第一篇：分子生物学课程教学讲义 朱玉贤
分子生物学课程教学讲义 朱玉贤
第一讲 序论
二、现代分子生物学中的主要里程碑
分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动 地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这 些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。
从1847年Schleiden和Schwann提出“细胞学说”，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对 生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将“性状”与 “基因”相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化 学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析 的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了 这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。1910年，德国科学家Kossel第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。
1959年，美国科学家Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA翻译成蛋白质的过程。同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中DNA的复制。
1962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。
1965年，法国科学家Jacob和Monod提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代谢的分子机制。此外，他们还首次推测存在一种与DNA序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白质的mRNA（信使核糖核酸）。
1972年，Paul Berg（美）第一次进行了DNA重组。
1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次进行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并发现了可移动遗传因子（jumping gene或称mobile element）而获得Nobel奖。
1993年，美国科学家Roberts和Sharp因发现断裂基因（introns）而获得Nobel奖。Mullis由于发明PCR仪而与加拿大学者Smith（第一个设计基因定点突变）共享Nobel化学奖。
此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人关于致病力强的光滑型（S型）肺炎链球菌DNA导致致病力弱的粗糙型（R型）细菌发生遗 传转化的实验；Hershey和Chase（1952）关于DNA是遗传物质的实验；Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）: Meselson和Stahl（1958）关于DNA半保留复制的实验以及Yanofsky和Brener（1961）年关于遗传密码三联子的设想都为分 子生物学的发展做出了重大贡献。
我国生物科学家吴宪20世纪20年代初回国后在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影 响的研究，成为我国生物化学界的先驱。20世纪60年代、70年代和80年代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二 锌猪胰岛素的晶体结构，采用有机合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能等方面都有 世所瞩目的建树。
三、分子生物学的主要研究内容
所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相 同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸、DNA及RNA中的8种碱基所组合而成的，由此产生了分子生物学的3条基本原理: 1.构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的； 2.生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则； 3.某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。分子生物学研究内容: DNA重组技术------基因工程 基因表达调控-------核酸生物学
生物大分子结构功能----结构分子生物学 DNA重组技术（又称基因工程）
这是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时 复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造 的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与 应用则是这一技术得以建立的关键。DNA重组技术有着广阔的应用前景
NA 重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从 DNA到RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆及分 析，都离不开重组DNA技术的应用。
基因表达调控研究
因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所 以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以 修正（环境调控）。
原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻 译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传 导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。
转录因子是一群能与基因5'端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
真核基因在结构上的不连续性是近10年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之 外，还要将隔开各个相邻编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟mRNA。研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的 细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含子，因此生成不同的mRNA及蛋白质分子。
结构分子生物学
生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互 关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液 相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。
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第二讲 染色体与DNA
一、DNA的组成与结构
Avery在1944年的研究报告中写道:“当溶液中酒精的体积达到9/10时，有纤维状物质析出。如稍加搅拌，它就会象棉线在线轴上一样绕在硬棒上，溶 液中的其它成份则呈颗粒状沉淀。溶解纤维状物质并重复数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初步实验证实，它很可能就是DNA（谁能想 到！）”。对DNA分子的物理化学研究导致了现代生物学翻天覆地的革命，这更是Avery所没有想到。
所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA 中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结 构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是:
1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。
3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子 的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多 核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。
二、DNA聚合酶与DNA的合成
The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意义及成分分析
早在1928年英国科学家Griffith等人就发现肺炎链球菌使小鼠残废的原因是引起肺炎。细菌的毒性（致病力）是由细胞表面荚膜中的多糖所决定的。具 有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表的R型因为没有荚膜多糖而失去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞攻 击）。
首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。Avery等人将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细 菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细 菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。解剖死鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分棗转化源（transforming principle）将无致病力的细菌转化成病原细菌。
美国冷泉港卡内基遗传学实验室科学家Hershey和他的学生Chase在1952年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌体内。它的头、尾外 部都有由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5个步骤:1噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面；2噬菌体 通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白质外壳则留在细胞外面；3噬菌体的DNA一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成噬菌体自身的 DNA和蛋白质；④新合成的DNA和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子噬菌体；⑤子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细 菌。他们发现被感染的细菌中带有70%的噬菌体DNA，但只带有20%的噬菌体蛋白质。子代噬菌体中带有50%标记的DNA，却只有1%的标记蛋白质。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色体结构
DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因 组）。如果设想将人体细胞中的DNA分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占1－5厘米，而一个2－3kb的基因只相当于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段！
Genotype(基因型): The genetic constitution of a given organism(指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质)。
Phenotype(表现型): Visible property of any given organism(某个特定生物体中可观察到的物理或生理现象)。
Mutations: 染色体DNA中可遗传的核苷酸序列变化。
六、染色体的组成1.染色质和核小体
染色质DNA的Tm值比自由DNA高，说明在染色质中DNA极可能与蛋白质分子相互作用；在染色质状态下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA复制 和转录活性大大低于在自由DNA中的反应；DNA酶I（DNaseI）对染色质DNA的消化远远慢于对纯DNA的作用。染色质的电子显微镜图显示出由核小 体组成的念珠状结构，可以看到由一条细丝连接着的一连串直径为10nm的球状体。
核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。每个核小体只有一个H1。在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成1/7，200bpDNA的长度约为68nm，却被压缩在10nm的核小体中。但是，人中期染色 体中含3.3×109碱基对，其理论长度应是180cm，这么长的DNA被包含在46个51μm长的圆柱体（染色体）中，其压缩比约为104。
2.染色体中的核酸组成
⑴不重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%－80%。不重复序列长约750－2000dp，相当于一个结构基因的长度。单拷贝基因通过基因扩增仍可合成大量的蛋白质，如一个蚕丝心蛋白基因可作为模板合成104个丝心蛋白mRNA，每个mRNA可存活4d，共合成105个丝 心蛋白，这样，在几天之内，一个单拷贝丝心蛋白基因就可以合成109个丝心蛋白分子。
⑵中度重复序列 这类重复序列的重复次数在10－104之间，占总DNA的10%－40%。各种rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。
非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些单位在DNA链上串联重复约5000次。在卵细胞形成过程中 这些基因可进行几千次不同比例的复制，产生2×106个拷贝，使rDNA占卵细胞DNA的75%，从而使该细胞能积累1012个核糖体。
⑶高度重复序列——卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%—60%，由6—100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基的组成不同，在CsCl密度 梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。
高等真核生物DNA无论从结构还是功能看都极为复杂，以小鼠为例: 1.小鼠总DNA的10％是小于10bp的高度重复序列，重复数十万到上百万次/genome。
2.总DNA的20％是重复数千次、长约数百bp的中等重复序列。
3.总DNA的70％是不重复或低重复序列,绝大部分功能基因都位于这类序列中。
Centromere:是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point），这种结合对于染色体对在子细胞中的有序和平均分配至关重要。在酵母中，centromere的功能单位长约130 bp，富含AT 碱基对。在高等真核细胞中，centromere都是由长约5－10 bp、方向相同的高度重复序列所组成。
Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精确重复序列所组成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n
其中X、Y一般为1－4，单细胞真核生物中n常为20－100，高等真核生物中>1500。染色体末端的线性重复序列不能被DNA polymarase 所准确复制，它们一般在DNA复制完成以后由telomarase合成后加到染色体末端。
Alu（长约300bp）是人类高度重复序列,因为该序列中带有AluI的识别序列而得名。数十万个Alu重复序列散布于整个人类基因组中，达到总序列的1－3％。Alu与其它高度重复序列共占人类DNA的10％以上。
3.染色体中的蛋白质
染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。通常可以用2mol/L NaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4处理使组蛋白与DNA分开。组蛋白分为H1、H2A、H2B、H3及H4。这些组蛋白都含有大量的赖氨 酸和精氨酸，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含赖氨酸；H2A、H2B介于两者之间。⑴组蛋白的一般特性
进化上的极端保守性。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列与豌豆序列相比只有两个氨基酸的差异（豌豆H4中的异亮氨基酸60→缬氨酸60，精氨酸→赖氨酸）。H3的保守性也很大，鲤鱼与小牛胸腺的H3只差一个氨基酸，小牛胸腺与豌豆H3只差4个氨基酸。
无组织特异性。到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。
肽链上氨基酸分布的不对称性。碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上。例如，N端的半条链上净电荷为+16，C端只有+3，大部分疏水基团都分布在C端。
组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。
⑵非组蛋白的一般特性
染色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。非组蛋白的组织专一性和种属专一性。
(3)几类常见的非组蛋白
a.HMG蛋白（high mobility group protein）。这是一类能用低盐（0.35mol/L NaCl）溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相对分子质量较低的非组蛋白，相对分子质量都在3.0×104以下。b.DNA结合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部组蛋白和70%非组蛋白后，还有一部分蛋白必须用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能与DNA解离。这些蛋白分子量较低，约占非组蛋白的20%，染色质的8%。
七.原核与真核染色体DNA比较
原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因〔如rRNA基因〕是以多拷贝形式存在；
整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；
几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。
Viral DNA molecules are relatively small HIV = 9000 nt RNA Qβ = 4200 nt
Bactaria DNA is 100 times > than viral E.coli 4639221 bp double-stranded Contour length = 1.7mm, 850倍细菌本身长度。细菌中常常带有质粒DNA。Eucaryotic cells 果蝇带有25倍于E.Coli 的DNA,人类带有600倍于E.Coli 的DNA.Eucaryotic DNA 中基因密度明显低于原核和病毒。如人DNA中平均每毫米只带有50个基因,而E.Coli中基因密度每毫米DNA带有2400个基因！一个人细胞中所带有的DNA约有2m/1.7mm细菌。成人带有1X10^14个细胞，成人体内全部 DNA的总长度（Contour Length）＝ 2X10^11Km第三讲 蛋白质合成
一.基因与基因表达的一般概念
基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成mRNA，翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。
编码链（coding strand）又称sense strand，是指与mRNA序列相同的那条链。非编码链（anticoding strand），又称antisense strand，是指那条根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链。Genetic information is perpetuated by replication（复制）in which a double-stranded nucleic acid is duplicated to give identical copies.基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之 外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是 基因表达的最终目的。
只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。所谓翻 译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。
二.遗传密码——三联子
mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为一个密码，也叫三联子密码。翻译时从起始密码子AUG开始，沿mRNA5’→3’的方向连续阅读直到终止密码子，生成一条具有特定序列的多肽链。
mRNA中只有4种核苷酸，而蛋白质中有20种氨基酸，若以一种核苷酸代表一种氨基酸，只能代表4种(41=4)。若以两种核苷酸作为一个密码（二联 子），能代表42=16种氨基酸。而假定以3个核苷酸代表一个氨基酸，则可以有43=64种密码，满足了编码20种氨基酸的需要。
50-60年代破译遗传密码方面的三项重要成果:（1）Paul Zamecnik等人证实细胞中蛋白质合成的场所。他们把放射性标记的氨基酸注射到大鼠体内，经过一段时间后收获其肝脏，进行蔗糖梯度沉淀并分析各种细胞成份中的放射性蛋白质。
如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质;如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。
（2）Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验2: 研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。
1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽，5'„UGU GUG UGU GUG UGU GUG„3',不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。实验5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式: 5’„UUC UUC UUC UUC UUC„3’或 5’„UCU UCU UCU UCU UCU„3’或 5'„CUU CUU CUU CUU CUU„3'分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽:5’„GUA GUA GUA GUA GUA„3’或5’„UAG UAG UAG UAG UAG„3’
或5’„AGU AGU AGU AGU AGU„3’由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时 可出现8种三联子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨 基酸组成的多肽。
（3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。
如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。
以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相 对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。
4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以 上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。
三.密码子和反密码子的相互作用
蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上同源密码子的配对问题。Wobble hypothesis 1 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。3 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。
④ 根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻译61个密码子。
四.tRNA tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体 上提供了载体。所有的tRNA都能够与核糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子:反密码子的配对与mRNA相结 合，而其3’末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于 相同的氨基酰-tRNA合成酶。
1、tRNA的三叶草型二级结构
受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或 2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于 套索中央的三联反密码子命名的。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95个核苷酸不等，tRNA分子长度的不同主要是由其 中的两条手臂引起的。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是 在反密码子3'端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。2.tRNA的L形三级结构
酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA的三级结构与AA-tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TφC臂的杆状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。
tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能，因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以两个不同的功能基团最大限度分离。3.tRNA的功能
转录过程是信息从一种核酸分子（DNA）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。
4.tRNA的种类
（1）起始tRNA和延伸tRNA 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA 校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。
五.AA-tRNA合成酶 是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下: 它实际上包括两步反应: 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基转移到tRNA 3’末端腺苷残基上，与其2’或3’-羟基结合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP 蛋白质合成的真实性主要决定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸与对应的tRNA相结合。AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。不同的 tRNA有不同碱基组成和空间结构，容易被tRNA合成酶所识别，困难的是这些酶如何识别结构上非常相似的氨基酸。有两道关口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体 和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。
1.核糖体的组成
原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1„„S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1„„L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。
2、rRNA 3.核糖体的功能
核糖体包括至少5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合 位点。小亚基上拥有mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及tRNA携带的功 能，如肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。
核糖体可解离为亚基或结合成70S/80S颗粒。翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成70S/80S颗粒，继续翻译进程。体外反应体系中，核糖体 的解离或结合取决于Mg2+离子浓度。在大肠杆菌内，Mg2+浓度在10-3mol/L以下时，70S解离为亚基，浓度达10-2mol/L时则形成稳定 的70S颗粒。细胞中大多数核糖体处于非活性的稳定状态，单独存在，只有少数与mRNA一起形成多聚核糖体。它从mRNA的5'末端向3'末端阅读密码 子，至终止子时合成一条完整的多肽链。mRNA上核糖体的多少视mRNA的长短而定，一般40个核苷酸有一个核糖体。
七.信使核糖核酸
mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.虽然mRNA在所有细胞内执行着相同的功能，即通过三联子密码翻译生成蛋白质，其生物合成的具体过程和成熟mRNA的结构在原核和真核生物细胞内是不同的。
八、蛋白质的生物合成
核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。此外，有20种以上的AA-tRNA及合成酶、10多种起 始因子、延伸因子及终止因子，30多种tRNA及各种rRNA、mRNA和100种以上翻译后加工酶参与蛋白质合成和加工过程。蛋白质合成消耗了细胞中90%左右用于生物合成反应的能量。细菌细胞中的2万个核糖体，10万个蛋白质因子和20万个tRNAs 约占大肠杆菌干重的35%。在大肠杆菌中合成一个100个氨基酸的多肽只需5分钟。
1.蛋白质生物合成的主要步骤: 翻译的起始——核糖体与mRNA结合并与氨基酰-tRNA生成起始复合物。肽链的延伸——核糖体沿mRNA5’端向3’端移动，导致从N端向C端的多肽合成。肽链的终止以及肽链的释放——核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。主要分为五步
1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽链延伸分为三步 Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.2 Peptide bond formation.3 Translocation.2.与蛋白质合成有关的因子
起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）终止因子。原核中有RF1-3。RF-1 识别 UAA和UAG;RF-2 识别 UAA和UGA;RF-3 仅能促进RF-1和RF-2的功能。终止因子行使功能时需要GTP。真核生物中只有一个RF，能识别3个终止子。
3、蛋白质合成的起始 蛋白质合成的起始复合物: 30S 核糖体小亚基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖体大亚基 Mg2+ 合成的起始可分为三步: 1、30S 核糖体小亚基与起始因子IF –1和IF-3相结合，诱发模板mRNA与小亚基结合。
2、由30S 小亚基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所组成的复合物立即与GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相结合。反密码子与密码子配对。
3、上述六组分复合物再与50S大亚基结合，水解GTP生成并释放GDP和Pi。释放三个起始因子。
表27-9 真核细胞中参与翻译起始的蛋白质因子及其功能
真核因子 功能
eIF2 促进Met-tRNAMet与核糖体40S小亚基结合。eIF2B eIF3 是最早与核糖体40S小亚基结合的促进因子，蛋白质合成反应的正常进行。eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次级结构并使之与40S小亚基结合，形成eIF4F复合物。
eIF4B 与mRNA模板相结合，协助核糖体扫描模板序列，定位AUG。eIF4E 与mRNA 5'的帽子结构相结合，形成eIF4F复合物。
eIF4G 与eIF4E和poly（A）结合蛋白（PAB）相结合，形成eIF4F复合物。eIF5 促使多个蛋白因子与40S小亚基解体，以此帮助大小亚基结合形成80核糖体，形成翻译起始复合物。
eIF6 促进没有蛋白质合成活性的80S核糖体解离成40S和60S两个亚基。
4、肽链的延伸
肽链延伸的基本要求是 : 有完整的起始复合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。
肽链延伸也可被分为三步: 第一步，与新进来的氨基酰-tRNA相结合。氨基酰-tRNA首先必须与GTP-EF-Tu复合物相结合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu复合物并与70S中的A位点相结合。此时，GTP水解并释放GDP-EF-Tu复合物。
第二步，肽键形成。肽键形成之初，两个氨基酸仍然分别与各自的tRNA相结合，仍然分别位于A位点和P位点上。A位点上的氨基酸（第二个氨基酸）中的α-氨基作为亲核基团取 代了P位点上的tRNA，并与起始氨基酸中的COOH基团形成肽键。本反应可能由peptidyl transferase 催化。
第三步，移位（translocation）。核糖体向mRNA的3’方向移动一个密码子，使得带有第二个氨基酸（现已成为二肽）的tRNA从A位进入P位，并使第一个tRNA从P位进入E位。此时模 板上的第三个密码子正好在A位上。核糖体的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。
5、肽链的终止
当终止密码子进入核糖体A位点时，在释放因子RF1-3的作用下:（1）水解末端肽基tRNA；（2）释放新生肽和tRNA；
（3）使70S核糖体解离成30S和50S两个亚基。
6、蛋白质合成的抑制剂
抗菌素对蛋白质合成的作用可能是阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素），或阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素类），或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卡那霉素等），或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。链霉素是一种碱性三糖，干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，并导致mRNA的错读。若以poly（U）作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会掺入。对链霉素敏感位点在30S亚基上。
嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，能结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入。它所带的氨基与AA-tRNA上的氨基一样，能与生长中肽链上的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条3'羧基端挂了一嘌呤霉素。
青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真 核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。因此，前3种抗生素被广泛用于人类医学，后两种则很少在医学上使用
第四讲 DNA、RNA和蛋白质代谢
DNA是贮藏遗传信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控 制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。贮藏在任何基因中的生物信息都必须首先被转录生成RNA，才能够得到表达。DNA和RNA虽然很相似，只 有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂；RNA既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。
蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。
一、核苷酸的合成与代谢
核苷酸是DNA和RNA的前体是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代谢中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP还是第二信使。
1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate）
这一途径的第一步是由谷氨酰胺捐献一个氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。
其次，把甘氨酸中的三个基团加到PRA上。第三，由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。第四，谷氨酰胺提供另一个N。第五，脱水环化形成咪唑环。第六，羧基化
第七，通过分子重排将羧基从咪唑第4碳的环外氨基上转移到第5位碳原子上。第八-九，由天门冬酰胺把另一个氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。第十一，脱水环化，形成嘌呤IMP。
参与合成AMP的是1腺苷琥珀酸合成酶和2腺苷琥珀酸裂解酶。参与合成GMP的是3IMP脱氢酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺转移酶。
2.嘌呤核苷酸合成中的反馈调节
3.嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的
嘧啶从头合成途径不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶环首先被合成，然后才与核糖-5-磷酸相连。这个反应需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4.核苷单磷酸转化为核苷三磷酸
反应生成的ADP可通过糖酵解酶或氧化磷酸化途径被进一步磷酸化。ATP能够把磷酸基团加到其它所有核苷单磷酸上生成核苷三磷酸。
核苷二磷酸可通过一个公用的核苷二磷酸激酶被进一步磷酸化生成核苷三磷酸。
5.核糖核苷酸（ribonucleotides）是脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前体。所有dNTP都直接来自于 NTP（其实是NDP）。这个反应很特殊，因为核糖上的还原反应发生于一个没有活化的碳原子上。催化该反应的酶是核糖核苷酸还原酶。大肠杆菌核苷酸还原酶有两大特征，它的生物学活性和底物特异性同时受效应子（effector molecules）的影响。每个R1亚基上都有两个调节位点，当影响整体酶活性的那个位点与ATP相结合时，酶活性增加；而当它与dATP结合时，酶活性消失。第二个调节位点控制了底物特异性。当dATP与该位点相结合时，UDP和CDP的还原反应优先进行。当dTTP与该位点相结合时，GDP的还原反应优先进行。核糖核苷酸还原反应的主要过程 1.还原酶R2亚基处于氧化态-X˙，向核糖3'位碳原子上的H发起攻击，生成3'位自由基。2.R1亚基上的-SH基团为2'-OH提供一个H原子，使之生成-OH2基团。3.脱水后，3'位自由基帮助维持2'位O+基团。
4.R1亚基上的另一个-SH基团为2'-CH+提供一个H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亚基上的X-H发起攻击。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）来自于dCDP和dUMP，其直接前体是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）将dUMP转化为dTMP；反应中的甲基来自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。
7、嘌呤和嘧啶降解后分别生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解
第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基团，由Adenosine-monophosphate变成Adenosine，或从GMP变成Guanosine。
二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine；
三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine；
四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine；
五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代谢突变会引起重要疾病。
如人体内缺失adenosine deaminase，会引发严重的免疫缺失性疾病，因为此时T-淋巴和B-淋巴细胞不能正常发育。AD缺失后，细胞内dATP的含量将高达正常细胞中的 100倍，而过量的dATP则抑制了其余dNTP在T-淋巴细胞中的合成。许多化疗（chemotherapy）药剂都针对核苷酸合成途径。如 Azaserine和Acivicin都是Glutamine类似物，被用于阻断核苷酸的生物合成。
胸苷合成中的主要抑制剂有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基叶酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是 thymidylate synthase 抑制剂，但它在细胞中被转化为FdUMP以后，就能直接与TS相结合并使之失活。氨甲基叶酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制剂，氨甲基叶酸与该酶的亲和力比底物dihydrofolate高100倍。
二、氨基酸代谢
按所占的质量比例计算，N在生物体内的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有机氮，被结合于氨基酸或核苷酸分子中。
地球上的动植物共含氮约1.5×1010t，而每年通过硝化细菌以气态氮的形式释放到大气中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥厂每年生产的化肥仅含氮约108t，所以，如果没有生物固氮，生命很快就不复存在了。
1.铵通过谷氨酸→谷氨酰胺被结合到有机物质中。主要有两步反应: ⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 总结: Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+
因此，谷氨酰胺合成酶是氮代谢中的主要调控位点。
在大肠杆菌中，GS由12个相同的亚基（50kDa）聚合而成，其活性既通过构象变化，也能通过共价修饰的方式得到调节。Alanine，Glycine 和其它至少6种gln代谢产物都是GS活性的变构抑制剂，每个抑制剂都只有部分抑制作用。除变构抑制之外，GS活性还受共价修饰调节。当第397位酪氨酸 被腺苷化后（加上AMP），该酶更容易受变构抑制剂的反馈调节。
2.氨基酸的生物合成
高等动物不能合成大约一半氨基酸，只能从食物中直接获取这些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人体必需氨基酸(*.哺乳期至幼儿期必需)表22-1 氨基酸合成的六条主要途径 3.氨基酸脱羧基化后生成有机胺。许多重要的神经递质都是胺或其次生代谢产物。Tyrosine降解产物有dopamine（多巴胺），epinephrine（肾上腺素），norepinephrine，统称为Catecholamines（儿茶酚胺）。
4.精氨酸降解产生NO˙(Nitric Oxide)。
本世纪80年代，科学家发现NO是人体内重要的信号分子，它参与神经传递、凝血和血压调控等一系列生理反应。虽然它是气体，极易扩散，但由于它十分活跃，其扩散半径一般只有1mm。
三、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰 1.蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（原核）或Met（真核）开始，多肽合成后，N端的formyl group、Met残基，有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中，N-端残基的氨基酸会被N-乙基化。
2.切除信号肽。许多蛋白质都带有15-30个残基的signal peptides，负责指导蛋白质在细胞中的精确定位。3.特定氨基酸的修饰。4.氨基酸的糖苷化
5.氨基酸的异戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白质还要与辅基(prosthetic groups)相结合； Cytochrome C只有与血红素（heme）相结合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常与Biotin分子相结合。有些蛋白质必须经蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白质只有在形成二硫键之后才有功能。
四、蛋白质的运输和降解
1、绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个Signal peptide。该序列常常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有三个特点:（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（Ala或Gly）。
研究发现，信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初，一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外，该序列（包括核糖体）就迅速与SRP（signal recognition particle）相结合，诱发SRP与GTP相结合，停止新生肽的进一步延伸（此时新生肽一般长约70个残基左右）。
受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引，这个复合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠拢，并通过peptide transport complex进入ER内腔。
5.Rough ER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体，再分别送到各个亚细胞位点。
6.蛋白质中的核定位序列一般不被切除。
蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin(α,β亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。
7、蛋白质降解是一个有序的过程。
在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。
在真核生物中，蛋白质的降解需要Ubiquitin，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr.1×106）。
成熟多肽N-端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响。
五、DNA代谢
无论是只含有一对染色体的原核细胞还是带有多对染色体的真核细胞，只有整个基因组得到了完整准确的复制，细胞分裂才能顺利发生。所以说，DNA复制的起始，标志了细胞进入一个新的周期。㈠、DNA复制
根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主 要包括复制起始位点（Origine of replication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。
大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNA replicase system或replisome。
