‘黄花梨’2个?CYP707A?基因的克隆和序列分析

第一篇：‘黄花梨’2个?CYP707A?基因的克隆和序列分析

龙源期刊网 http://www.xiexiebang.com：8004/）获得同源序列；将同源序列返回到NCBI网站在线blast验证；而后以梨基因组CDS数据库得到的2条序列为参照，设计引物。PCR反应体系25 μl（模板1 μl，10 μmol/μl上游引物1 μl，10 μmol/μl下游引物1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10×ExTaq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EXTaq 0.15 μl，ddH2O 1835 μl），目的基因扩增引物见表1。以„黄花梨‟花芽总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序：94 ℃预热5 min；94 ℃变性45 s，48～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min；共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。凝胶电泳检测PCR扩增产物（图1），并切下1 400 bp左右的目的条带，经胶回收（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中国北京）纯化，连接到PMD18T（Takara，中国大连）上，后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，在AMP培养基培养大肠杆菌，将菌液PCR鉴定的阳性克隆送至英潍捷基贸易有限公司（中国上海）测序。2 结果与分析

2.1 „黄花梨‟CYP707A基因的克隆从„黄花梨‟花芽上克隆得到2个CYP707A基因序列，通过DNAMAN比对，发现两者之间的相似性高达94.27%（图2），氨基酸相似性94.96%。为此，从梨基因组数据库找到2个基因的内含子和外显子基因组序列进行比对，结果显示其相似性为69.95%，说明这2个CYP707A基因为相似性较高的不同基因。将克隆到的„黄花梨‟CYP707A 基因分别定名为PpCYP707A4（Genbank登录号：KP279630）、PpCYP707A5（Genbank登录号：KP279631）。

PpCYP707A4的CDS序列全长为1 431 bp，编码476个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008346457.1）相似性97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）

龙源期刊网 http://www.xiexiebang.com 相似性90%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性87%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性83%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性84%。

安徽农业科学2015年PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008382035.1）相似性 97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）相似性89%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性86%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性84%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性85%。

在线blastp分析，2个PpCYP707As基因均具有1个保守结构域，为PLN02196（图3），属于P450超基因家族。以PpCYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作为参考，从NCBI数据库上blast其他物种的CYP707A氨基酸序列，构建系统发育树。仅苹果blast到2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1），其他物种均只blast到1个基因。系统发育树分析显示（图4），蔷薇科植物的CYP707A基因聚为一大支，PpCYP707A4与苹果XP_008346457.1基因，PpCYP707A5与苹果XP_008382035.1基因单独聚类。

注：a.„黄花梨‟总RNA； b.PpCYP707A4 PCR扩增； c.PpCYP707A5 PCR扩增。

图1电泳图谱图22个PpCYP707As的核苷酸序列比对注：a.PpCYP707A4蛋白的保守结构域； PpCYP707A5蛋白的保守结构域。

图3蛋白保守结构域图42个PpCY707As系统进化树2.2蛋白性质预测采用ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1预测蛋白性质和Prot预测亚细胞定位，结果显示，PpCYP707A4蛋白的理论分子质量为54.4 kDa，理论等电点为9.01，不稳定系数为48.48，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2493H3901N645O679S20，原子数7 338，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸50，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为9239，GRAVY为-0.100，是亲水性蛋白；在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～26位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构；不含信号肽，为非分泌蛋白；并定位在内质网，概率为0.820。PpCYP707A5蛋白的理论分子质量为54.1 kDa，理论等电点为9.03，不稳定系数为47.78，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2481H3874N640O673S21，原子数7 689，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸49，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为91.96，GRAVY为-0.089，是亲水性蛋白。在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～27位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构。与PpCYP707A4蛋白相同，也不含信号肽，为非分泌蛋白；定位在内质网，概率为0.820。

