小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

第一篇：小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

一、实验材料 1．主要仪器设备

倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2．试剂

RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．实验动物

孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。

二、实验步骤

1.获取小鼠胚胎

(1)取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上

(2)75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。(3)用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。

(4)在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。

(5)将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

(6)将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。

(7)将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

2.小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）

(1)将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成约1 mm3以下的碎块。

(2)用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。

(3)室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。

(4)向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。

(5)加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。

(6)每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。(7)做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。

(8)培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。

第二篇：MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结（精选）

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

2008-06-19 00:00 来源：丁香园

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知识总结

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1517 关键词： MEF小鼠 胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的富集

1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。

4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。

5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。

6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。

8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。

9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。

10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。

12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。

13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。

注释：

我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。

培养基成分：

88％ DMEM 10％ FBS 1％ NEAA 1% 双抗

对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。

小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代

1、移去MEF培养基

2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。

6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。

7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。

8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。

注释：

MEF培养基成分：

89% DMEM(Gibco # 12100-046)10% FBS(Gibco # 16000-044)1% NEAA(Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。

小鼠胚胎成纤维细胞的冻存

重悬培养基：

80% DMEM 20% FBS 1% NEAA 冻存培养基：

60％ DMEM 30％ FBS 20％ DMSO

1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。

3、将细胞吹打下来。

4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大块组织。如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。

7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。

8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。现在DMSO的浓度是10％。

9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。

10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）

11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。注释：

提前标注好冻存细胞的以下信息：

细胞系名称

传代的代数

冻存细胞的数目

日期

Initials 注明冻存/解冻形式

小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏

1、将冻存瓶从液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培养基。这一步操作不能少于两分钟。做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。6、1000rpm离心5min。

7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。

8、放入37℃培养箱。

9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。

1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。

2、关于提取MEF的比较好的protocol

3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。

4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：

（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。会造成control 相对不一致。

（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。

网友crepi 的观点：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 个人觉得无碍 我倒更喜欢大一点的胚胎 更好操作一点

2、我取的是皮肤 然后胰酶4度消化过夜 第二天终止消化 撕掉表皮 留下真皮 减碎 用的100目滤网过滤 这个胰酶消化的时间是个关键 时间长了 细胞容易死 时间少了，表皮不容易揭下来 我有此就是这样 消化了15个小时 结果接种下来的细胞不能贴壁 全死了

3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清 培养液也是关键 因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣 但总归是原代 可能还是比较娇嫩 我前几天就是这样 后来发现是培养液出的问题 测的PH值都8.3了 细胞不死才怪 毕竟细胞耐酸不耐碱

4、原代培养的最大天敌还是污染

网友baichangming的观点：

MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。我的血清浓度一般是16.66666%。

网友北羽迦楼的观点： 细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以内做。

我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。因为健康的MEF就是易消化易贴壁。老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。

附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。

第三篇：体外受精与早期胚胎培养教学设计

一、学习目标

1.简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。

2.简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。

3.认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。

二、教学建议

1.课时数:本节教学建议用2课时。

2.课时侧重点:

(1)体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。

(2)哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。

3.教学策略

教学过程一定要根据学生的具体情况、教材的内容、教学的条件综合考虑进行。本节教材是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上,着重简述哺乳动物体外受精和胚胎早期培养的技术方法。本节内容简单,学生通过阅读基本能明白。另外,由于所讲内容技术性较强,与学生的生活相距较远,不易引起学习兴趣,所以教师可采用探究式的学习方法,以“试管牛”为例,创设出一种新的学习情景,在教师的带领下,让学生以胚胎工程学家的身份出现,亲历其境地去思考和探究“体外受精和早期胚胎培养”的过程,领悟其探究的方法,以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。对具体的教学方法建议如下。

教师课前搜集有关“试管牛”技术及其发展的资料,并制作“利用屠宰厂牛卵巢收集卵母细胞,并工厂化生产试管胚胎”的计算机辅助教学软件(或投影片)。同时,教师布置学生搜集有关“试管牛”的资料。

在课堂活动中,教师首先提出问题:“你听说过试管牛、试管羊吗?你知道什么是试管动物技术吗?”从而引出试管动物技术的概念及体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义,提出本节主题。