Helicase，任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。
Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。Primases，为DNA复制提供RNA引物。
DNA polymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。
DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯键。1.DNA复制的起始
大肠杆菌中的复制起始位点是Ori C，全长245Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。
DNA复制起始中的主要步骤
a.大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合； b.识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构；
c.DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA gyrase时，DnaB的解链效率非常高。整个DNA复制过程中，只有复制起始受细胞周期的严格调控。“Once in each cell cycle。” DNA甲基化与DNA复制起始密切相关。OriC中有11个GATC回文结构（一般说来，256bp才应有一个GATC重复）。DNA子链被合成后，母链 立即被甲基化（称为hemimethylated）。此时，oriC与细胞原生质膜相结合。只有当oriC被从膜上释放出来，子链被Dam甲基化后，才能 有效地与DnaA蛋白结合，起始新一轮的DNA复制。复制起始可能还受ATP水解过程调控，因为DnaA只有与ATP相结合时才能与oriC区DNA相结 合。2.DNA子链的延伸
主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。
前导链的合成:由DnaG（primase）在复制起始位点附近合成一个10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到该引物上。
滞后链的合成:产生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。3.DNA链的终止
当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主 要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。4.真核细胞DNA的复制比大肠杆菌更复杂
真核生物的origin of replication被称为ARS-autonomously replicating sequences或者被称为replicators。Yeast replicators长约150dp，有多个保守重复区，共有约500个replicators分布于酵母的17条染色体中。
㈡、DNA的损伤修复
1.错配修复（mismatch Repair）
错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的错配几乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性。
2.碱基切除修复（Base-Excision Repair）
DNA gylcosylases能特异性识别常见的DNA损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为AP位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair）当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复。
4.DNA的直接修复（Direct repair）
㈢、DNA的转座
DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。已经发现“转座”这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点 上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。1.转座子的分类和结构特征 a.简单转座子
转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成 该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。
b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基 因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。
2、转座作用的机制
转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶 序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两 端总有5bp的靶序列。转座可被分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。3.转座作用的遗传学效应 转座引起插入突变;2 转座产生新的基因;3 转座产生的染色体畸变;④ 转座引起的生物进化.六、RNA代谢
除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都来自于DNA。基因组DNA通过一个被称为转录的过程把贮存在双链DNA分子中的遗传信息转换到与模板DNA链相互补的RNA单链上。
mRNA，编码了一个或多个蛋白质序列；tRNA，把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。1.依赖于DNA的RNA合成 从DNA合成反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存在三个主要不同点: A.转录中不需要RNA引物；
B.转录反应一般只用一小段DNA做模板；
C.在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。2.RNA合成的终止
一旦RNA聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板5'→3'方向不停地移动，合成RNA链，直到遇到终止信号时才释放新生的RNA链，并与模板DNA脱离。
研究RNA链终止时遇到最常见的问题是3'端核苷酸的定位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的RNA与一个经过剪接的RNA在3'端没有两样，都是-OH基团。模板DNA上都有终止转录的特殊信号--终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子，一个终止子。在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合 酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5'端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3'端部分出现不稳定的rU·dA区域。a.依赖于ρ因子的终止
ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。有人认为，在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5'→3'方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3'-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子具有终止转录和核苷三磷酸 酶两种功能。b、不依赖于ρ 因子的终止
若终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；在终止点前面有一段由4-8个A组成的序列，导致转录产物的3‘端为寡聚U。这两种结构特征的存在同样决定了转录的终止。
在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5'端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3'端部分出现不稳定的rU·dA区域。3.RNA聚合酶II及转录因子在启动子上的装配
TFⅡH还参与DNA的损伤修复。当RNA polⅡ转录过程中碰到受损伤的核苷酸时，TFⅡH能及时启动核苷酸切除修复系统，将损伤修复。Actinomycin D和Acridine阻断RNA链的延伸 4.RNA的加工成熟
所以，RNA加工成熟主要包括:5’加帽子结构；3’加多聚A；切除内含子。在Group I内含子切除体系中，鸟苷或鸟苷酸的3'-OH 作为亲核基团向Intron 5'的磷酸二酯键发起进攻。
Group II内含子切除体系
核内mRNA原始转录产物的剪辑方式可能是最常见的。在这一模式中，RNA的剪辑需要特异性RNA-protein-复合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已经发现至少有5种snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。第五讲 分子生物学研究法
一、重组DNA技术发展史上的重大事件
1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
3.50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。年份 事 件
1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。
1944 O.T.Avery证实DNA是遗传物质。
1952 A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。
1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。
1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。
1959-1960 S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。
1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。
1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。
1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
1983 获得第一例转基因植物。
1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。
1986 GMO首次在环境中释放。
1988 J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。
1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--“Oncomouse”。
1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。
1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。
1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
基因工程中常见的名词: 遗传工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重组DNA技术--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。基因工程的主要内容或步骤: 1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。
4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。
5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
二、基因操作的主要技术原理
1.核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。DNA的脉冲电泳技术 FGE-Pulse-field gel electrophoresis 2.核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤: 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。3.细菌的转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受 态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。4.DNA序列分析
a.Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下: 1DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；2该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC 和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。b.Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应: 碱基的特异性修饰；
被修饰的碱基从核糖环上转移；
失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。
专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特异性切割。
c.DNA序列分析自动化
用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。
d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)
如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本 原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种 探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链 体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶 DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。
SBH的应用: 1 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； 2 可用于不同DNA片段之间的序列比较； 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
5.基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。
a.盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
b.寡核苷酸引物诱变
应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。
C.PCRG与PCR诱变
6.利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。
b.DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）
主要步骤: 1 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； 2 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。
这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。
c.甲基化干扰试验(Methylation interference assay)
用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种 DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。
d.体内足迹试验
用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。
三、分子克隆技术
1、高质量mRNA的制备
应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2.反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP；
应保证所获得双链cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系统中所用的poly（dT）引物
因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA-mcrB-菌株。
3.分子克隆的主要方法
（1）构建cDNA、核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；（2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；（3）DD-RT-PCR法及差别显示技术；
（4）差别分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母双杂交体系Two-hybrid system；
（6）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移（genomic DNA Walking）。
习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过 程叫做分子克隆。
文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般 在细胞中只有10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到99%的期望值，大约需要筛选150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克cDNA可产生10万-60万个克隆子。
A.差式杂交或扣除杂交克隆技术 B.cRNA差式显示法
除了极少数特例(如组蛋白基因)之外，几乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。
P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有 12种不同的排列组合方式。
DDRT-PCR的主要步骤: Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA；
Ⅱ.用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带； Ⅳ.回收特异性差别条带；
Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；
Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带； Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。
C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)
RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为 试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
D.酵母双杂交体系
Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。
基本原理: 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。
若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基因。
主要实验过程: a.选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;c.把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。
d.从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。
e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。
E.基因的图位克隆法
Map-based cloning是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目的基因定位到某个染色体 的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
二、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个 标记之间的基因片段克隆并分离出来。
三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘米）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb;拟南芥菜中，1cm≈290kb;小麦中，1cm≈3500kb。
四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重复序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（nanoliters）的DNA点到玻 片或其它载体上，照射UV light使之永久固定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全部已知基因分别点到 DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立 正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活。第六讲 原核基因表达调控
原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应毫无保障，只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才 能维持自身的生存和繁衍。自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在一个每30min增殖一倍的109细菌群体中，若有一个细菌变成了29.5min增殖一 倍，大约经过80天的连续生长后，这个群体中的99.9%都将具有29.5min增殖一倍的生长速度。
一个大肠杆菌细胞中约有2500-3000个基因。估计正常情况下，可带有107个蛋白质，平均每个基因产生3000多个蛋白质分子。但大肠杆菌中一般带 有15,000-30,000个核糖体，有50余种核糖体结合蛋白，数量也很惊人。此外，负责糖酵解系统的蛋白质数量也很大。而象半乳糖苷酶等诱导酶，其 含量可少至每细胞仅1-5个分子。
一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。当我们说 一个系统处于“off”状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子。所谓“关”实际的意思是基因表达量特别低，很 难甚至无法检测。
科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我 们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。
基因表达调控主要表现在以下几个方面: 1 转录水平上的调控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)； 3 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。
一、乳糖操纵子的调控模式
大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)包括3个结构基因:Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter,P)结合，通过操纵 区(operator,O)向右转录。转录从O区的中间开始，按Z→Y→A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。转录的调控是启动区 和操纵区进行的。
Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡 萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质 膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
