第一篇：基于SSR分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术_图文_百(精)
浙江农业学报 A cta A gricult urae Zhejiangens is 22(6:727~730, 2010 基于 SSR 分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术 鲁忠富 , 徐 沛 , 汪宝根 , 刘永华 , 吴晓花 , 胡婷婷 , 李国景 *(浙江省农业科学院 蔬菜研究所 , 浙江 杭州 310021 收稿日期 :2010-06-17 基金项目 :浙江省科技厅重大优先主题项目(2008C120031 作者简介 :鲁忠富(1963-, 男 , 浙江杭州人 , 农艺师 , 主要从事蔬 菜育种 和栽 培 技术 研究 工作。E m ai:l l u zf @zaas.org;T e:l 0571 86404223 *通 讯 作 者 , 李 国 景 , E m a i :l Guoji ng _li@yahoo.co m.cn;T el(摘 要 :当前生产上应用的长豇豆品种众多 , 且商业品种间的遗传相似性愈来愈高 , 种子质 量纠纷时 有发生。本研究以 44份核 心长豇豆种质为试材 , 利用普通豇豆 DNA 序列 信息 , 通过 生物信息 学方法自主 设计开发适 用于长豇豆研究的 SS R 引物 , 从中筛选出 10对 诊断性引物 , 在此基础上 建立基于 SSR 分子 标记技 术的长豇 豆种子纯度快速检测方 法 , 可满足长豇豆种子产业化的需要。关键词 :长豇豆;SSR;纯度鉴定;遗传指纹图谱 中图分类号 :S 643 4 文献标识码 :A 文章编号 :1004-1524(2010 06-0727-04 A rapid and precise SSR based procedure for seed quality surveying of Vigna un guiculata ssp.sesqui p edalis(L.Verd.L U Zhong f u , XU Pe, i WANG Bao geng , LI U Yong hua , WU X iao hua , Hu T i n g ti n g , LI Guo ji n g *
(Instit ute of Vegetab les, Zhejiang A cade my of A gricult ural Sciences , H angzhou 310021, Chi na Abstrac t :Current applica tion of l a rge nu mber o f comm erc i a l asparagus bean culti va rs w it h v ery hi gh g enetic si m ilar i ty causedm ore andm o re d isputes on seed qua lity.In t h is research , a set of SS R ma rkers for asparagus bean w ere de ve l oped based on a b i o i n f o r m ati cs based approach.T en o f t hese ma rkersw ere defi ned as diagnosti c m arkers by geno typ i ng a core co llecti on o f asparagus bean consisti ng of 44li nes.Based on t h is , a rap i d and prec i se SSR based proce dure f o r asparagus bean seed qua lity survey i ng w as estab lished , w hich wou l d m eet t he de m and o f rap i d l y deve l op i ng asparagus bean i ndustry.K ey word s :asparagus bean;SS R;purity s urvey i ng;genetic fi ngerpri nt 长豇 豆(Vi g na unguiculata ssp.sesqui p edalis(L.V er d.嫩荚供食 , 是 我国重要的夏季豆类 蔬菜之一。我国从事长豇豆育种、种子生产和经 营的科研院所、企业众多。当前生产上应用的长 豇豆品种众多 , 年用种量大 , 商业品种间的遗传 相似性愈来愈高 , 同种异名、同名异种现象日益 严重 , 种子质量纠纷时有发生。目前我国蔬菜品 种真伪与纯度鉴定大多依靠田间表现型鉴定 , 鉴