2.3蛋白结构预测采用Npsa-pbil、NetPhos 2.0 Server在线工具预测蛋白质二级结构、磷酸化位点。PpCYP707A4有243个氨基酸残基形成α-螺旋，32个形成β-螺旋，78个形成延伸链和132个形成无规则卷曲；有12个丝氨酸（serine，S）残基、7个苏氨酸残基（threonine，龙源期刊网 http://www.xiexiebang.com T），2个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。PpCYP707A5有226个氨基酸残基形成α-螺旋，27个形成β-螺旋，81个形成延伸链和140个形成无规则卷曲；有13个丝氨酸（serine，S）残基、6个苏氨酸残基（threonine，T），3个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。Swiss-model预测蛋白三级结构，结果显示PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的QMEAN4值分别为-5.67、-4.79，三级结构存在较大差异（图5）。

注：a.PpCYP707A4蛋白三级结构； b.PpCYP707A5蛋白三级结构。

图5预测的2个PpCYP707A蛋白三级结构3 讨论

休眠的长短决定落叶果树的地理分布，是落叶果树的重要性状之一[7]。我国梨的种质资源大体分为北方品种群和南方品种群，北方品种群的特点为抗寒力较强、休眠期较长，南方品种群表现出早熟、休眠期短等优势[8]。„黄花梨‟在福建省建宁县能够正常开花结果，产量较大，而在纬度较低的福建省上杭县其萌芽不整齐的现象明显，休眠期的长短对于„黄花梨‟的产量和栽培具有重要的制约作用，休眠影响梨品种的选育和梨产业的发展，研究梨的休眠意义重大。对桃[3]、大樱桃[9-10]、欧洲甜樱桃[11]、葡萄[12]、牡丹[13]等的研究表明ABA的含量变化是影响木本植物芽休眠进程的重要因素。从分子水平探讨ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制，将有利于构建梨休眠的调控网络，从而有助于梨品种的选育。

该研究从„黄花梨‟上分离到ABA分解途径关键酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息学方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，构建相关系统发育树并预测蛋白结构。分析结果显示，PpCYP707A4与PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度较高，为94.27%和94.96%，两者蛋白理化性质相近，符合家族基因的特点。系统进化树显示，„黄花梨‟的PpCYP707A4和PpCYP707A5与苹果的2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1）分别单独聚类，而非PpCYP707A4和PpCYP707A5独自聚类。对苹果[14]、大豆[15]、剑兰[16]的研究结果也显示CYP707A家族基因在系统发育树并未单独聚为一类而是分散到几类中。梨基因组数据发表后，Wu等[17]认为蔷薇科的染色体是由祖先7个染色体发展形成的，梨和苹果基因组之间具有高共线性。该研究克隆的2个基因很可能产生于梨和苹果的共同祖先，而后遗传给梨和苹果。CYP707A是一个多基因家族，它们在不同组织中的转录模式不同[2]，以功能交迭的方式参与环境胁迫应答[4，18-19]、休眠解除[20]等不同的生理反应过程，共同调控植物体内源ABA的分解。因而，需进一步研究该基因家族各基因的特性，研究它们的生物学功能，为开展„黄花梨‟花芽休眠的研究提供信息，为短低温梨品种的选育奠定基础。

参考文献

[1] 廖光升.黄花梨低温需冷量研究[J].落叶果树，2010（1）： 4.[2] 许智宏，薛红卫.植物激素作用的分子机理[M].上海： 上海科学技术出版社，2012： 67-69.龙源期刊网 http://www.xiexiebang.com [3] 王海波，高东升，王孝娣，等.赤霉素和脱落酸与桃芽自然休眠诱导[J].果树学报，2006，23（4）： 599-601.[4] SAITO S，HIRAI N，MATSUMOTO C，et al.Arabidopsis CYP707As encode（+）-abscisic acid 8′-hydroxylase，a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid[J].Plant Physiology，2004，134（4）： 1439-1449.[5] NAMBARA E，MARION-POLL A.Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J].Annu Rev Plant Biol，2005，56： 165-185.[6] KUSHIRO T，OKAMOTO M，NAKABAYASHI K，et al.The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8′‐hydroxylases： key enzymes in ABA catabolism[J].The EMBO Journal，2004，23（7）： 1647-1656.[7] 王海波，高东升，王孝娣，等.落叶果树芽自然休眠诱导的研究进展[J].果树学报，2006，23（1）： 91-95.龙源期刊网 http://www.xiexiebang.com