第四篇：2015高中生物 3.2体外受精和早期胚胎培养教学案 新人教版选修3

A．假阴道法 C．电刺激法

B．手握法 D．化学诱导法

()5．精子获能的常用化学物质可能是下列哪一种

A．氯化钙溶液

C．肝素溶液

B．肝脏提取液 D．氨基酸营养液

()6．试管牛采用的技术是

①胚胎移植 ②基因工程 ③体外受精 ④克隆技术 A．①③

B．②③

C．①②

D．①④

()7．下列各组物质组成不全部属于哺乳动物胚胎培养液成分的是 A．氨基酸、核苷酸、无机盐、激素 B．血清、激素、维生素、有机盐 C．核苷酸、维生素、血清、无机盐 D．有机盐、维生素、氨基酸、生长素 8．关于早期胚胎培养的说法，不正确的是

A．发育培养液的成分通常含有血清

B．发育培养液的成分较一般动物细胞培养液的成分简单 C．动物种类不同，进行胚胎移植的早期胚胎所处阶段不同

()D．进行胚胎移植之前，可将培养到适宜时期的早期胚胎进行保存

9．以下是制定并研究设计的“试管牛”工厂化生产技术流程，其中正确的顺序应是()①卵母细胞的采集和培养 ②精子的采集和获能 ③画出“试管牛”工厂化生产技术流程图 ④受精 ⑤胚胎的早期培养 A．①②③④⑤

C．①②④③⑤

B．①②④⑤③ D．①②⑤④③

()10．下列关于培育试管婴儿的叙述，不正确的是

A．培育试管婴儿要进行体外受精过程 B．试管婴儿的发育场所主要在试管内 C．试管婴儿的发育场所主要在母体内 D．试管婴儿具有双亲的遗传特性 11．哺乳动物体外受精的过程是()

①采卵 ②收集精子 ③卵母细胞的人工培养 ④精子获能处理 ⑤精子和成熟卵子在受精液中共同培养 ⑥精子用CaCl2处理 ⑦卵母细胞用一定浓度的肝素溶液处理 ⑧体外受精 ⑨受精卵培养 A．①→②②→⑥⑤⑧⑨ B．①→③②→④⑤⑧⑨ C．①→⑦②→④⑧⑤⑨ D．①→③②→⑥⑧⑤⑨

12．早期胚胎体外培养的过程中，下列哪一项条件是不需要的

A．消毒灭菌 C．充足的光照

B.适宜的温度 D．适宜的养料和激素

()

()13．关于牛体外受精胚胎的工厂化生产，叙述正确的是

A．精子和卵子受精形成受精卵后可移入母牛子宫

B．采集的卵母细胞应立即与精子共同放入培养液才能形成受精卵

C．成熟卵子与收集来的精子相遇形成的受精卵，需培养到一定阶段才可移植 D．体外受精胚胎的工厂化生产即胚胎发育和受精过程只需在体外进行 14．回答关于“试管牛”培育的几个问题。

(1)刚刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物的生殖道内或体外类似于生殖道的理化条件下发生相应的生理变化后，才能获得受精能力，这一现象叫__________。(2)生产上常用__________激素促进雌性动物排卵，该激素由__________(器官)分泌。(3)受精后的卵细胞在培养液中进行培养，形成了一个约32个细胞的小胚胎，此时受精卵大约经历了__________次细胞分裂，培养液必须含有的不同于植物培养基的成分是__________________。

(4)试管牛培育过程涉及的工程技术手段主要有

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。15．据早期胚胎发育的过程，回答下列问题：

①受精卵→②卵裂期→③__________→④__________→⑤原肠胚→⑥幼体(1)③、④分别是胚胎早期发育的什么阶段？(在横线上填出)(2)③阶段细胞达32个左右，此时细胞属于________细胞，具有__________性。(3)④阶段细胞开始出现__________，__________将来发育成胎儿的各种组织，______________将来发育成胎盘和胎膜，出现______腔后，进一步扩大会导致__________的破裂。

(4)⑤原肠胚阶段内细胞团的__________细胞形成外胚层，下方的细胞形成内胚层，出现________腔。

(5)从受精卵到原肠胚的形成，细胞的分裂方式是______________。16．请回答胚胎工程和基因工程方面的问题。

(1)应用胚胎工程技术可以培育出“试管牛”。试管牛的培育需经过体外受精、________________________、______________以及在母体中发育和产出等过程。(2)在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子进行处理，使其__________。另外，培养的卵母细胞需要发育至减数第二次分裂的中期，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和___________________________________。(3)通常奶牛每次排出一枚卵母细胞，采用激素处理可使其一次排出多枚卵母细胞，常使用的激素是______________。