定所需时间长(一般需 50~60d, 并受季节的限 制 , 而且作物的表现型易随环境条件的变化而变 化 , 特别是对于一些形态差异较小的品种间鉴定 难度更 大。因此 , 很 有必要 研究 开发 一种 能早 期、周年、快速、准确鉴定长豇豆品种真伪和纯度 的检测方法。
DNA 分子标记技术在国内外已被用于鉴别 不同品种 之间在分子水平上的差异
[1-3]。由于
在同一物种的各个品种间存 在有大量的多态性 标记 , 每一品种均存在有区别于其他品种的独特 标记 , 即一些特异性 DNA 片段 , 称为该品种的指 纹 , 各品种独 特的指纹 片段组合 构成该物 种的 DNA 指纹图谱。与传统的依据表型性状鉴定相 比 , 以在植株生长的 任何阶段进行 , 鉴定快速 , 并不 受基因表达和环境条件的影响等优点。
SSR 分子标记技术利用 真核生物基 因组中 存在的大量微卫星重复序列设计引物 , 通过 PCR 扩增串联的重复序列 , 并依据微卫星的重复次数 在同一物种不同基因型间 的差异揭示长度多态 性 [4]。SSR 由于分布广、稳定性和多态率高 , 操 作简单、重复性好、对 DNA 质量要求较低 等 , 被 誉为第二代分子标 记的明星。SSR 分 子标记技 术克服了 RAPD 稳定性和 重复性差 , AFLP 技术 费用昂贵、操作复杂、对 DNA 的纯度和内切酶的 质量要 求很 高等缺 点。为此 , 本 研究 建立 基于 SSR 分子标记技术的种子纯度快速检测方法 , 现 将结果报道如下。材料与方法 1.1 材料
供试材料由浙江省农业科学院蔬 菜研究所 提供 , 共 44份 , 包括我国当前生 产上主栽品种、代表不同地域分布和具有 植物学多态性的材料 37份 , 来自美国和非洲的材料 7份。SSR 反应用 试剂 , T ris、硝酸银、尿素等生化试剂购自北京鼎 国生物技术有限公司 , E co R , M se 内切酶购自 上海生物工程技术有限公司 , Taq 酶、dNTP 等购 自 Pro m ega 公司。
1.2 方法
1.2 1 豇豆 DNA 数据库 的下载、序 列处 理和 SSR 引物设计
从 CGKB 数 据 库(http ://co w peageno m ics.m ed.v irg i n ia.edu /CGKB/下载豇豆基因组序列 , 从 H ar vEST 数据库(http ://harves.t ucr.edu /下 载长豇 豆 EST
序 列;运 行 V ecScreen 程 序(ht tp ://www.xiexiebang.comb i nati ons for as paragus bean 序号 引物名称 正向序列(5∃-3∃ 反向序列(5∃-3∃
1CPL031CGCTCTTCGTTGATGGTTATG GTGTTCTAGAGGGTGTGATGGTA 2CPL053ACAGGTTCCTTGTGAAGCAC GCCATACGCAACTCAGCTAT 3CPL078GAACAGCTTCCTGAACCTCA GCTTTCATCTGCTCCAGGTA 4CPL112AACCCAGCATACCTGCATAA CTCGCCAATGATTCTGAGAT 5CPL114AATGTTTGGACTGGTCAGGA GAGGACAAGTCAGGAAGCAA 6CPL135GGTGGAAATCAGGTTGTTTG AGCCAATTGTCAAGTTCAGC
7CPL333TCGATCAAATTTTCCTCTGC TGCCACCATCTTTCATTTCT 8CPL420CGCGTACAACATCTCTTCCT GTGCCAATGGATCAGGTAAC 9CPL840TAGCATAGAAGAAGCAATCGT CTGGAATCTGGAAGGAGAA 10 CPL865 CTCTCTCTCTCCACATCTCAA
CATCATCAATCACACAACTTC M.DNA M aeker;1.CPL112;2.CPL053;3.CPL114;4.CPL031;5.CPL135;6.CPL840;7.CPL420;8.CPL865;9.CPL078;10.CPL333;箭头示各品种 DNA 指纹的主要差异之处
图 1 我国 5个长豇豆主栽品种的标准 DNA 指纹 图谱
F ig.1The standard DNA fi ngerpr i nts o f 5m a i n cu lti vars o f asparagus bean i n China % 729%鲁忠富等 :基于 SSR 分子标记技术的长豇豆种子纯度快速鉴定技术 增出的条带数差异性大 , 特别是 #黑眉 ∃ 与其他 4品种间差异大;不同品种间差异 性条带数不同 , #之豇 106∃ 与 #扬早豇 1号 ∃ 之间差异条带数在