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第二篇：散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析开题报告

散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析

一、选题依据

1、论文题目及研究领域

论文题目：散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析。

研究领域：林木病理学。

2、论文研究的理论意义和应用价值

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病，该病害对整个林业生态工程建设、产业化发展造成了严重影响，该研究主要为林木病害的防治和对散斑壳属病菌的进一步研究、利用提供理论依据。

3、目前研究的概况和发展趋势

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病害，寄主包括多种松树，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落叶松Larix等属22个种3个变种和1个栽培变种[1]。该病害从幼树到大树均可侵染，在幼树龄中严重发病时，引起松叶提前脱落，引向树木生长，甚至导致树木死亡，曹成严重的经济损失，这类病在我国也普遍发生，且历史悠久，但长期以来该病害只是被当作一般性的也部病害来对待，没有受到应有的重视，也少有深入细致的研究[2]。但从70年代才有了较系统的研究，目前对该病的研究已有160多年的历史。它隶属于子囊菌亚门Ascomycotina ,盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]。散斑壳属是1826年正式建立的，现已成为斑痣盘菌科中的第一大属，全球共有103余种被报道[4]。该病在Minter(1981)记载松树上有散斑壳l6个种，其中Lophodermium Seditiosum 引起二、三针松落针病。我国曾记载引起樟子松落针病的病原菌为橙针散斑壳茸Lophodervnium pinas，何秉章(1985)报道了在大兴安岭引起樟子松苗木落针病病原菌为扰乱散斑壳菌I ．seditiosum，其无性阶段为Leptostroma rostrupil，同时对该病的症状、侵染循环、流行规律进行了研究，筛选出以7j 百菌清可湿性粉剂防治效果最好[5]。至目前为止，其无性阶段是否有侵染作用在国内外还没有一致结论，尚有待进一步研究。1981年，Minter对松树上的散斑壳(LD D，mim Chev．)进行了较系统的分类研究，共承认16个种。近年Minter＆Sharma(1982)、Cannon＆Minter(1986)分别报道了库曼散斑壳(L．kumaunicum Minter＆M．P．Sharma)和喜马拉雅散斑壳(Lhimalayense P．F．Cannon＆Minter)。在我国戴芳澜(1979)、何秉章等(1985，l986),林英任、唐燕平(1988)、曹支敏等(1990)先后记载国内松树上有松针散斑壳(L．pinas sri(Schrad．)Chev)、大散斑壳(L．maximum B．Z．He et Yang)、安徽散斑壳(L．anhuiense Y，R．Lin)和L．toolitori s Minter等14个种。我国对散斑壳属的分类研究始于80年代，陆续发表9个新种11个新记录，使我国散斑壳属的种数达到21个。到目前为止．国外共报道18个种。目前对该病的研究已经发展到分子生水平上[4]。

二、论文研究的内容

1、论文重点解决的问题

1.1散斑壳属真菌的培养及DNA提取

1.2散斑壳属不同种RDNA基因ITS区PCR扩增片断的克隆 1.3克隆片断的DNA序列测定及分析

2、论文拟开展以下四个方面的内容 2.1 散斑壳属的分类、致病性、生活史

2.2 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增

2.3 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增片断的克隆 2.4 克隆片断的DNA序列测定及分析

3、论文拟得出的主要结论

获得出不同种散斑壳属RDNA基因ITS区的PCR扩增片断克隆的序列并构建系统发育树。

三、论文拟采用的研究方法

1、实验材料及仪器 1.1 实验菌株

散斑壳属的不同菌株由四川农业大学都江堰分校资源与环境系微生物实验室保存。1.2实验药品和试剂 1.2.1 常规药品和化学试剂 液氮、提取液（100mMTris-Hcl、PH9.0，40mMEDTA，PH8.0），缓冲液A(SDS-EB，PH8.0)缓冲液B(8MKOAc，PH4.2)，3M NaAc，10%SDS，TE(10m MTris-Hcl，1mMEDTA，ph8.0)，5×TBE缓冲液（Tris-硼酸，0.5MEDTA，PH8.0）饱和酚（PH8.0）异丙醇70%的乙醇等。1.2.2 培养基