(4)利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。基因工程的四个基本操作步骤是______________、基因表达载体的构建、______________________和______________________。若要使获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、________________、________、____________和复制原点等。将该基因表达载体导入受体细胞所采用的方法是______________(显微注射法、农杆菌转化法)，为获得能大量产生人干扰素的基因牛，该基因表达载体应导入的受体细胞是______________(受精卵、乳腺细胞)。

答案

1．D 2．B 3．D 4．C 5．C 6．A 7．D 8．B 9．B 10．B 11．B 12．C 13．C 14．(1)精子获能(2)促性腺 垂体(3)5 动物血清(4)体外受精、胚胎的早期培养和胚胎移植

15．(1)桑椹胚 囊胚(2)全能干 全能(3)分化 内细胞团 滋养层细胞 囊胚 透明带(4)表层 原肠(5)有丝分裂 16．(1)早期胚胎培养 胚胎移植

(2)获能 第一极体

(3)促性腺激素(其他合理答案也可)(4)获取目的基因 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 人干扰素基因(或目的基因)终止子 标记基因 显微注射法 受精卵

第五篇：2017-2018年高中生物专题3胚胎工程3.2体外受精和早期胚胎培养检测新人教版选修3课件

专题3 胚胎工程 3.2 体外受精和早期胚胎培养

1．精子获能的常用化学物质可能是下列哪一种()A．氯化钙溶液

C．肝素溶液

B．肝脏提取液 D．氨基酸营养液

解析：精子体外获能的方法有培养法和化学诱导法两种。化学诱导法即将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，使用化学药物诱导精子获能。

答案：C 2．哺乳动物体外受精的过程是()①采卵 ②收集精子 ③卵母细胞的人工培养 ④精子获能处理 ⑤精子和成熟卵子在受精液中共同培养 ⑥精子用CaCl2处理 ⑦卵母细胞用一定浓度的肝素溶液处理 ⑧体外受精 ⑨受精卵培养

解析：无论是采集的卵子还是精子，在受精以前必须经过处理，在受精溶液中培养成具有受精能力的成熟生殖细胞，然后才能进行体外受精。

答案：B 3．爱德华兹以他在体外受精技术领域做出的开创性贡献而获得2010年诺贝尔生理学或 医学奖。关于体外受精技术叙述正确的是()A．获取的精子经获能后才能进行体外受精

B．采集的卵母细胞应立即与精子共同放入培养液中才能形成受精卵 C．精子和卵细胞受精形成受精卵后即可移入母体子宫 D．精子与卵子相遇后，会发生顶体反应，防止多精入卵

解析：B错误，卵子必须处于减数第二次分裂中期才能进行受精，采集的卵母细胞都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精；C错误，成熟的卵细胞与收集来的精子相遇形成受精卵，需培养到一定阶段才可移植；D错误，防止多精入卵主要通过透明带反应和卵黄膜封闭作用两道屏障。

答案：A 4．下图表示通过体外受精培育试管牛的过程，下列叙述错误的是()

A．获取的精子经获能后才能进行体外受精 B．②过程只与细胞膜的流动性有关 C．③过程的细胞增殖方式一定是有丝分裂 D．④过程属于胚胎移植过程

解析：获取的精子必须要经过获能后才能进行体外受精，A正确。②表示受精作用，精子释放顶体酶后，穿越放射冠和透明带，精子入卵后，形成雌雄原核，最后雌雄原核融合形成合子，因此受精过程不仅仅与细胞膜的流动性有关，B错误。③表示受精卵的卵裂，其方式为有丝分裂，C正确。④表示将发育成的早期胚胎移植入母体，D正确。

答案：B 5．控制哺乳动物的性别对于畜牧生产有着十分重要的意义。目前，分离精子技术是有效的性别控制方法。例如：牛的含X染色体的精子的DNA含量比含Y染色体的精子的DNA含量高出4%左右，利用这一差异人们借助特殊仪器将它们分离开来，再通过胚胎工程技术就可培育出所需性别的试管牛(如下图所示)。

根据以上信息回答下列相关问题。

(1)试管动物技术通常是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下________和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经胚胎移植产生后代的技术。

(2)图中①中采集精子时，常采用________法，获得的精子经________________________ 方法处理后才能进行受精过程。

(3)图中过程③通常采用________技术。在这个过程中________的精子与卵子相遇时，首先发生________反应释放出有关的酶直接溶解卵丘细胞之间的物质。防止多精入卵的生理反应有_____________ _____________________________________________________。