1.酶的诱导-lac体系受调控的证据
在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个酶分子。如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。
科学家把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无 放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，β-半乳糖苷酶便开始合成。分离β-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。说明酶的合成不是由前体转化而来 的，而是加入诱导物后新合成的。
已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lacmRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，为分两类:I型和O型。
I型:野生型为I+，突变型为I-O型:野生型为O+，突变型为Oc。
I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。研究发现，I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局 部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使细胞中的lac仍然被抑制。
遗传学图谱分析指出，Oc突变位于I与Z之间，所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表 DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这一特性。O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久 型合成，O区域称为操纵基因。
2.操纵子模型
Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，可以用实验方法进行研究，因此选为突破口，终于通过大量实验及分析，建立了该操纵子的控制模型。Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。④当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。
⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。
3.Lac操纵子的本底水平表达
因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。
4.葡萄糖对lac操纵子的影响--代谢物阻遏效应
研究表明，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制作用是间接的，因为存在一种大肠杆菌突变株，它正常的糖酵解过程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能转化为下一步代谢中间物，该菌株能在有葡萄糖存在的情况下被诱导合成lac mRNA。
5.cAMP与代谢物激活蛋白
当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻，没有β-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗完以后（图中箭头处），细胞内cAMP浓度增加，β-半乳糖苷酶活性被诱导，一度停止生长的细胞又恢复分裂。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中，细胞内cAMP浓度就很高；若在含葡萄糖的培养基中培养，细菌 中的cAMP浓度就会很低；如果将细菌置于甘油或乳糖等不进行糖酵解的碳源培养基中，细菌中cAMP的浓度也会很高。
研究证实，葡萄糖所引起的代谢物抑制(Catabolite repression)现象的实质是该代谢物降低了细胞中cAMP的含量.事实上，cAMP-CAP复合物是lac体系的positive regulator，它们不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。
cAMP-CAP不但能与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物，它还能直接影响RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有这个“环”的亚基存在，lacI+基因产物（阻遏物）无法与O区相结合lac operon得到表达。
6.lac操纵子DNA的调控区域--P.O.区
lac P（启动子区）从I基因结束到mRNA转录起始位点止，共长82bp（-82～+1）O区就是阻遏物结合区，位于P区后半部分和转录起始区（-7～+ 28），该区序列有对称性，其对称中心点在+11位。P区的CAMP-CAP结合区（-67～-52）也有对称性，其对称位点在-60～-59之间。
在一个完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2，这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。
1lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子再度起始翻译的概率。2在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因?
第二篇：分子生物学课程教学讲义 朱玉贤
分子生物学课程教学讲义 朱玉贤
第一讲 序论
二、现代分子生物学中的主要里程碑
分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。
从1847年Schleiden和Schwann提出“细胞学说”，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将“性状”与“基因”相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。1910年，德国科学家Kossel第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。
1959年，美国科学家Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA翻译成蛋白质的过程。同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中DNA的复制。
1962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。
1965年，法国科学家Jacob和Monod提出并证实了操纵子（operon）作为调节细菌细胞代谢的分子机制。此外，他们还首次推测存在一种与DNA序列相互补、能将它所编码的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白质的mRNA（信使核糖核酸）。
1972年，Paul Berg（美）第一次进行了DNA重组。
1977年，Sanger和Gilbert（英）第一次进行了DNA序列分析。1988年，McClintock由于在50年代提出并发现了可移动遗传因子（jumping gene或称mobile element）而获得Nobel奖。
1993年，美国科学家Roberts和Sharp因发现断裂基因（introns）而获得Nobel奖。Mullis由于发明PCR仪而与加拿大学者Smith（第一个设计基因定点突变）共享Nobel化学奖。
此外，Griffith（1928）及Avery（1944）等人关于致病力强的光滑型（S型）肺炎链球菌DNA导致致病力弱的粗糙型（R型）细菌发生遗传转化的实验；Hershey和Chase（1952）关于DNA是遗传物质的实验；Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）:Meselson和Stahl（1958）关于DNA半保留复制的实验以及Yanofsky和Brener（1961）年关于遗传密码三联子的设想都为分子生物学的发展做出了重大贡献。
我国生物科学家吴宪20世纪20年代初回国后在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。20世纪60年代、70年代和80年代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二锌猪胰岛素的晶体结构，采用有机合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能等方面都有世所瞩目的建树。
三、分子生物学的主要研究内容
所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸、DNA及RNA中的8种碱基所组合而成的，由此产生了分子生物学的3条基本原理：
1． 构成生物体有机大分子的单体在不同生物中都是相同的； 2． 生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则； 3． 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。分子生物学研究内容: DNA重组技术------基因工程 基因表达调控-------核酸生物学
生物大分子结构功能----结构分子生物学 DNA重组技术（又称基因工程）
这是20世纪70年代初兴起的技术科学，目的是将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程及微生物学、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。
DNA重组技术有着广阔的应用前景:DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百 上千倍的地提高。DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从DNA到RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆及分析，都离不开重组DNA技术的应用。
基因表达调控研究
因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。
原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。
转录因子是一群能与基因5'端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
真核基因在结构上的不连续性是近10年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成pre-mRNA后，除了在5'端加帽及3'端加多聚A[polyA]之外，还要将隔开各个相邻编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟mRNA。研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地剪接其中部分内含子，因此生成不同的mRNA及蛋白质分子。
结构分子生物学
生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。
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第二讲 染色体与DNA
一、DNA的组成与结构
Avery在1944年的研究报告中写道：“当溶液中酒精的体积达到9/10时，有纤维状物质析出。如稍加搅拌，它就会象棉线在线轴上一样绕在硬棒上，溶液中的其它成份则呈颗粒状沉淀。溶解纤维状物质并重复数次，可提高其纯度。这一物质具有很强的生物学活性，初步实验证实，它很可能就是DNA（谁能想到！）”。对DNA分子的物理化学研究导致了现代生物学翻天覆地的革命，这更是Avery所没有想到。
所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：
1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。
3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。
二、DNA聚合酶与DNA的合成
The accuracy of translation relies on the specificity of base pairing.The actual rate in bacteria seems to be--10-8-10-10.This corresponds to-1 error per genome per 1000 bacterial replication cycles, or-10-6 per gene per generation.DNA polymerase might improve the specificity of complementary base selection at either(or both)of two stages: 1，It could scrutinize the incoming base for the proper complementarity with the template base;for example, by specifically recongnizing matching chemical features.This would be a presynthetic error control.2，Or it could scrutinize the base pair after the new base has been added to the chain, and, in those cases in which a mistake has been made, remove the most recently added base.This would be a proofreading control.三、DNA的生理意义及成分分析
早在1928年英国科学家Griffith等人就发现肺炎链球菌使小鼠残废的原因是引起肺炎。细菌的毒性（致病力）是由细胞表面荚膜中的多糖所决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜多糖而都能使小鼠发病，而具有粗糙外表的R型因为没有荚膜多糖而失去致病力（荚膜多糖能保护细菌免受运动白细胞攻击）。
首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。Avery等人将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后再侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病能力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌天然无致病力。当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死了。解剖死鼠，发现有大量活的S型（而不是R型）细菌。他们推测，死细菌中的某一成分棗转化源（transforming principle）将无致病力的细菌转化成病原细菌。
美国冷泉港卡内基遗传学实验室科学家Hershey和他的学生Chase在1952年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌体内。它的头、尾外部都有由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5个步骤：①噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面；②噬菌体通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，噬菌体的蛋白质外壳则留在细胞外面；③噬菌体的DNA一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成噬菌体自身的DNA和蛋白质；④新合成的DNA和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子噬菌体；⑤子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。他们发现被感染的细菌中带有70%的噬菌体DNA，但只带有20%的噬菌体蛋白质。子代噬菌体中带有50%标记的DNA，却只有1%的标记蛋白质。四.C-value和Cot1/2 The total amount of DNA in the haploid genome is a characteristic of each living species known as C-value.Cot1/2 is the product of concentration and time required for 50% reassociation given in nucleotide-moles × second/liter.五、染色体结构
DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called “chromosomes”, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many.任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。如果设想将人体细胞中的DNA分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占1－5厘米，而一个2－3kb的基因只相当于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段！
Genotype(基因型)： The genetic constitution of a given organism(指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质)。Phenotype(表现型)： Visible property of any given organism(某个特定生物体中可观察到的物理或生理现象)。Mutations： 染色体DNA中可遗传的核苷酸序列变化。
六、染色体的组成1．染色质和核小体
染色质DNA的Tm值比自由DNA高，说明在染色质中DNA极可能与蛋白质分子相互作用；在染色质状态下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA复制和转录活性大大低于在自由DNA中的反应；DNA酶I（DNaseI）对染色质DNA的消化远远慢于对纯DNA的作用。染色质的电子显微镜图显示出由核小体组成的念珠状结构，可以看到由一条细丝连接着的一连串直径为10nm的球状体。
核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。八聚体在中间，DNA分子盘绕在外，而H1则在核小体的外面。每个核小体只有一个H1。在核小体中DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成1/7，200bpDNA的长度约为68nm，却被压缩在10nm的核小体中。但是，人中期染色体中含3.3×109碱基对，其理论长度应是180cm，这么长的DNA被包含在46个51μm长的圆柱体（染色体）中，其压缩比约为104。
2．染色体中的核酸组成
⑴不重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%－80%。不重复序列长约750－2000dp，相当于一个结构基因的长度。单拷贝基因通过基因扩增仍可合成大量的蛋白质，如一个蚕丝心蛋白基因可作为模板合成104个丝心蛋白mRNA，每个mRNA可存活4d，共合成105个丝心蛋白，这样，在几天之内，一个单拷贝丝心蛋白基因就可以合成109个丝心蛋白分子。
⑵中度重复序列 这类重复序列的重复次数在10－104之间，占总DNA的10%－40%。各种rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。
非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是连在一起的，中间隔着不转录的间隔区，这些单位在DNA链上串联重复约5000次。在卵细胞形成过程中这些基因可进行几千次不同比例的复制，产生2×106个拷贝，使rDNA占卵细胞DNA的75%，从而使该细胞能积累1012个核糖体。
⑶高度重复序列——卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%—60%，由6—100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基的组成不同，在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。
高等真核生物DNA无论从结构还是功能看都极为复杂，以小鼠为例：
1.小鼠总DNA的10％是小于10bp的高度重复序列，重复数十万到上百万次/genome。
2.总DNA的20％是重复数千次、长约数百bp的中等重复序列。
3.总DNA的70％是不重复或低重复序列,绝大部分功能基因都位于这类序列中。
Centromere：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point），这种结合对于染色体对在子细胞中的有序和平均分配至关重要。在酵母中，centromere的功能单位长约130 bp，富含AT 碱基对。在高等真核细胞中，centromere都是由长约5－10 bp、方向相同的高度重复序列所组成。
Telomeres are sequences at the ends of eukaryotic Chromosomes that help stabilize them。酵母Telomeres一般以100 bp左右不精确重复序列所组成。5’(TxGy)n 3’(AxCy)n 其中X、Y一般为1－4，单细胞真核生物中n常为20－100，高等真核生物中>1500。染色体末端的线性重复序列不能被DNA polymarase 所准确复制，它们一般在DNA复制完成以后由telomarase合成后加到染色体末端。