PDA液体培养基：称马铃薯400g，去皮切成小块，煮沸30分钟，用纱布过滤，加葡萄糖40g，用蒸馏水定容到2000ml，调PH7.0。

LB液体培基：Trypton(OXOID)1g YeastExtract(OXOID)0.5g NaCl1g，加双蒸水40ml，调PH值至7.0，定容到100ml。121℃ 高压蒸汽灭菌20min。1.2.3分子生物学试剂

真菌通用引物、TaqplusDNA SacI HindIII RNAase 酶，IPTG（异丙基硫代—B—D半乳糖）X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D半乳糖苷）DNTP UItraPure质粒DNA小量提取试剂盒 小量胶回收试剂盒 连接试剂盒，氨苄青霉素 DNA分子标准DL2000 琼脂糖。1.3主要设备仪器

Eppendorf5804R冷冻离心机、Eppendorf Authorized Thermal cycler PCR仪、DYY-12型三恒多用电泳仪、BIO-RAD凝胶成像系统、G-560E涡旋混合仪、H.HS11-2型电热恒温水浴锅、HZQ-F型全温震荡培养相、微量移液器等。2实验方法

2.1散斑壳属真菌细胞总DNA的提取 2.1.1不同种散斑壳菌的获得

在超静工作台中将PDA斜面上已经培养好的不同种散斑壳的菌丝体刮下，接种于PDA的液体培养基中，在25下培养一周左右，离心收集菌丝体。2.1.2用改良二次沉淀法提取DNA 离心收集菌丝体，用灭菌双蒸水冲洗2-3次，尽量吸干水分。将菌丝体转移到冷冻过的研钵里，加液氮2-3次研磨成粉，将菌丝体迅速移入20mL离心管内，加入10mLBufferA(0.2％SDS—EB，pH 8.0)，在涡旋混合器上振荡混匀，静止至室温。将混合液置于65～68℃ 水浴20min，然后在室温下10000 r／min离15min。取上清液移至另一离心管，加入0.5mLBuferB(8mol／L KOAC，pH4.2)，混匀后冰浴45 min，然后4℃下10000r／min离心20 min。取上清液移至另一离心管，加入等体积的室温异丙醇，小心颠倒混合均匀。可以看到沉淀出现。在室温下10000r／min离心2 min。让其自然干燥后溶于50ulTE中，长期保存于一20℃冰箱中,备用。

2.2散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增 2.2.1 扩增引物

采用真菌通用引物ITS1和ITS4，起序列如下： ITS1（5-3）：TCCGTAGGTGAACCTGCGG（19bp）ITS4（5-3）：TCCTCCGCTTATTGATATGC（20bp）2.2.2 PCR扩增的反应体系：

试剂 加样量 工作浓度

DNA模板 1.0ul 约500ng DNTP 1.0 ul 20uM ITS1 1.0 ul 0.4uM ITS4 1.0 ul 0.4uM Taqplus酶 0.5 ul 2.5uM 10×baffer 5.0 ul 超纯水 38.5 ul 反应总体积 50.0 ul 反应混合物加28ul的矿物油覆盖。

2.2.3 PCR扩增的反应循环

95℃ 预变性3min 95℃变性1min 55℃退1min 72℃ 延伸1 min 72℃延伸3min 4℃保存（30个循环）2.2.4 PCR产物电泳检测

PCR反应结束后，尽量吸除矿物油，取5反应液做1.2%琼脂糖电泳检测分析。

2.3 散斑壳属不同种RDNA基因ITS区的PCR扩增片断的克隆 2.3.1 PCR扩增DNA片断纯化和回收 采用上海华舜生物工程有限公司的胶回收试剂盒，按使用说明对PCR扩增产物进行纯化。具体步骤如下: 1)样品用琼脂糖凝胶电泳后，在紫外投射仪上用刀片小心的割下含目的DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1.5ML离心管中。