解析：试管动物的产生过程是通过人工操作获取精子和卵子，并使它们在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，经胚胎移植而产生后代，试管动物可以有选择性地获得所需性别，需对早期胚胎进行检测。

答案：(1)成熟(2)假阴道 化学药物(一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液)诱导(3)体外受精 获能 顶体 透明带反应和卵细胞膜反应

A级 基础巩固

1．可以与获能精子进行体外受精的卵母细胞需要培养到什么时期()A．MⅠ

C．桑葚胚期

B．MⅡ D．囊胚期

解析：卵母细胞要培养到MⅡ中期时就可以受精了，因为MⅡ中期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而MⅠ期卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育。

答案：B 2．发展试管动物技术具有重要意义，下列关于这方面叙述错误的是()A．试管动物技术可解决动物生育率低的问题

B．试管动物技术可以更多、更有效地利用动物卵母细胞 C．试管动物技术可以通过普通家畜繁育良种家畜 D．试管动物技术不能实现家畜的快速繁殖

解析：试管动物技术能够将优良品种的雌雄生殖细胞体外受精并发育成一个个小胚胎，然后将这些小胚胎移植到普通个体子宫内“借腹怀胎”，从而实现家畜的快速繁殖，也能够解决动物生育率低的问题。

答案：D 3．良种试管牛的繁殖过程是：用激素促进甲牛多排卵，然后把卵子在体外与人工采集的乙牛的精子进行受精，在特定培养基中培育成胚胎，再把胚胎送入经过激素处理的丙牛的子宫内，孕育成试管牛。下列相关叙述错误的是()A．精卵结合前都需进行培养

B．“促进甲牛多排卵”的激素是孕激素 C．甲牛、乙牛对试管牛核遗传物质的贡献相同 D．该技术可应用于加快优良种畜的繁殖

解析：对于从大型动物采集的卵母细胞。都需经体外人工培养成熟后，才具备受精能力；精子也需要进行培养使其获能，A项正确。促进动物多排卵的激素是促性腺激素，B项错误。试管牛的核遗传物质一半来自甲牛的卵子，一半来自乙牛的精子，C项正确。该技术可充分发挥母畜的优良特性，可用于加快优良种畜的繁殖，D项正确。

答案：B 4．试管婴儿、试管苗和克隆羊这三者可以说是现代生物科技的杰出成果，下列对其生物学原理及技术的叙述，正确的是()A．都属于无性生殖

B．都属于细胞工程的技术范畴 C．都不会发生基因重组

D．都体现了分化的细胞具有全能性

解析：试管婴儿的原理为有性生殖，其精子和卵细胞经减数分裂形成过程中都会发生基因重组，但该过程需要动物细胞培养和胚胎移植等技术；试管苗是植物组织培养的结果，体现了植物细胞的全能性；克隆羊利用了核移植技术，体现了动物细胞细胞核的全能性。

答案：B 5．培育“试管山羊”的基本过程如下图所示，若要培育成功，下列叙述正确的是()

A．甲过程中可通过给母山羊注射有关激素使其超数排卵 B．乙过程的目的之一是促进卵母细胞和精子的成熟 C．丙过程与乙过程中应采用相同成分的培养液

D．丁过程中早期胚胎需移植到与供体性状相同的代孕母羊子宫内

解析：甲为获取卵母细胞的过程，用促性腺激素处理母山羊，使其超数排卵；乙过程的目的之一是促进卵母细胞成熟和使精子获能，利于精卵细胞结合，而不是使精子成熟；乙过程中使精子获能需要获能溶液，丙过程为培养早期胚胎，需用发育培养液，两者成分不同；丁过程中早期胚胎需移植到与供体生理状态相同而不是性状相同的代孕母羊子宫内。

答案：A

B级 能力训练

6．如图是“试管牛”工厂化生产的技术流程图，据图完成下列问题。

(1)根据______(填标号)判断，此种繁殖方式是________生殖，其意义在于_________________________________________________ ______________________________________________________。

(2)①过程通常每个卵巢平均可采集________枚可用的卵细胞，最终可能产下________头犊牛。

(3)②过程通常采用________法。

(4)④过程一般要经历哪几个时期？_______________________ ______________________________________________________。