Alu（长约300bp）是人类高度重复序列,因为该序列中带有AluI的识别序列而得名。数十万个Alu重复序列散布于整个人类 如果注射后经数小时（或数天）收获肝脏，所有细胞成份中都带有放射性标记的蛋白质;如果注射后几分钟内即收获肝脏，那么，放射性标记只存在于含有核糖体颗粒的细胞质成份中。 （2）Francis Crick等人第一次证实只有用三联子密码的形式才能把包含在由AUGC四个字母组成遗传信息（核酸）准确无误地翻译成由20种不同氨基酸组成的蛋白质序列，实现遗传信息的表达。实验1: 用吖啶类试剂（诱导核苷酸插入或丢失）处理T4噬菌体rII位点上的两个基因，使之发生移码突变（frame-shift），就生成完全不同的、没有功能的蛋白质。实验2: 研究烟草坏死卫星病毒发现，其外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，相应的RNA片段长1200个核苷酸，与密码三联子体系正好相吻合。实验3: 以均聚物为模板指导多肽的合成。在含有tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其它蛋白质因子的细胞抽提物中加入mRNA或人工合成的均聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板来决定。 1961年，Nirenberg等以poly（U）作模板时发现合成了多聚苯丙氨酸，从而推出UUU代表苯丙氨酸（Phe）。以poly（C）及poly（A）做模板分别得到多聚脯氨酸和多聚赖氨酸。实验4: 以特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成。以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽，5'„UGU GUG UGU GUG UGU GUG„3',不管读码从U开始还是从G开始，都只能有UGU（Cys）及GUG（Val）两种密码子。实验5: 以共聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚（UUC）为模板，可能有3种起读方式： 5’„UUC UUC UUC UUC UUC„3’或 5’„UCU UCU UCU UCU UCU„3’或 5'„CUU CUU CUU CUU CUU„3'分别产生UUC（Phe）、UCU（Ser）或CUU（Leu）.多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种多肽：5’„GUA GUA GUA GUA GUA„3’或5’„UAG UAG UAG UAG UAG„3’ 或5’„AGU AGU AGU AGU AGU„3’由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生GUA（Val）或AGU（Ser）。实验6: 以随机多聚物指导多肽合成。Nirenberg等及Ochoa等又用各种随机的多聚物作模板合成多肽。例如，以只含A、C的多聚核苷酸作模板，任意排列时可出现8种三联子，即CCC、CCA、CAC、ACC、CAA、ACA、AAC、AAA，获得由Asn、His、Pro、Gln、Thr、Lys等6种氨基酸组成的多肽。 （3）氨基酸的“活化”与核糖体结合技术。 如果把氨基酸与ATP和肝脏细胞质共培养，氨基酸就会被固定在某些热稳定且可溶性RNA分子（transfer RNA，tRNA）上。现将氨基酸活化后的产物称为氨基酰-tRNA（aminoacyl-tRNA），并把催化该过程的酶称为氨基酰合成酶（aminoacyl-tRNA Synthetase）。以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的反应液中保温后通过硝酸纤维素滤膜，只有游离的AA-tRNA因相对分子质量小而通过滤膜，而核糖体或与核糖体结合的AA-tRNA则留在滤膜上，这样可把已结合与未结合的AA-tRNA分开。 当体系中带有多聚核苷酸模板时，从大肠杆菌中提取的核糖体经常与特异性氨基酰-tRNA相结合。如果把核糖体与poly（U）和Phe-tRNAPhe共温育，核糖体就能同时与poly（U）和Phe-tRNAPhe相结合。 4种核苷酸组成61个编码氨基酸的密码子和3个终止密码子，它们不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子（synonymous codon）。 三．密码子和反密码子的相互作用 蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子通过碱基的反向配对与mRNA的密码子相互作用。1966年，Crick根据立体化学原理提出摆动假说（wobble hypothesis），解释了反密码子中某些稀有成分如I以及许多有2个以上同源密码子的配对问题。Wobble hypothesis ① 任意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基形成Watson-Crick碱基配对。 ② 反密码子第一位是A或C时，只能识别一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能识别两个密码子。当Inosine（I）作为反密码子第一位时，能识别三个密码子。 ③ 如果数个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不相同的密码子都对应于各自的tRNA。 ④ 根据上述规则，至少需要32种不同的tRNA才能翻译61个密码子。 四．tRNA tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，被称为第二遗传密码。它不但为将每个三联子密码翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了载体。所有的tRNA都能够与核糖体的P位点和A位点结合，此时，tRNA分子三叶草型顶端突起部位通过密码子：反密码子的配对与mRNA相结合，而其3’末端恰好将所转运的氨基酸送到正在延伸的多肽上。代表相同氨基酸的tRNA称为同工tRNA。在一个同工tRNA组内，所有tRNA均专一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。 1、tRNA的三叶草型二级结构 受体臂（acceptor arm）主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3’端末配对的3-4个碱基所组成，其3’端的最后3个碱基序列永远是CCA，最后一个碱基的3’或2’自由羟基（—OH）可以被氨酰化。TφC臂是根据3个核苷酸命名的，其中φ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。反密码子臂是根据位于套索中央的三联反密码子命名的。D臂是根据它含有二氢尿嘧啶（dihydrouracil）命名的。最常见的tRNA分子有76个碱基，相对分子质量约为2.5×104。不同的tRNA分子可有74-95个核苷酸不等，tRNA分子长度的不同主要是由其中的两条手臂引起的。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区，特别是在反密码子3'端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸。这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。2．tRNA的L形三级结构 酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。这种结构是靠氢键来维持的，tRNA的三级结构与AA-tRNA合成酶的识别有关。受体臂和TφC臂的杆状区域构成了第一个双螺旋，D臂和反密码子臂的杆状区域形成了第二个双螺旋。 tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能，因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点，而它的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对，所以两个不同的功能基团最大限度分离。3．tRNA的功能 转录过程是信息从一种核酸分子（DNA）转移至另一种结构上极为相似的核酸分子（RNA）的过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。4．tRNA的种类 （1）起始tRNA和延伸tRNA 能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA 代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA 校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。 五．AA-tRNA合成酶 是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下： 它实际上包括两步反应： 第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi 第二步是氨酰基转移到tRNA 3’末端腺苷残基上，与其2’或3’-羟基结合。E-AA-AMP+ tRNA→AA-tRNA +E+AMP 蛋白质合成的真实性主要决定于AA-tRNA合成酶是否能使氨基酸与对应的tRNA相结合。AA-tRNA合成酶既要能识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都具有高度的专一性。不同的tRNA有不同碱基组成和空间结构，容易被tRNA合成酶所识别，困难的是这些酶如何识别结构上非常相似的氨基酸。 有两道关口: The first filter is the initial binding of the amino acid to the enzyme and its activation to aminoacyl-AMP.The second filter is the binding of incorrect aminoacyl-AMP products to a separate active site on the enzyme.核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有20000个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。 1.核糖体的组成 原核生物核糖体由约2/3的RNA及1/3的蛋白质组成。真核生物核糖体中RNA占3/5，蛋白质占2/5。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。 大肠杆菌核糖体小亚基由21种蛋白质组成，分别用S1„„S21表示，大亚基由33种蛋白质组成，分别用L1„„L33表示。真核生物细胞核糖体大亚基含有49种蛋白质，小亚基有33种蛋白质。 2、rRNA 3.核糖体的功能 核糖体包括至少5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心），此外还有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。小亚基上拥有mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及tRNA携带的功能，如肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。 核糖体可解离为亚基或结合成70S/80S颗粒。翻译的起始阶段需要游离的亚基，随后才结合成70S/80S颗粒，继续翻译进程。体外反应体系中，核糖体的解离或结合取决于Mg2+离子浓度。在大肠杆菌内，Mg2+浓度在10-3mol/L以下时，70S解离为亚基，浓度达10-2mol/L时则形成稳定的70S颗粒。细胞中大多数核糖体处于非活性的稳定状态，单独存在，只有少数与mRNA一起形成多聚核糖体。它从mRNA的5'末端向3'末端阅读密码子，至终止子时合成一条完整的多肽链。mRNA上核糖体的多少视mRNA的长短而定，一般40个核苷酸有一个核糖体。 七.信使核糖核酸 mRNA messenger ribonucleic acidDNA deoxyribonucleic acid.虽然mRNA在所有细胞内执行着相同的功能，即通过三联子密码翻译生成蛋白质，其生物合成的具体过程和成熟mRNA的结构在原核和真核生物细胞内是不同的。 八、蛋白质的生物合成 核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。此外，有20种以上的AA-tRNA及合成酶、10多种起始因子、延伸因子及终止因子，30多种tRNA及各种rRNA、mRNA和100种以上翻译后加工酶参与蛋白质合成和加工过程。蛋白质合成消耗了细胞中90%左右用于生物合成反应的能量。细菌细胞中的2万个核糖体，10万个蛋白质因子和20万个tRNAs 约占大肠杆菌干重的35%。在大肠杆菌中合成一个100个氨基酸的多肽只需5分钟。 1.蛋白质生物合成的主要步骤： 翻译的起始——核糖体与mRNA结合并与氨基酰-tRNA生成起始复合物。肽链的延伸——核糖体沿mRNA5’端向3’端移动，导致从N端向C端的多肽合成。肽链的终止以及肽链的释放——核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应。主要分为五步 1、Activation of Amino Acids(This reaction takes place in the cytosol, not on the ribosome).2、Initiation.The mRNA bearing the code for the polypeptide binds to the small ribosomal subunit and to the initiating aminoacyl-tRNA.3、Elongation.Peptide bonds are formed in this stage.4、Termination and Release.Completion of the polypeptide chain is signaled by a termination codon in the mRNA.5、Folding and Post translational Processing.肽链延伸分为三步 ① Binding of an incoming aminoacyl-tRNA.② Peptide bond formation.③ Translocation.2.与蛋白质合成有关的因子 起始因子Initiation factor（IF）延伸因子Elongation factor（EF）终止因子。原核中有RF1-3。RF-1 识别 UAA和UAG;RF-2 识别 UAA和UGA;RF-3 仅能促进RF-1和RF-2的功能。终止因子行使功能时需要GTP。真核生物中只有一个RF，能识别3个终止子。 3、蛋白质合成的起始 蛋白质合成的起始复合物: 30S 核糖体小亚基 模板mRNA fMet-tRNAfMet 起始因子 GTP 50S 核糖体大亚基 Mg2+ 合成的起始可分为三步: 1、30S 核糖体小亚基与起始因子IF –1和IF-3相结合，诱发模板mRNA与小亚基结合。 2、由30S 小亚基、起始因子IF –1和IF-3及模板mRNA所组成的复合物立即与GTP-IF-2及fMet-tRNAfMet相结合。反密码子与密码子配对。 3、上述六组分复合物再与50S大亚基结合，水解GTP生成并释放GDP和Pi。释放三个起始因子。 表27-9 真核细胞中参与翻译起始的蛋白质因子及其功能 真核因子 功能 eIF2 促进Met-tRNAMet与核糖体40S小亚基结合。 eIF2B eIF3 是最早与核糖体40S小亚基结合的促进因子，蛋白质合成反应的正常进行。 eIF4A 具有RNA解旋酶活性，解除mRNA模板的次级结构并使之与40S小亚基结合，形成eIF4F复合物。 eIF4B 与mRNA模板相结合，协助核糖体扫描模板序列，定位AUG。 eIF4E 与mRNA 5'的帽子结构相结合，形成eIF4F复合物。eIF4G 与eIF4E和poly（A）结合蛋白（PAB）相结合，形成eIF4F复合物。 eIF5 促使多个蛋白因子与40S小亚基解体，以此帮助大小亚基结合形成80核糖体，形成翻译起始复合物。 eIF6 促进没有蛋白质合成活性的80S核糖体解离成40S和60S两个亚基。 4、肽链的延伸 肽链延伸的基本要求是 ： 有完整的起始复合物，有氨基酰-tRNA，有延伸因子EF-Tu, EF-Ts和EF-G，有GTP。 肽链延伸也可被分为三步： 第一步，与新进来的氨基酰-tRNA相结合。氨基酰-tRNA首先必须与GTP-EF-Tu复合物相结合，形成氨基酰-tRNA-GTP-EF-Tu复合物并与70S中的A位点相结合。此时，GTP水解并释放GDP-EF-Tu复合物。 第二步，肽键形成。肽键形成之初，两个氨基酸仍然分别与各自的tRNA相结合，仍然分别位于A位点和P位点上。A位点上的氨基酸（第二个氨基酸）中的α-氨基作为亲核基团取代了P位点上的tRNA，并与起始氨基酸中的COOH基团形成肽键。本反应可能由peptidyl transferase 催化。 第三步，移位（translocation）。核糖体向mRNA的3’方向移动一个密码子，使得带有第二个氨基酸（现已成为二肽）的tRNA从A位进入P位，并使第一个tRNA从P位进入E位。此时模板上的第三个密码子正好在A位上。核糖体的移位需要EF-G（translocase）和另一分子GTP水解提供能量。 5、肽链的终止 当终止密码子进入核糖体A位点时，在释放因子RF1-3的作用下： （1）水解末端肽基tRNA；（2）释放新生肽和tRNA； （3）使70S核糖体解离成30S和50S两个亚基。 6、蛋白质合成的抑制剂 抗菌素对蛋白质合成的作用可能是阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素），或阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素类），或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素、新霉素、卡那霉素等），或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质合成。 链霉素是一种碱性三糖，干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，并导致mRNA的错读。若以poly（U）作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会掺入。对链霉素敏感位点在30S亚基上。 嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，能结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入。它所带的氨基与AA-tRNA上的氨基一样，能与生长中肽链上的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条3'羧基端挂了一嘌呤霉素。 青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。因此，前3种抗生素被广泛用于人类医学，后两种则很少在医学上使用。 -------- 第四讲 DNA、RNA和蛋白质代谢 DNA是贮藏遗传信息的最重要的生物大分子。DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。贮藏在任何基因中的生物信息都必须首先被转录生成RNA，才能够得到表达。DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。 RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂；RNA既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。 蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。 一、核苷酸的合成与代谢 核苷酸是DNA和RNA的前体是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP，GTP）,是NAD、FAD、S-adenosylmethionine及 Coenzyme A等的重要成份。在糖代谢中也有重要作用，如生成UDPG和 CDP-diacylglycerol等。cAMP, cGMP还是第二信使。 1、De Novo嘌呤核苷酸的生物合成始于PRPP（Phosphoribosyl 1-pyrophosphate） 这一途径的第一步是由谷氨酰胺捐献一个氨基到PRPP的C-1位上，生成5-phosphoribosylamine。 其次，把甘氨酸中的三个基团加到PRA上。第三，由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。第四，谷氨酰胺提供另一个N。第五，脱水环化形成咪唑环。第六，羧基化 第七，通过分子重排将羧基从咪唑第4碳的环外氨基上转移到第5位碳原子上。第八-九，由天门冬酰胺把另一个氨基加到第5位碳原子上。第十，再由N10-甲基四氢叶酸提供一个甲基。第十一，脱水环化，形成嘌呤IMP。 参与合成AMP的是①腺苷琥珀酸合成酶和②腺苷琥珀酸裂解酶。参与合成GMP的是③IMP脱氢酶和④XMP-谷氨酰胺酰胺转移酶。 2.嘌呤核苷酸合成中的反馈调节 3．嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等共同形成的 嘧啶从头合成途径不同于嘌呤的合成，6-原子嘧啶环首先被合成，然后才与核糖-5-磷酸相连。这个反应需要氨基甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate）。4．核苷单磷酸转化为核苷三磷酸 反应生成的ADP可通过糖酵解酶或氧化磷酸化途径被进一步磷酸化。ATP能够把磷酸基团加到其它所有核苷单磷酸上生成核苷三磷酸。 核苷二磷酸可通过一个公用的核苷二磷酸激酶被进一步磷酸化生成核苷三磷酸。 5．核糖核苷酸（ribonucleotides）是脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleotides）的前体。所有dNTP都直接来自于NTP（其实是NDP）。这个反应很特殊，因为核糖上的还原反应发生于一个没有活化的碳原子上。催化该反应的酶是核糖核苷酸还原酶。 大肠杆菌核苷酸还原酶有两大特征，它的生物学活性和底物特异性同时受效应子（effector molecules）的影响。每个R1亚基上都有两个调节位点，当影响整体酶活性的那个位点与ATP相结合时，酶活性增加；而当它与dATP结合时，酶活性消失。 第二个调节位点控制了底物特异性。当dATP与该位点相结合时，UDP和CDP的还原反应优先进行。当dTTP与该位点相结合时，GDP的还原反应优先进行。核糖核苷酸还原反应的主要过程 1.还原酶R2亚基处于氧化态-X˙，向核糖3'位碳原子上的H发起攻击，生成3'位自由基。2.R1亚基上的-SH基团为2'-OH提供一个H原子，使之生成-OH2基团。3.脱水后，3'位自由基帮助维持2'位O+基团。 4.R1亚基上的另一个-SH基团为2'-CH+提供一个H原子 5.2'上的C˙-OH向R2亚基上的X-H发起攻击。6.2'上的C-OH失去氧原子，生成dNDP。其中，dTMP（thymidylate）来自于dCDP和dUMP，其直接前体是dUMP，由胸苷酸合酶（thymidylate synthase）将dUMP转化为dTMP；反应中的甲基来自于N5，N10-Methylene-tetrahydrofolate。 7、嘌呤和嘧啶降解后分别生成Uric Acid和Urea。嘌呤核苷酸降解 第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基团，由Adenosine-monophosphate变成Adenosine，或从GMP变成Guanosine。 二、在Adenosine deaminase的作用下生成Inosine； 三、在nucleosidase的作用下生成Hypoxanthine或由Guanosine生成Guanine； 四、在Xanthine oxidase或Guanine deaminase作用下生成Xanthine； 五、在Xanthine oxidase的作用下生成Uric acid。嘌呤代谢突变会引起重要疾病。 如人体内缺失adenosine deaminase，会引发严重的免疫缺失性疾病，因为此时T-淋巴和B-淋巴细胞不能正常发育。AD缺失后，细胞内dATP的含量将高达正常细胞中的100倍，而过量的dATP则抑制了其余dNTP在T-淋巴细胞中的合成。许多化疗（chemotherapy）药剂都针对核苷酸合成途径。如Azaserine和Acivicin都是Glutamine类似物，被用于阻断核苷酸的生物合成。 胸苷合成中的主要抑制剂有fluorouracil（氟脲）、methotrexate（氨甲基叶酸）和aminopterin（氨喋呤）。氟脲本身不是thymidylate synthase 抑制剂，但它在细胞中被转化为FdUMP以后，就能直接与TS相结合并使之失活。氨甲基叶酸和氨喋呤都是dihydrofolate reductase的抑制剂，氨甲基叶酸与该酶的亲和力比底物dihydrofolate高100倍。 二、氨基酸代谢 按所占的质量比例计算，N在生物体内的重要性排在CHO之后，列第4位。大量N元素都是有机氮，被结合于氨基酸或核苷酸分子中。地球上的动植物共含氮约1.5×1010t，而每年通过硝化细菌以气态氮的形式释放到大气中的氮就有2×108—5×108t。全世界氮肥厂每年生产的化肥仅含氮约108t，所以，如果没有生物固氮，生命很快就不复存在了。 1.铵通过谷氨酸→谷氨酰胺被结合到有机物质中。主要有两步反应： ⑴Glutamate+ATP→γ-glutamylphosphate+ADP ⑵γ-Glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+Pi+H+ 总结： Glutamyl+NH4++ATP→glutamine+ ADP+Pi+H+ 因此，谷氨酰胺合成酶是氮代谢中的主要调控位点。 在大肠杆菌中，GS由12个相同的亚基（50kDa）聚合而成，其活性既通过构象变化，也能通过共价修饰的方式得到调节。Alanine，Glycine和其它至少6种gln代谢产物都是GS活性的变构抑制剂，每个抑制剂都只有部分抑制作用。除变构抑制之外，GS活性还受共价修饰调节。当第397位酪氨酸被腺苷化后（加上AMP），该酶更容易受变构抑制剂的反馈调节。2.氨基酸的生物合成 高等动物不能合成大约一半氨基酸，只能从食物中直接获取这些必需氨基酸（Essential）。表18-1 人体必需氨基酸(*.哺乳期至幼儿期必需)表22-1 氨基酸合成的六条主要途径 3.氨基酸脱羧基化后生成有机胺。许多重要的神经递质都是胺或其次生代谢产物。Tyrosine降解产物有dopamine（多巴胺），epinephrine（肾上腺素），norepinephrine，统称为Catecholamines（儿茶酚胺）。 4.精氨酸降解产生NO˙(Nitric Oxide)。 本世纪80年代，科学家发现NO是人体内重要的信号分子，它参与神经传递、凝血和血压调控等一系列生理反应。虽然它是气体，极易扩散，但由于它十分活跃，其扩散半径一般只有1mm。 三、氨基酸及功能蛋白质合成后的修饰 1.蛋白质刚刚被合成时，都以fMet（原核）或Met（真核）开始，多肽合成后，N端的formyl group、Met残基，有时还包括N揣多个残基或C端的残基都会被切除。50%的真核蛋白中，N-端残基的氨基酸会被N-乙基化。 2.切除信号肽。许多蛋白质都带有15-30个残基的signal peptides，负责指导蛋白质在细胞中的精确定位。 3.特定氨基酸的修饰。4.氨基酸的糖苷化 5.氨基酸的异戊烯化（Addition of Isoprenyl Groups）6.有些蛋白质还要与辅基(prosthetic groups)相结合； Cytochrome C只有与血红素（heme）相结合才有功能。此外，Acetyl-CoA羧化酶常与Biotin分子相结合。有些蛋白质必须经蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白质只有在形成二硫键之后才有功能。 四、蛋白质的运输和降解 1、绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个Signal peptide。该序列常常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有三个特点：（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（Ala或Gly）。 