13条以上 , 完全可满足区分不同品种的要求。
2.3 基于 SSR 分子标记技术的豇豆种子纯度快 速检测方法
利用以上研究开发出的诊断性 SSR 引物进 行长豇豆种子纯度检测 , 其主要步骤包括 : &DNA 提取 :将待检种子散播于 装有基质 V(蛭石 V(泥炭 =12的育苗穴盘中 , 置于 25 ~30!下育苗 , 待第一对真叶平展时 , 单株取叶 片 0 1g , 加液氮研磨成粉末 , 用常规 CTAB 法提 取 DNA。∋ SSR 引物扩增 :用上述 10对诊断性 SSR 引物进行 PCR 分析 , 反应体 积为 12 5 L , PC R 反应程 序同上。(电泳检 测 :将扩 增产物 在 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离 , 然后进行银染显 色 , 数码相机照相记录结 果 , 获 得待检材料的 DNA 指纹图谱。DNA 指纹图 谱比对 :将待检材料的 DNA 指纹图谱 与该品种 标准 DNA 指纹图谱进行 比对 , 如两者 的指纹图 谱完全相吻合 , 则该待检材料为真种子 , 否则为 伪种子。对于没有标准图谱的品种 , 按同样方法 先建立标准图谱。∗ 种子纯度计算 : 种子纯度 =(检测所得真种子数 /检 测种子 总数 ∀ 100% 3 讨论 本研究的特点 :
(1 应用自主开发和筛选出的 10对诊断性 SSR 引物组合 , 增强了鉴别近似品种的能力。经 过理论计算、近似品种扩增比较(图 1 及大量检 测实践证明这套引物能有 效区分长豇豆不同基 因型 , 完全可以满足对当前生产上主要长豇豆品 种进行真伪检测的需要。
(2 直接鉴定遗传物质 , 大大提高了鉴定的 准确性。本研究使种子纯度的鉴定在 DNA 水平上进行 , 避免了表型鉴定、生化 鉴定等间接鉴定 方法所可能带来的误差 , 有操作方便 , 重复性好 的特点 , 具有高度的可靠性和权威性。
(3 提 高了检测的效率和标准化程度。利 用本技术进行种 子纯度检测 , 其结果稳 定可靠 , 易于实现标准化 , 检测时间仅需 4~5h , 一次可 对多达上百份样品同时进行检测。一般种子质 检室只需具备常规的分子生 物学设备就可按提 供的操作 程序进行 实际检测 , PCR 反应各 组分(MgC l 2, Bu ffer , d NTP , Taq 酶 购置方便 , 检测成 本低廉 , 仅为传统表型鉴定的六分之一左右。认 为该技术完全可用于生产上 种子纯度快速鉴定 的需要。
参考文献 : [1] 王玲平, 戴丹丽 , 吴晓花 , 等.AFLP 分子标记技术在浙蒲 2号种子纯度快速鉴定中的应用 [J].浙江农业学报 , 2008, 20(2:84-87.[2] 翟文强 , 田清 震 , 贾继增 , 等.哈密瓜杂交 种纯度的 AFLP 指纹鉴定 [J].园艺学报 , 2002, 29(6:587.[3] 李丽 , 郑晓鹰.AFLP 分子标 记应用 于白菜 品种 鉴定 [J ].分子植物育种 , 2006, 4(5:685-689.[4] K antet y RV, La RotaM, M att h e w s DE, et a.l Datam i n i ng f or si m p l e sequen ce repeats i n expressed sequen ce tags fro m bar ley , m ai ze , rice , sorghum and w heat [J ].P lant M ol ecular B iol ogy , 2002, 48:501-510.[5] M u rry HG, Tho m pson W F.Rap i ds i solati on of h i gh m olecu l ar w eight p l an t DNA [J ].Nucle i c A ci d s R ese a rch , 1980, 8: 4321-4325.[6] Bass a m BJ , Caetano Anoll G, G resshoff P M.Fast and sen si tive silver st a i n i ng ofDNA i n polyacry l a m i de gels [J].Ana l yt ical B ioc h e m istry , 1991, 196:80-83.[7] 许绍斌 , 陶玉 芬 , 杨 昭庆 , 等.简单 快速的 DNA 银 染和 胶 保存方法 [J].遗传 , 2002, 24(3:335-336.(责任编辑 张 韵 % 730 %浙江农业学报 第 22卷 第 6期(2010年 11月
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