解析：精子和卵子在体外培养条件下受精形成受精卵，并发育成胚胎，属于有性生殖。目前，从屠宰场废弃的卵巢中，每个卵巢平均可采集10枚可用的卵母细胞，经体外培养成熟和受精后，约可获得4枚可用的胚胎，经过移植给受体母牛，最终可得到1～2头犊牛。对于牛、羊等家畜的精子常采用化学法使其获能。体外胚胎大约培养到囊胚期左右移植到母体。

答案：(1)③ 有性 快速大量繁殖良种牛，提高经济效益(2)10 1～2(3)化学(4)受精卵、卵裂期、桑葚胚期、囊胚期

7．某医院一名试管女婴出生，该女婴的父母身体健康。女婴的母亲7年前生下一男婴，孩子1岁后发病夭折。5年后，她第二次怀孕，怀孕6个月时，到医院抽羊水及脐带血诊断，发现胎儿是男孩，却是血友病患者，于是引产。夫妇二人最后来到医院做试管婴儿。医生培养了7个可做活体检查的胚胎，并抽取每个胚胎1～2个细胞进行检查后，选择了两个活体胚胎进行移植，最后一个移植成功。

据此资料回答下列问题：

(1)试管婴儿技术作为现代生物技术和母亲正常怀孕、生产的过程的相同之处是__________________；不同点在于_______________ ______________________________________________________。

(2)血友病是伴X染色体的隐性遗传病，如果用B和b分别表示正常基因和血友病基因，则父母亲的基因型分别是________和________。医生抽取胚胎的1～2个细胞后，可通过观察性染色体形态判断早期胚胎的性别，你认为医生应选用________性胚胎进行移植，原因是________________________________________________ _____________________________________________________。

解析：(1)试管婴儿技术和母亲正常怀孕、生产过程都包括精子与卵细胞结合形成受精卵的过程，都属于有性生殖过程。(2)根据题意可知，男孩患病而亲代正常，则父母的基因型分别为XY和XX，在移植时选用女性胚胎，由于该胚胎从父亲那里接受X基因，则后代一定表现正常。

答案：(1)双亲产生的两性生殖细胞融合为受精卵 试管婴儿是“体外受精”后产生的受精卵经初步发育后，再进行“胚胎移植”的产物

(2)XY XX(顺序不能颠倒)女 女性胚胎从父亲那里接受X基因，表现型正常 8．下图为培养“转基因试管牛”的基本过程示意图，请据图回答下列问题：

BBb

BBBb

B

(1)A过程一般用________激素处理供体母牛，使其超数排卵，此前需用激素对供体母牛和代孕母牛进行________处理。

(2)采集到的精子在进行体外受精前必须进行________处理，采集的卵母细胞也需要培养至________期才能受精。

(3)B过程通常用________法将含有抗凝血酶基因的表达载体导入受精卵，这样培育出来的试管牛进入泌乳期后，即可从其乳汁中分离出来所需的________这一药用蛋白。

解析：(1)通常采用孕激素对供体母牛和代孕母牛进行同期发情处理，这样才能使供体的胚胎移入受体后有相同或相似的生存和发育条件，这也是胚胎移植成功与否的关键。其后还要用促性腺激素处理供体母牛，使其超数排卵。(2)采集到的精子必须进行获能处理，卵母细胞也需要培养至减数第二次分裂中期才发育成熟，具备受精的能力。(3)将目的基因注入动物细胞常用显微注射法，所培育的转基因牛的乳汁中将表达出该目的基因的产物——抗凝血酶。

答案：(1)促性腺 同期发情(2)获能 减数第二次分裂中(3)显微注射 抗凝血酶

9．2015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。

据图回答下列问题：

(1)由于女性的自然周期产生的卵子太少，捐献者在取卵前通常需要注射________激素，促使一次有更多的卵泡发育。

(2)重组细胞需培养到MⅡ中期的原因是该时期的卵母细胞才具备________，重组细胞体外培养所需的气体主要是

O2和

CO2，CO2的主要作用是_____________________________________________。

(3)从受精卵到三亲婴儿的培育还需要______________和____________等技术。(4)三亲婴儿的培育技术________(填“能”或“不能”)避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代，而________(填“能”或“不能”)避免母亲的红绿色盲基因传递给后代。三亲婴儿的染色体________(填比例)来自母亲提供的细胞核。

答案：(1)促性腺

(2)(与精子)受精的能力 维持培养液的pH(3)早期胚胎培养 胚胎移植(4)能 不能 1/2(或50%)