研究发现，信号肽把Ribosome牵引到ER上。蛋白质合成之初，一旦信号肽序列的N端暴露在核糖体外，该序列（包括核糖体）就迅速与SRP（signal recognition particle）相结合，诱发SRP与GTP相结合，停止新生肽的进一步延伸（此时新生肽一般长约70个残基左右）。受位于ER外膜上的SRP-receptor及ribosome-receptor的牵引，这个复合物（GTP-SRP-ribosome-mRNA-新生肽）立即向ER外膜靠拢，并通过peptide transport complex进入ER内腔。 5.Rough ER上的蛋白质常常通过运转载体将经过修饰的蛋白质送入高尔基体，再分别送到各个亚细胞位点。 6.蛋白质中的核定位序列一般不被切除。 蛋白质的核定位是通过多个蛋白的共同作用来实现的。Importin(α,β亚基)的作用有点像SRP受体。NLS蛋白-Importin复合物停留在核孔上，并在Ran-GTPase的作用下通过核孔。 细菌细胞内也存在类似的蛋白质运转系统。 7、蛋白质降解是一个有序的过程。 在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。 在真核生物中，蛋白质的降解需要Ubiquitin，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr.1×106）。 成熟多肽N-端第一个残基对蛋白质的稳定性有重要影响。 五、DNA代谢 无论是只含有一对染色体的原核细胞还是带有多对染色体的真核细胞，只有整个基因组得到了完整准确的复制，细胞分裂才能顺利发生。所以说，DNA复制的起始，标志了细胞进入一个新的周期。㈠、DNA复制 根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。每个DNA复制的独立单元被称为复制子（replicon），主要包括复制起始位点（Origine of replication）和终止位点（terminus）。原核生物的整个染色体上一般只有一个复制起始位点。大肠杆菌DNA的复制需要有20种左右的酶和蛋白质因子参与，整个DNA复制机器被称之为DNA replicase system或replisome。 Helicase，任何DNA在被复制前都必须解开双链，这个过程是由helicase来完成的，它可在ATP的作用下将DNA母链不断解开形成单链。 Topoisomerase，主要功能是消除DNA解链过程中所产生的扭曲力。DNA结合蛋白，使新解链的DNA保持稳定结构。Primases，为DNA复制提供RNA引物。 DNA polymerases，合成新生DNA链，切除RNA引物。 DNA Ligases，使新生DNA链上的缺口（3'-OH, 5'-p）生成磷酸二酯键。1.DNA复制的起始 大肠杆菌中的复制起始位点是Ori C，全长245Bp，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。 DNA复制起始中的主要步骤 a.大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重复区相结合； b.识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构； c.DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不同方向同时起始DNA的复制。当细胞中存在足够的SSB和DNA gyrase时，DnaB的解链效率非常高。 整个DNA复制过程中，只有复制起始受细胞周期的严格调控。”Once in each cell cycle。“ DNA甲基化与DNA复制起始密切相关。OriC中有11个GATC回文结构（一般说来，256bp才应有一个GATC重复）。DNA子链被合成后，母链立即被甲基化（称为hemimethylated）。此时，oriC与细胞原生质膜相结合。只有当oriC被从膜上释放出来，子链被Dam甲基化后，才能有效地与DnaA蛋白结合，起始新一轮的DNA复制。复制起始可能还受ATP水解过程调控，因为DnaA只有与ATP相结合时才能与oriC区DNA相结合。2.DNA子链的延伸 主要包括两个不同但相互有联系的事件，即前导链和滞后链的合成。由DNA helicase解开双螺旋，由拓朴异构酶消除DNA链上的扭曲力，SSB结合使DNA单链稳定。 前导链的合成：由DnaG（primase）在复制起始位点附近合成一个10-60 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到该引物上。 滞后链的合成：产生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I补上这一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。3.DNA链的终止 当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。4.真核细胞DNA的复制比大肠杆菌更复杂 真核生物的origin of replication被称为ARS-autonomously replicating sequences或者被称为replicators。Yeast replicators长约150dp，有多个保守重复区，共有约500个replicators分布于酵母的17条染色体中。 ㈡、DNA的损伤修复 1． 错配修复（mismatch Repair） 错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的错配几乎完全都被修正，充分反映了母链的重要性。 2.碱基切除修复（Base-Excision Repair） DNA gylcosylases能特异性识别常见的DNA损伤（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化产物）并将受损害碱基切除。去掉碱基后的核苷酸被称为AP位点（apurinic or apyrimidinic）。细胞中最常见的Uracil Glycosylase就能特异性切除细胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair） 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，由核苷酸切除修复系统负责进行修复。 4.DNA的直接修复（Direct repair） ㈢、DNA的转座 DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。已经发现”转座“这一命名并不十分准确，因为在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来位置上，在新位点上出现的仅仅是拷贝。因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。1． 转座子的分类和结构特征 a.简单转座子 转座子（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertion sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。 b.复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。 2、转座作用的机制 转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的，如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。转座可被分为复制性和非复制性两大类。在复制性转座中，所移动和转位的是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA类转座主要是这种形式。在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。3.转座作用的遗传学效应 ① 转座引起插入突变;② 转座产生新的基因;③ 转座产生的染色体畸变;④ 转座引起的生物进化.六、RNA代谢 除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都来自于DNA。基因组DNA通过一个被称为转录的过程把贮存在双链DNA分子中的遗传信息转换到与模板DNA链相互补的RNA单链上。 mRNA，编码了一个或多个蛋白质序列；tRNA，把mRNA上的遗传信息变为多肽中的氨基酸信息；rRNA，是合成蛋白质的工厂核糖体中的主要成份。 1． 依赖于DNA的RNA合成 从DNA合成反应的化学本质、极性和模板的使用这三方面来说，转录与复制是相同的。但是，也存在三个主要不同点： A． 转录中不需要RNA引物； B．转录反应一般只用一小段DNA做模板； C．在转录区，一般都只有一条DNA链可以作为模板。 2.RNA合成的终止 一旦RNA聚合酶启动了基因转录，它就会沿着模板5'→3'方向不停地移动，合成RNA链，直到遇到终止信号时才释放新生的RNA链，并与模板DNA脱离。研究RNA链终止时遇到最常见的问题是3'端核苷酸的定位，因为活细胞内部根据终止信号正确终止的RNA与一个经过剪接的RNA在3'端没有两样，都是-OH基团。模板DNA上都有终止转录的特殊信号--终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子，一个终止子。在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5'端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3'端部分出现不稳定的rU·dA区域。 a.依赖于ρ因子的终止 ρ因子是一个相对分子质量为2.0×105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。 有人认为，在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5'→3'方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3'-OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子具有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。 b、不依赖于ρ 因子的终止 若终止点上游存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构；在终止点前面有一段由4-8个A组成的序列，导致转录产物的3‘端为寡聚U。这两种结构特征的存在同样决定了转录的终止。 在新生RNA中出现发卡式结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5'端的正常结构。寡聚U的存在使杂合链的3'端部分出现不稳定的rU·dA区域。 3.RNA聚合酶II及转录因子在启动子上的装配 TFⅡH还参与DNA的损伤修复。当RNA polⅡ转录过程中碰到受损伤的核苷酸时，TFⅡH能及时启动核苷酸切除修复系统，将损伤修复。 Actinomycin D和Acridine阻断RNA链的延伸 4.RNA的加工成熟 所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子结构；3’加多聚A；切除内含子。 在Group I内含子切除体系中，鸟苷或鸟苷酸的3'-OH 作为亲核基团向Intron 5'的磷酸二酯键发起进攻。 Group II内含子切除体系 核内mRNA原始转录产物的剪辑方式可能是最常见的。在这一模式中，RNA的剪辑需要特异性RNA-protein-复合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已经发现至少有5种snRNAs--U1，U2，U4，U5，U6。 ----------------------------- 第五讲 分子生物学研究法 一、重组DNA技术发展史上的重大事件 1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3.50年代末至60年代，相继提出了”中心法则“和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。年份 事 件 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1944 O.T.Avery证实DNA是遗传物质。 1952 A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。 1958 M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。 1959-1960 S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 1964 C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。 1965 S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由”质粒“DNA所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986 GMO首次在环境中释放。 1988 J.D.Watson出任”人类基因组计划“首席科学家。 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--”Oncomouse“。 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 基因工程中常见的名词: 遗传工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因克隆--gone cloning，重组DNA技术--recombinant DNA technology，分子克隆--molecular cloning。基因工程的主要内容或步骤: 1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 二、基因操作的主要技术原理 1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis 2． 核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地”吸印“ 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。3． 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。4． DNA序列分析 a.Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下： ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。b． Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰； 被修饰的碱基从核糖环上转移； 失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。 专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特异性切割。 c． DNA序列分析自动化 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。 d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization) 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。 当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。 SBH的应用： ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变； ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较； ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况； ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。 5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 a.盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 b．寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。 C．PCRG与PCR诱变 6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。 b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。 c． 甲基化干扰试验(Methylation interference assay) 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。 d． 体内足迹试验 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。 三、分子克隆技术 1、高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。2． 反转录成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP； 应保证所获得双链cDNA的方向性。 Super Script Choice cDNA合成系统中所用的poly（dT）引物 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5'-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA-mcrB-菌株。 3．分子克隆的主要方法 （1）构建cDNA、核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；（2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；（3）DD-RT-PCR法及差别显示技术； （4）差别分析法(RDA法，即Representational difference analysis）；（5）酵母双杂交体系Two-hybrid system； （6）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移（genomic DNA Walking）。 习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一克隆。细胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。 文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到99%的期望值，大约需要筛选150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克cDNA可产生10万-60万个克隆子。 A.差式杂交或扣除杂交克隆技术 B.cRNA差式显示法 除了极少数特例(如组蛋白基因)之外，几乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。 P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。 DDRT-PCR的主要步骤： Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA； Ⅱ.用5'随机引物和某个3'端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)； Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带； Ⅳ.回收特异性差别条带； Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带； Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带； Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。 C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis) RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。 D.酵母双杂交体系 Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。 基本原理： 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。 若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基因。 主要实验过程： a.选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c； b.构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;c.把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。 d.从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。 e.将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。 E.基因的图位克隆法 Map-based cloning是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 二、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。 三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘米）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb;拟南芥菜中，1cm≈290kb;小麦中，1cm≈3500kb。 四、DNA的Microarray 只要事先除去高度及中等重复序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（nanoliters）的DNA点到玻片或其它载体上，照射UV light使之永久固定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全部已知基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活。 第六讲 原核基因表达调控 原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应毫无保障，只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在一个每30min增殖一倍的109细菌群体中，若有一个细菌变成了29.5min增殖一倍，大约经过80天的连续生长后，这个群体中的99.9%都将具有29.5min增殖一倍的生长速度。 一个大肠杆菌细胞中约有2500-3000个基因。估计正常情况下，可带有107个蛋白质，平均每个基因产生3000多个蛋白质分子。但大肠杆菌中一般带有15,000-30,000个核糖体，有50余种核糖体结合蛋白，数量也很惊人。此外，负责糖酵解系统的蛋白质数量也很大。而象半乳糖苷酶等诱导酶，其含量可少至每细胞仅1-5个分子。 一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种”开-关“（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。当我们说一个系统处于”off“状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子。所谓”关“实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。 科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。 基因表达调控主要表现在以下几个方面： ① 转录水平上的调控(transcriptional regulation)； ② mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)； ③ 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。 一、乳糖操纵子的调控模式 大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter,P)结合，通过操纵区(operator,O)向右转录。转录从O区的中间开始，按Z→Y→A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。转录的调控是启动区和操纵区进行的。 Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 1． 