加时则游离ED标记物增多，使反应液中酶产生增加，经底物显色测定。CEDIA是目前灵敏度较高的均相免疫测定法。6．3 发光免疫测定法

发光免疫测定法（CLIA）常用鲁米诺（Luminol）、异鲁米诺（Isoluminol）及其衍生物进行标记。这些环肼类化合物在碱性条件下可被氧化产生3-胺基苯二甲酸盐和430nm的发射光。在鲁米诺的芳氨基上进行烃链取代后产光性能增强，但若置换芳氨基则发光被破坏。另外丫叮酯也用于发光标记。CLIA操作简单、灵敏度高、测定速度快。但CLIA产光物质发光时间极短（数秒钟），测定误差较大。6．4免疫传感器技术

免疫传感器是生物传感器的一种，近年来已取得迅速发展。免疫传感器的探头主要由两部分组成；感受器：通常覆有连接有特异性抗体的可更换的传感膜；换能器：能将抗原抗体产生的信号转换为可供仪器检测的电信号。免疫传感器使用对象广泛，专一性较强，高度的自动化，微型化与集成化减少对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外操作。6．5 多组分免疫测定法

根据不同检测物标记方法互不相同，分析条件和检测信号互不干扰。同一反应液中同时检测不同的检测物。但这种方法必须使几种标记物的测定条件相互协调，其灵敏度和组分数受到限制。

免疫反应最大的特点是高度选择性，抗原抗体的亲和数通常为109或更高。作为一种分析手段，免疫分析技术操作简单、速度快、分析成本低，在食品安全检测中已表现出巨大的应用潜力。此外免疫分析技术能与其他技术联用，在联用方法中免疫技术即可作为高效液相色谱（HPLC）或气相色谱法（GC）等测定技术的样品进化或分离手段，也可作为其离线或在线检测方法。这些方法结合了免疫分析的选择性，灵敏性与HPLC，GC等技术的高速，高效分离和准确检测能力，使分析过程简化，分析成本下降，拓展了待测物范围。

免疫分析测定法提供的待测物组分或结构方面的信息太少，一般不具备多残留分析能力；免疫分析过程复杂，影响因素众多，且不易控制，结果易于出现假阳性，方法难以标准化；方法建立过程复杂，研究周期长，某些待测物半抗原难以合成。免疫测定法不可能取代色谱或光谱等常规分析方法，只能作为其重要补充。

参考文献

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