酶的诱导-lac体系受调控的证据 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个酶分子。如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。 科学家把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，β-半乳糖苷酶便开始合成。分离β-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。 已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lacmRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，为分两类：I型和O型。 I型：野生型为I+，突变型为I-O型：野生型为O+，突变型为Oc。 I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。研究发现，I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使细胞中的lac仍然被抑制。 遗传学图谱分析指出，Oc突变位于I与Z之间，所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这一特性。O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久型合成，O区域称为操纵基因。 2.操纵子模型 Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，可以用实验方法进行研究，因此选为突破口，终于通过大量实验及分析，建立了该操纵子的控制模型。 ① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。 ② 这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。③ 操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。④当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。 ⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。 3.Lac操纵子的本底水平表达 因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。 4.葡萄糖对lac操纵子的影响--代谢物阻遏效应 研究表明，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制作用是间接的，因为存在一种大肠杆菌突变株，它正常的糖酵解过程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能转化为下一步代谢中间物，该菌株能在有葡萄糖存在的情况下被诱导合成lac mRNA。 5.cAMP与代谢物激活蛋白 当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻，没有β-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗完以后（图中箭头处），细胞内cAMP浓度增加，β-半乳糖苷酶活性被诱导，一度停止生长的细胞又恢复分裂。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中，细胞内cAMP浓度就很高；若在含葡萄糖的培养基中培养，细菌中的cAMP浓度就会很低；如果将细菌置于甘油或乳糖等不进行糖酵解的碳源培养基中，细菌中cAMP的浓度也会很高。 研究证实，葡萄糖所引起的代谢物抑制(Catabolite repression)现象的实质是该代谢物降低了细胞中cAMP的含量.事实上，cAMP-CAP复合物是lac体系的positive regulator，它们不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。 cAMP-CAP不但能与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物，它还能直接影响RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有这个”环"的亚基存在，lacI+基因产物（阻遏物）无法与O区相结合lac operon得到表达。 6.lac操纵子DNA的调控区域--P.O.区 lac P（启动子区）从I基因结束到mRNA转录起始位点止，共长82bp（-82～+1）O区就是阻遏物结合区，位于P区后半部分和转录起始区（-7～+28），该区序列有对称性，其对称中心点在+11位。P区的CAMP-CAP结合区（-67～-52）也有对称性，其对称位点在-60～-59之间。 在一个完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2，这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。 ①lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子再度起始翻译的概率。②在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因? 实验 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 一、实验原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 二、实验试剂 1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4℃。 2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 3、溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 5、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 6、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 8、溴化乙锭（EB）：10mg/ml 9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 10、6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。 三、实验操作 1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。 2、取1.0ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 3、将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀,4℃离心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量离心管中。 6、加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心8000g × 10min。 7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.0倍体积（1ml）预冷的无水乙醇，混匀，室温放置５min，4℃离心12000g×10min，弃上清。 8、加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干或吹干（不能过于干燥，造成溶解困难）。 9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存备用。 四、质粒DNA的电泳检测 观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。 取制备的质粒DNA 1-2μl，加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。 五、注意事项 本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好，一般无麻烦。若所提取质粒 DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。 六、习题： 1、什么是质粒？质粒有什么主要用途？ 2、分子生物学实验中用的质粒是由野生型改建而来的，它必须具备哪三个基本要素？ 3、制备的质粒DNA在琼脂糖凝胶上通常以三种形式条带存在，它们分别是什么？ 实验 琼脂糖凝胶电泳实验 一、实验目的 （1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理； （2）掌握使用水平式电泳仪的方法； 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： （1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 （2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 （3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 （4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。 常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。 三、试剂与器材 （一）材料 电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等 （二）试剂 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。 2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。 3、DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。 4、DNA分子量标准 四、操作方法 常规的水平式琼脂糖电泳： 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表： 琼脂糖的含量（%）分离线状DNA分子的有效范围（Kb） 0.3 60-5 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1 1、制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 2、胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面； 3、加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。 4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板中央时，停止电泳。 5、观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。 五、注意事项 1、EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。 2、由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。 六、实验报告要求与思考题 1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图） M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA 2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？ 3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？ 4、为什么分子生物学实施时要担心EB？ 5、琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 电泳流程图： 实验 PCR扩增eGFP基因 一、PCR技术的基本原理 PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。 1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。 2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。 3、防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。 4、引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。 5、引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退 二、实验试剂 （一）仪器与器皿 PRC 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性eppendorf管，凝胶成像仪 （二）试剂与材料 1、琼脂糖凝胶电泳试剂 1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA 2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖 3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水 4）琼脂糖 2、TaqDNA 多聚酶3、5´反应缓冲液： 125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25% 4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L) 5、DNA 模板 6、引物 1（10μmol/L） 7、引物 2（10μmol/L） 8、无菌水 三、实验步骤 1、按顺序在200μl 指形管中加入以下试剂与样品：（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。 1）ddH2O 37μl 2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2) 3）dNTP ２μl 4）引物1(上游)２μl 5）引物2（下游）２μl 6）模板 1μl（pEGFP质粒） 7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）总体积共50μl 2、在PCR 扩增仪上按以下反应条件编入程序：（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定参数。） 1)预变性 94℃ 3 分种 2)循环条件（30 次） 变性 94℃ 30 秒 复性 55℃ 30 秒 延伸 72℃ 1分 3)延长延伸 72℃ 7 分钟 编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。 3、PCR 扩增完毕，配1.5%琼脂糖凝胶，电泳观察结果。 4、凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段 四、习题 1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？ 2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？ 3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？ 实验 从动物组织（猪肝）中提取DNA 一、实验内容 采用SDS裂解和蛋白酶K消化法从猪肝中提取DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。目的 (1)掌握SDS裂解法从猪肝中的原理和方法；(2)巩固DNA的琼脂糖凝胶电泳分析实验。 二、实验原理 DNA是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase降解RNA，从而得到纯净的DNA分子。 三、实验材料 新鲜猪肝 TES 缓冲液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L 四、实验步骤 1、剪取约0.5g肝脏组织，放入到研钵中磨碎； 2、向研钵中再加入1 ml TES轻轻研磨，将TES与破碎的组织混匀； 3、吸取535 µl组织匀浆液于2 ml EP管中，再加入60 µl SDS（10%），5.0 µl蛋白酶K，充分混匀后，于56°C保温1 h，每30分钟轻摇1次； 4、放置到室温，加入等体积饱和酚（600µl），颠倒混匀，11000 rpm，离心10 min，吸取400 µl水相，并转移至一个新的1.5 ml离心管中； 5、加入2倍体积（1000 µl）的无水乙醇和1/10倍体积（40 µl）3 M 醋酸钠沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，弃乙醇； 6、加入适量TE溶解DNA和RNAse A（具体依DNA的多少而定），并利用0.7%的琼 脂溏进行电泳分析。 五、注意事项 1、在将猪肝剪碎前要将猪肝清洗干净，除去脂肪及系膜成分。 2、抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。 3、取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。 4、乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。 5、离心后，不要晃动离心管，拿管要稳。 6、在乙醇沉淀后，经离心要观察留在EP管中的小白点，其主要成分就是DNA，在以后的实验中都要细心观察，防止因将小白点丢失。 六、习题 1、为了获得高质量的肝脏DNA，在实验过程中应注意什么。 2、结合本人操作体会，总结在提取过程中如何避免大分子DNA的降解。 3、核酸提取中，去除蛋白质的方法有哪些？ 实验 限制性内切酶切割DNA 一、实验目的 1． 通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子； 2． 根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶； 3． 掌握DNA的酶切技术。 二、实验原理 限制性内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的 EcoR I识别„GAATTC„ 切割后产生„CTTAAG„、„G 和 AATTC„的末端，„CTTAAG„该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团，即„G-OH和„CTTAA-P。 有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如 San3A识别„GATC „；有的识别六 碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I„GCGGCCGC„、„CGCCGGCG„ 则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。 ＋ 限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2为唯一的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。 商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量）。 三、实验材料 待酶切的DNA样品 四、实验仪器、器皿及试剂 1、仪器：可调微量加样器、恒温水浴箱、电泳仪、电泳槽、紫外检测灯 2、器皿：Eppendorf管、Tip、试管架 3、试剂：标准DNA(Marker) EcoRI限制性内切酶 10×buffer：50mmol/l NaCl 10mmol/l Tris-HCl(pH7.5) 10mmol/l MgCl2 lmmol/l DTT（二硫苏糖醇） 五、实验步骤 1、将DNA样品8.5μl(质粒pEGFP, 1μg) 2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由厂家提供。 3、加入1u（0.5μl）的限制性内切酶EcoRI（限制性酶很昂贵，从-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip头，以免污染杂质，吸完后尽快放回冰箱）。 4、混匀反应液后，稍离心使液体聚集，置37℃温育１小时。 5、进行电泳检查酶切结果，100V 25分钟。 6、紫外灯下观察消化效果。 六、注意事项 1、分子生物学实验大多为微量操作，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性以保证酶切效果最佳。现介绍三种微量取样方法： (1)吸样时，将Tip尖刚刚接触到液面时，轻轻吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的样品，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样Tip壁上会沾上很多的样品，导致吸样不准。 (2)用1cm长的塑料毛细管代替Tip吸样，此法也可吸取0.2~0.5μl的样量。 (3)目前也有细长Tip出售，专门用于吸取微量样品。 2、限制性内切酶价格比较贵，因此要注意不使其污染而导致浪费。这就要求每次吸酶时要用新的无菌Tip。另一个造成限制性内切酶浪费的因素就是限制性内切酶的失活。因此，要注意加样次序，即各项试剂加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要尽可能快，以使限制性内切酶拿出冰箱的时间尽可能短。 若用同一酶消化很多样品时，可先计算出所需酶量（可稍多计一点），取出此量的酶与1×缓冲液混合，然后再分装至各个反应管内。这样可节约用酶且缩短操作过程、减少污染机会。 3、开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防杂酶污染。 4、样品在37℃与65℃保温时，要注意将Eppendorf管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 5、无实验必要应尽量避免长时间酶消化样品。因长时间消化，限制酶溶液中可能存在的杂酶会影响试验结果。 七、习题 1、限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？ 2、什么是细菌的限制-修饰系统？限制-修饰系统对细菌有什么用途？ 3、限制性内切酶有几类？这几类限制性内切酶各有什么特点？可作为工具酶的限制性内切酶是哪一类？为什么？ 4、限制性内切酶的识别序列有什么特点？称为什么序列？ 5、酶通常在什么温度中保存？为什么酶在该温度下保存不会结冻？酶最后工作的时候其甘油浓度必须低于多少？ 6、1个单位（1 U）的限制性内切酶代表什么意思？ 实验 质粒的转化 一、实验目的 掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：质粒DNA；大肠杆菌感受态细胞。 二、实验原理 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 （1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 三、实验步骤 1、制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2、取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3、每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟； 4、热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； 5、冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； 6、复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏； 7、布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板； 8、培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。 四、结果与分析 计算转化效率 菌落数/DNA质量（μg）*稀释倍数 五、习题 1、制备感受态细胞的关键是什么？ 2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。 3、如何提高转化效率？ 《分子生物学》课程教学大纲（理论学时：16学时） 使用教材： 医学分子生物学 （供8年制及7年制临床医学等专业用） 分子生物学是一门从分子水平研究生命现象、生命的本质、生命活动及其规律的科学。医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。作为一门课程，医学分子生物学涵盖了医学各专业学生必须学习的分子生物学基础知识，以及分子生物学在医学领域中形成的专门研究领域及相关知识。 医学分子生物学既要较系统地了解分子生物学的基础理论知识和技术理论知识，同时也要了解分子生物学在医学领域的应用和相关研究进展。 本书共二十三章，包括5个方面内容。第二章至第十章介绍分子生物学基本知识，主要介绍基因和基因组的基本概念和基本特点，基因组核酸复制与损伤修复、基因表达和功能蛋白形成与降解、基因表达调控、细胞间通讯与信号转导的基本概念和基本理论，细胞增殖与凋亡的相关分子生物学机制。第十一章至第十三章介绍基因操作的基本知识，包括基因分析、基因功能研究和基因克隆与表达的相关基本知识和研究策略。第十四章至第十八章介绍疾病分子生物学机制，介绍了基因和基因组、细胞间通讯和信号与人类健康和疾病之间关系。第十九章至第二十一章介绍分子生物学理论与技术在医学中应用，包括基因诊断和基因治疗概念与相关研究。最后两章介绍分子生物学新兴研究领域、生物信息学在基因和蛋白质研究中的应用。 本大纲正是从上述目的出发，在要求学生掌握分子生物学基本知识与基本技术，同时了解分子生物学在医学领域的应用与相关研究。使学生们在分子水平上研究人体在正常及疾病状态下生命活动及其规律，为从事临床医学打下深厚的基础。 绪 论 一、目的要求 了解分子生物学的定义、研究对象和研究内容；分子生物学发展简史；生物遗传物质的发现；现代分子生物学的建立和深入发展；分子生物学与相关学科的关系；分子生物学在医学和生物学中的应用。 二、主要内容 分子生物学则是从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴学科。它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构与功能为研究对象 （一）、分子生物学的研究内容 分子生物学主要研究生物大分子的结构、功能、生物大分子之间的相互作用及其与疾病发生、发展的关系。 研究内容主要包括以下三个方面。1.核酸分子生物学 2.蛋白质分子生物学 3.细胞信号转导 （二）、分子生物学发展简史 1、生物遗传物质的发现 2、现代分子生物学的建立 3、现代分子生物学的深入发展 （三）、分子生物学与相关学科的关系 由于生命本质的高度一致性，分子生物学已经对生物学和医学的各个领域产生了全面而深刻的影响，并逐步形成了一系列的分子学科。可以使用同一套理论、同一套技术，来解释和研究不同的病理、生理现象，甚至治疗不同的疾病。 1、分子生物学与生物化学 2、细胞生物学与分子生物学 3、分子生物学与遗传学 4、分子生物学与生物技术 （四）、分子生物学与医学未来 分子生物学的发展和渗透从根本上改变了医学（包括临床和基础医学）各个学科的格局, 使医学各学科进入了一个更高的水平——分子水平。 1、分子生物学在医学和生物学中的应用 2、分子生物学与基础医学 3、分子生物学和病理学 4、分子生物学和疾病诊断 5、分子生物学和疾病治疗 基因治疗技术的发展与整个医学科学的发展以及许多分子生物学新理论、新技术、新方法的应用密切相关。 所谓基因治疗，就是用正常基因置换致病基因以纠正患者基因结构和功能异常的一种疾病治疗的方法。 狭义的基因治疗是指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因的表达产物起治疗疾病的作用。广义的基因治疗则包括通过基因转移技术，使目的基因得到表达，封闭、剪切致病基因的mRNA，或自杀基因产物催化药物前体转化为细胞毒性物质，杀死肿瘤细胞，从而达到治疗疾病的目的。 三、学时安排 1学时 第二章 基因与基因组 一、目的要求： （一）掌握：基因的概念及结构特点；中心法则；基因转录调控相关序列；多顺反子，单顺反子；真核基因与原核基因的结构特点。基因组的概念；病毒、细菌及真核生物基因组的结构特征。 （二）熟悉：基因突变的意义，基因组变异的生理和病理学意义。 （三）了解：基因的命名法，基因组学；人类基因组计划。 二、主要内容 基因是负责编码RNA或一条多肽链的DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。原核生物的结构基因是连续的，其RNA合成后不需要经过剪接加工。而大多数真核生物基因在编码区内有非编码的插入序列。基因中含有与转录有关调控序列。真核生物基因中调控序列一般称为顺式作用元件。 大多数生物的遗传信息都是以特定的核苷酸排列顺序贮存在DNA分 子中。但在一些病毒中，RNA作为遗传物质。多数生物信息按照从DNA到RNA再到蛋白质的方向流。但是对RNA病毒是以RNA为模板，合成单链DNA，然后再合成双链DNA。 mRNA将DNA中信息传递给蛋白质。在mRNA编码区内每三个连续核苷酸，对应多肽链一个氨基酸，指导蛋白质合成。原核生物mRNA称多顺反子mRNA，而真核生物mRNA称单顺反子mRNA。 基因突变在进化上具有重要意义，它是形成生物多样性主要因素之一。同时基因突变可以改变遗传信息，导致疾病。导致基因突变因素有自发、物理、化学因素等，基因突变可直接影响蛋白质一级结构和空间结构，导致疾病或对疾病易感。 基因命名的基本原则是简明、独特、能够表达基因的特征或功能。基因符号的命名也应遵循独特、简短、仅含有大写拉丁字母或大写字母和阿拉伯数字、不应含有标点符号的基本原则。 1．重点内容：基因转录调控相关序列；多顺反子，单顺反子；基因组的概念；病毒、细菌及真核生物基因组的结构特征。 2．难点内容：基因的结构特点，真核生物基因组的结构特征。 三、学时安排 5学时 第三章 基因表达与基因表达调控 一、目的要求： （一）掌握：遗传信息表达，转录，翻译，有意义链，转录模板链，开放阅读框，遗传密码等基本概念。基因表达，管家基因，组成性基因表达，诱导表达，阻遏表达，协调表达，表达调控，反式作用因子，表达组织特异性等基本概念；乳糖操纵子的结构及其调节机制。 （二）熟悉：原核生物RNA和蛋白质的生物合成基本过程，真核生物RNA和蛋白质合成特点；真核生物基因表达调控的各个水平，DNA水平调控的不同方式，反式作用因子的主要特点和调节方式，转录后调控的不同环节，翻译水平和翻译后水平调控的基本环节 （三）、了解：了解转录和翻译后的加工。反式作用因子结构域模式和反式作用因子的作用方式，基因表达的组织特异性和时相性。 二、主要内容 原核生物基因表达调控主要是在转录水平和翻译水平。转录水平的调控涉及启动子、S因子、阻遏蛋白、正调控蛋白等多种因素，翻译水平的调控则涉及SD序列、mRNA的稳定性及翻译产物的调控。 真核生物基因表达调控环节较多，在DNA水平可通过染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化以及染色质结构改变影响基因表达；在转录水平则主要通过反式作用因子的作用调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合以及转录起始复合物的形成；在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达；影响翻译水平的因素有影响翻译起始的阴遏蛋白、5`AUG、5` 端非编码区的长度等，另外还存在小分子反义RNA对翻译调控。翻译后蛋白质修饰和定位也是表达调控的重要环节。 同时近年提出的有关基因表达的统一理论惭被认识。从而形成一个完整的调控网络。 1、重点内容： 原核生物转录水平的调控机制；真核生物转录水平的调控机制；真核生物转录后水平的调控机制。 2、难点内容： 原核生物转录水平的调控机制。 三、学时安排 4学时 第四章 基因分析的基本策略 一、目的要求 （一）掌握：Southern 杂交和PCR等技术原理及在分析基因拷贝数的应用；Northern blot和RT-PCR技术原理及在基因转录水平变化分析中的应用； （二）熟悉：Western blot 原理及在特定基因产物-蛋白质分析中的应用。 （三）了解：DNA序列测定的原理及其主要应用；RNA酶保护试验原理及应用；原位杂交技术；DNA微阵列技术原理； 流式细胞术的应用；免疫 组化方法的应用。 二、主要内容 基因分析是一种策略性很强的工作，有许多技术可以用于基因分析，正确选择实验技术方法和基因分析切入点是进行基因分析首先要考虑的问题。根据信息中心法则，DNA是遗传信息的携带者，RNA是基因的转录产物，蛋白质是结构基因的最终产物，因此，分析基因可从DNA、RNA、蛋白质水平上进行。同时研究者善于将各种技术有机结合起来，根据研究目的筛选适当技术方法，也可先制定研究策略，再进行实验技术路线设计。 1、重点内容：Southern 杂交和PCR等技术原理及应用；Northern blot和RT-PCR技术原理及应用Western blot 原理及应用。 2、难点内容：RNA酶保护试验原理及应用。 三、学时安排 3学时 第五章基因功能分析的基本策略 一、目的要求 （一）掌握：转基因模型研究基因的功能原理、基因敲除技术原理、利用基因沉默技术对基因功能进行分析的原理 （二）了解；三种实验技术的操作过程及注意事项 二、主要内容 基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白质水平上采用不同的技术和模 型来实现。模式生物是研究基因功能不可缺少的工具，转基因小鼠和基因敲除技术是目前研究特定基因功能最常用的动物模型，转染细胞是利用转基因技术建立的细胞模型。RNA干涉技术能够实现在RNA水平上暂时关闭特定基因的方法。各种方法都具有各自的特点及局限性，研究者可根据不同目的筛选最合适方法与模型，实现对特定基因功能的研究目的。 1、重点内容：转基因技术、基因敲除技术及RNA干涉技术原理 2、难点内容：转基因技术、基因敲除技术及RNA干涉技术各自优点及局限性 三、学时安排 3学时 第六章 基因工程与体外表达 一、目的要求： （一）、掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。 （二）、熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。 （三）、了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。 二、主要内容： 基因工程指在体外对DNA分子按照既定的目的与方案进行剪切和重新连接，或将DNA中某个位点进行人工替换或删除，改造基因结构，然 后利用转化、转染、感染等方法将重组DNA导入宿主细胞，使DNA片段得到扩增。DNA的体外剪切和重新连接是在限制性核酸内切酶、边接酶以及其他修饰酶的参与下进行的。不同目的的克隆基因需要不同的载体，常用的载体有质粒、噬菌体和粘性质粒等。载体可与外源DNA在体外连接，构成重组DNA分子，导入相应的宿主细胞，能在宿主细胞中自行复制与表达。 克隆的基因可进一步用于表达有关基因的产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子以及基因的功能等。还可通过寡核苷酸介导法、含U模板法、PCR介导的定点诱变法等技术，定向改变克隆基因的序列结构，从而改造相应蛋白的结构。 基因工程在得到重组体后，通常利用大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫、酵母等表达系统进行克隆基因的体外表达。 1、重点内容：基因克隆的基本操作过程。 2、难点内容：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。 三、学时安排： 6学时 第七章 基因诊断(自学) 一、目的要求： （一）掌握：基因诊断的基本概念；掌握基因诊断中常用的分子生物学技术——核酸分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、单链构象多态性（SSCP）检测、限制性酶酶谱分析、DNA序列测定、DNA 芯片技术； （二）熟悉基因诊断的基本方法； （三）了解遗传病、感染性疾病以及肿瘤的基因诊断的策略；了解基因诊断在法医学中的应用。 二、主要内容： 基因诊断已成为临床实验医学的一个重要组成部分。PCR扩增和分子杂交是现代基因诊断技术的基本方法，基因诊断的基本操作流程是：样本抽提、样本扩增、分子杂交和信号检测。遗传病的基因诊断主要是针对DNA分子的遗传分析技术，其基本方法学包括连锁分析和直接诊断。用作连锁分析的遗传标志物主要有RFLP、STR、SNP。用于遗传分析的代表性直接诊断技术有：用于DNA制图的Southern印迹法、用于检测点突变的ASO分子杂交法以及用于识别STR序列的PCR直接扩增法等。同时基因诊断技术已经成为现代法医学的重要内容。 1、重点内容：各种检测方法原理 2、难点内容：各自优点及缺点 三、学时安排 3学时 第八章 基因治疗(自学) 一、目的要求： （一）掌握：基因治疗、基因标记、基因置换、基因添加、基因干预、反义RNA、核酶等基本概念； （二）熟悉：基因转移技术，逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体的特点；熟悉肿瘤基因治疗思路，理解抑癌基因治疗原理、实验研究和临床试验及肿瘤的免疫基因治疗；理解反义RNA在基因治疗中的意义和应用； （三）了解：了解其它基因转移方法；了解核酶及三链DNA在基因治疗中的意义和基本原理；了解基因治疗的前景与问题。 二、主要内容 基因治疗是指以改变人类遗传物质为基础的生物医学学治疗，即通过一定方式将人正常或野生型基因或有治疗作用的DNA顺序导入人体靶细胞，以矫正或转换致病基因的治疗方法。目前开展基因治疗方案采取的策略包括：用正常基因置换染色体上致病基因，将正常基因转移至患者的宿主细胞，使治疗基因代替致病基因表达正常蛋白质而发挥作用；向患者体内或肿瘤细胞内导入肿瘤抑制基因，以抑制其表达；也可用反义RNA、SiRNA、核酶、肽核酸抑制或封闭有害基因mRNA表达；也可将抗体、细胞因子等基因导入肿瘤细胞以激活体内免疫细胞活力，增强患者免疫力。 治疗基因导入体内方法有非病毒方法与病毒方法，非病毒方法包括直接注射法、电穿孔法、脂质体转运法，其方法安全性好但效率低。与病毒方法各具有不同优缺点。 1、重点内容：基因治疗概念、基因治疗策略方法、2、难点内容：治疗基因导入体内方法，各自优缺点、病毒载体结构特点；核酶及三链DNA在基因治疗的原理 三、学时安排 3学时 第九章 基因组学与医学(自学) 一、目的求： （一）掌握：基因组学、人类基因组计划、基因病和SNP的概念；结构基因组学、功能基因组学的概念及研究内容。 （二）熟悉：比较基因组学的概念；疾病相关基因的鉴定策略。 （三）了解：基因组学与医学的关系。 二、主要内容 人类基因组计划的研究目标是阐明构成人类基因组的全部DNA的结构；阐明基因的编码方式和分布特点；理解基因及其调控序列之间的相互关系；理解DNA全部序列所蕴藏的意义。该计划包括为遗传图谱、物理图谱、序列图谱、转录图谱分析。 功能基因组学是研究基因组中所有基因功能的学科。功能基因组学是从基因整体水平对基因的活动规律进行探讨，其研究内容主要包括基因组的表达、蛋白质产物的功能、基因组多样性的研究、基因组功能注释。 1、重点内容：人类基因组计划、功能基因组学的研究内容。 2、难点内容：功能基因组学的研究内容。 三、学时安排 2学时 四、实验内容及学时安排 1大肠杆菌质粒DNA的提取 3学时 2琼脂糖凝胶电泳检测DNA 3学时 3 DNA纯度、浓度和分子量的测定 4学时 4大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 4学时 5动植物基因组DNA的提取与纯化 4学时 分子生物学课程教学改革初探 摘要：文章总结了在十余年分子生物学教学过程中，不断开展的对教师自身综合素质和能力、教学内容、教学方法和教学手段的改革探索，旨在提高分子生物学的教学效果。实践证实，新的教学模式，在传授学生专业知识的同时，激发了学生的学习兴趣，改进了学生的学习方法，也逐步提高了学生的自主学习能力，从而满足了社会对高素质创新型生物人才的需求。 关键词：分子生物学；课程教学；改革研究；创新生物学人才 中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）26-0128-03 前言： 分子生物学的目标是在分子水平上阐明细胞活动的规律，从而揭示生命的本质[1]。虽然它在生物类专业课程体系中充当着重要角色，对生命科学的发展起着至关重要的作用，但是分子生物学的教学却因为课程内容多，学科交叉广，理解难度高，信息量大，知识更新快而使教学效果差强人意，集中表现为教师授课难和学生学习难。这种现状不但困扰着老师和同学，也与大学培养高素质创新型人才的目标不相适应。如何克服分子生物学课堂教学的“瓶颈”？本人在从事十多年的分子生物学教学过程中，努力研究和探索多种形式的教学改革，力求提升教学效果和教学质量。 一、教学内容的合理组织 分子生物学的教学除了选用好的教材，制定完善的教学大纲，如何组织教学内容是教学的一个非常重要环节[2]。教学内容呈现给学生的应该是完整、清晰的、有层次、条理的知识。我们在组织教学的过程中，首先从提高自身学科素养着手。“一本教材书，数种参考书”，除分子生物学国内、国外各类版本外，与分子生物学相互交叉和渗透的其他学科，如细胞生物学、生物化学、遗传学，我们也都进行了系统的学习和强化，不断夯实专业知识、拓展专业领域，基本构建了分子生物学完整的知识体系，具备了对教材处理的前提。既避免了教学中各学科的重复，也进一步凝练了知识。此外，我们还通过网络教学平台向全国优秀教师学习，在不断的探索中总结出了教学内容合理组织的一些思路。 1.思维导学模式。在DNA复制教学环节，知识点多，并且较分散，很容易在教学中造成学习困难和知识混淆的现象，针对这章教学的特点，我们采用了思维导学模式，收到了非常好的教学效果。 2.重点、难点解读。本科教学形式多样化，也更提倡学生的自主学习，但并不是淡化了教师的教学，反而对教师提出了更高的要求[3]。教师必须围绕每堂课的教学目的，合理组织和引导学生理解并掌握教学的重点和难点内容。 比如在讲解染色体端粒末端修复机制中，教师首先要从教材的知识结构中梳理出重点。染色体端粒末端修复机制的知识点包括：（1）引物切除造成的遗传信息缺失；（2）端粒末端的特点；（3）体细胞和性细胞末端修复机制的不同；（4）DNA结构的变化；（5）端粒酶的修复机制。梳理知识点后，总结教学重点：一是引物切除后损伤修复在体细胞和性细胞中的不同；二是四链DNA结构；三是端粒酶的修复机制。其中端粒酶修复机制的讲授是学生学习的难点。难点集中在端粒酶的性质和修复发生的过程。 经过对教学内容中重点和难点的准确把握和合理组织，教师才能在课堂教学中突出重点、突破难点，让学生的课堂学习无障碍。 二、教学方法和手段的改进 教学方法的推陈出新，是教学改革的重要内容[4]。为发挥学生作为教学主体的能动性，我们根据具体的教学内容设置了启发式、联想式、探究式等多种教学方法[5]，让学生参与到教学过程中，不仅活跃了课堂气氛，而且在分享知识的同时，更注重教会学生灵活掌握学习的方法。 1.启发式教学。启发的目的在于举一反三，触类旁通。针对每一次的课堂教学，设计一些抛砖引玉的问题，供学生思考与讨论，这成为了分子生物学理论教学的重要组成部分。如进行到真核生物基因表达调控学习环节，提出甲基化修饰的生物学意义，这个问题覆盖范围广，涉及到了DNA复制的调节、蛋白质和DNA甲基化修饰对基因表达的调控，以及Epigenetic（表观遗传学）方面的知识。通过提出问题―讨论分析―不断启发―再讨论分析―归纳总结―解决问题这一系列的互动教学活动，充分调动了学生课堂学习的主动性和积极性，在不断的讨论分析中通过展示不同的思维、发表各自的观点，不但有利于促进学生在学习中发现问题、解决问题，而且有利于学生通过对基础知识的消化、理解来达到理论的升华、拓展[4]。 2.联想式教学。分子生物学是在生物化学、细胞生物学和遗传学的基础上发展而来[6]，因此知识相互交叉、相互渗透。在授课的过程中，教师一方面要避免重复，一方面要通过联想知识点适时培养学生的发散性思维，提高学生对知识的迁移能力和整合能力。如在讲解化学修饰对基因的表达调控时，将细胞生物学中的信号转导有机结合，使学生了解基因表达调控对细胞信号转导的作用机制。 3.探究式教学。在分子生物学教学中，每一个理论知识的背后都是科学研究的重大突破。如确定遗传物质是DNA的两大经典实验，我们以探究的形式呈现教学内容，从实验设计，到结果显示，再经过讨论分析并得出结论，以课题研究的角度，研究人员的身份引导学生进入学习角色，将学科概念、理论产生的起因和过程展示给学生，启发学生努力探索，走近科学，让学生从中领悟知识形成的探究性和科学性，逐渐培养具有创新意识和能力的高素质研究型人才。 4.多媒体多样化教学。分子生物学的教学内容具有微观性、复杂性、抽象性和动态性。传统的教学手段无法满足教学的需求，而多媒体技术则具有声像俱佳、动静皆宜的特点[7]，是传统教学无法比拟的。多年来我们不断补充和完善教学手段，逐渐形成了独具特色的多媒体教学课件。 多媒体图像处理清晰直观，文字表述简洁明了、主题突出。课件中的图像来源于国内外的网络数据平台。如讲述DNA半保留复制机理时[8]，首先将DNA可能存在的几种复制方式用图像展现，并利用Meselson和Stahl设计的DNA复制同位素示踪实验和密度梯度离心实验来进行结果验证，引导学生明确掌握DNA半保留复制特点，并结合文字，通过图文并茂的多媒体课件，将教学内容中的背景知识、基本概念、基本理论，以及静态、抽象的微观知识清晰讲解。 多媒体课件动静结合、声像互动。对于生命过程中动态的知识点，比如DNA的复制、RNA的转录、蛋白质的翻译过程，可以将这些复杂的生命过程利用多媒体手段做成动画并配以文字和声像，形象直观地展现给学生，既加深了学生对知识的理解，也提高了其学习效率。 三、知识领域的拓展 分子生物学的教学内容除包含基础理论知识外，还有大量理论应用的研究方法部分。我们在教学中不仅仅将知识局限在教材中，利用课堂教学不断引导学生去了解本学科相关领域内的研究热点、最新进展、发展趋势[8]，以及生物技术在生产实践中的广泛应用。 1.专题讲座与专题讨论。专题讲座是教师根据教学内容，自己组织参考资料对教学内容的延伸与拓展。比如在讲授“SNP技术”时，先从遗传标记分析的发展着手，把一代、二代的标记分析做知识性的回顾，再将纳入教材的第三代标记分析“SNP”做详细的讲解，引导大家理解什么是单核苷酸多态性，核苷酸多态性研究的生物学意义以及在医学、农业、畜牧等多种领域的发展与应用。通过这种方式激发了学生的学习热情和求知欲，也使教师不断地进行知识的更新，及时了解本学科当前发展的趋势、研究的热点以及争论的问题。 专题讨论则是以学生为主体，根据课程教学内容，组织学生就某一个专题自行查阅、组织文献资料，并在课堂上展开讨论[9]。比如在讲授基因重组的教学内容时，设计“转基因的利与弊”供学生讨论。引导学生思考基因工程药物和转基因动植物对社会产生的巨大影响，让知识离开课本走进生活，从而唤起学生学习的兴趣和探索未知领域的欲望。这不仅使学生更加深入、系统地理解所学知识，并且培养了学生灵活运用知识的能力[10]。 2.生物信息技术与数据库。生物信息技术已经发展成为分子生物学研究方法中不可分割的一部分，比如在“PCR技术”的专题讲座中，不仅要对实验目的、原理、操作以及应用进行讲解，还要特别对引物设计的生物信息技术进行补充，介绍学生对一些常规的生物信息技术软件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAStar、Cluster等有一个基本的认知度。 在整个分子生物学的教学中，学生需要自行查阅和组织各种文献资料，因此，必须特别强调互联网资源运用的重要性。教师通过介绍中国知网、维普、清华同方、NCBI等几个常用资源库，使学生了解如何利用资源库进行查询，对互联网资源的熟练应用使学生的知识体系得以完善，学生通过自身的努力来提高信息收集和辨别的能力，培养了学生的自学能力。 四、教学改革中应该注意的问题 1.教师的专业修养与教学基本功。教师在教学中具有双重身份，既是一名导演，又是一名演员。作为导演，首先需要有最新的教学理念，整个教学过程中适时设问、适时讨论、适时启发。其次要有较强的课堂组织能力，根据学生的学习情况，把握课堂节奏，调动学生课堂学习激情，使教学有的放矢。否则会在教学中出现“启而不发”和论证条理不清的现象；作为演员，还要有良好的课程驾驭能力，通过教师扎实的专业知识、广泛的认知领域、全面的知识结构，呈现给学生的是一个丰盛的知识大餐，而不是一锅夹生饭。因此作为教师，必须从理论水平、科研水平、思维水平这3个方面提高教师自身的专业素质，此外，还要掌握适合自己的各项教学技能。 2.多媒体教学的合理应用。多媒体教学只是一种提高教学效果的辅助手段，是为教师的教学和学生的学习服务的，只有运用合理才可能达到好的效果。因此尽量避免在多媒体教学课件上出现过多的文字，否则多媒体成了教学活动中的主体，老师由照本宣科转变为扮演放映员和播音员的角色。学生的学习兴趣不高，教学效果也就适得其反。多媒体和传统教学只有合理地结合，取长补短，才能在课堂教学中体现出其真正的价值。 总之，教学改革的目标是帮助学生建立学科知识体系，培养学生良好的科学素养，提升学生后继学习的能力。正如叶圣陶先生所说：“教师的教学，不在于给学生搬去可以致富的金子。而在于给学生点金的指头。”目前，我们关于分子生物学课堂教学改革还处于不断探索和实践阶段，除了需要不断地提高教师自身的学科修养和科研素质外，也以“夯实基础、拓展知识、增强能力、提高素质”[8]作为教学的目的和人才培养目标，努力在今后把教学工作开展得更加有生有色，为社会培养更多高素质创新型人才。 参考文献： [1]朱玉贤，李毅，郑晓峰，等.现代分子生物学[M].第4版.北京：高等教育出版社，2012：1.[2]戚晓利，张丽敏，薜春梅.分子生物学教学改革的探索[J].生物学杂志，2003，20（6）：51-52.[3]朱虹.《分子生物学》教学改革的实践与思考――启发式教学和论证型教学的综合运用[J].安徽农学通报，2010，16（1）：190-192.[4]许崇波.《基因工程》课程教学改革初探[J].大连大学学报，2005，26（6）：41-43.[5]文静，申玉华，赵冰.高等学校分子生物学教学改革初探[J].吉林农业，2013，305（8）：92-93.[6]王荣，刘勇，姜双林.高等师范院校分子生物学课程教学改革与实践[J].生物学杂志，2012，29（1）：100-102.[7]张金岭.浅谈多媒体教学[J].教育与职业，2009，（30）：189-190.[8]徐启江，李玉花.分子生物学教学改革与高素质人才培养[J].黑龙江高教研究，2007，158（6）：159-161.[9]胡旭东，王晓玲，吕芳昕，等.中医药博士分子生物学进展课程中专题讨论法的应用[J].基础医学教育，2013，15（2）：117-119.[10]赵延林，王敏.大学生创新实验对岩石力学教学的促进作用[J].当代教育理论与实践，2014，6（1）：146-148.第三篇：分子生物学实验讲义
第四篇：分子生物学课程教学大纲
第五篇：分子生物学课程教学改革初探
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