2)按照每100mg琼脂糖加入300uLS;液(溶胶液)的比例加入S1液，置55℃水 浴7min，使其完全溶化，每2min颠倒混匀一次。

3)将溶化后的琼脂糖溶液移入吸附柱，离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

4)在吸附柱中加入500UlW1液(洗涤液)，离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，离心I min，再用W1，液重复洗涤一次，离心I min。5)将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入3011LT,洗 脱)液，静置I min后，离心I min，离心后管中的液体即为回收的DNA溶液。2.3.2 JM109载体菌感受态细胞的制备。

采用氯化钙法制备新鲜的JM109大肠杆菌感受态细胞。从平板上挑取新活化的大肠杆菌菌落，转入10mlLB培养基中37℃振荡培养16-18hr;按1-2%接种量转至50mlLB中37℃振荡培养3hr至OD=0.6;冰浴10 min，使培养物冷却至O℃，转入10mL离心管中;4 0C , 4000转离心IOmin;弃去上清，以l OmL冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀，冰上放置15-30 min;40C, 4000转离心l Omin;弃去上清，每50tnL初始培养物用2mL冰预冷的0.1 moUL CaCl:重悬细胞沉淀;分装成200 u L的小份，4℃可保存数天(或加终浓度为15%的甘油一80℃保存)。

2.3.3 回收的DNA片段与PUCM-T载体的连接

连接反应体系：

纯化回收后的PCR产物4.5ul pUCM一T载体0.5 ul Solution 5.0 ul Total Volume 10 ul。

将上述试剂冰浴加入0.5ml的EP管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接4小时。

2.3.4 重组质粒的转入JM109感受态细胞 从-80取出200ul感受态细胞，室温下解冻，解冻后立即置于冰片上，加入重组质粒10 轻轻摇匀，冰上放置30min，42℃ 水浴热击90S，不要动试管，快速转移至冰浴1-2min，向管中加入800LB培养液，混匀后37℃震荡培养1小时，使细菌恢复正常生长，将上述菌液摇匀后取200涂布于Amp抗性LB平板（X-gal/IPTG）上，正面向上放30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置，37℃培养过夜。

2.3.5 阳性克隆的筛选和鉴定

目的片断定向插入PUCm-T载体多克隆位点，使位于多克隆位点区编码B-半乳糖苷酶氨基端的一个片断失活，在含有IPTG、X—Gal、AMP的LB培养基上，阳性克隆菌株将形成白色菌落，而未转入PUCm-T载体质粒和转化入PUCm-T载体质粒但不含有插入片断的阴性克隆菌株将形成蓝色菌落。

用无菌牙签从含氨苄青霉素并涂布有IPTG和X—Gal的LB培养基平板上筛选白色菌落，转入10ml AMP的LB培养液中，在37下震荡培养过夜。2.3.6

阳性克隆菌株的酶切鉴定 1)质粒的提取

采用UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒。

(1)将3-5mL培养过夜的含高拷贝质粒的菌液13, 000rpm离心I min，收集沉淀；

(2)倒掉上清，把沉淀完全悬浮于250ul悬浮液(溶液1)中;(3)加入250ul裂解液(溶液II)，室温下轻轻摇匀，放置5分钟;(4)加入350ul中和液(溶液111),室温下轻轻混匀3分钟;(5)13000 rpm离心l Omin，将上清液转入一个新的1.5mL离心管中，(6)加入0.8mL纯化树脂(使用前摇匀)，混匀3分钟:取0.8mL混合液盛于离心纯化柱中，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;(7)再取剩下的混合液盛于离心纯化柱中，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;加入600ul80%异丙醇(或乙醇)，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液;(8)重复上述第七步骤两次，最后一次13000rpm离心3分钟，尽量将异丙醇(或乙醇)去除干净;（9）取出离心纯化柱，将其套入一个千净的1.5mL离心管中，加入50ulTL于纯化树脂上，不能粘在管壁上。室温下放置5min.13OOOrpm离心lmin;(10)离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取2UL电泳检。

酶切体系：

10×M Buffer 1.0 ul HindⅢ(10U／L)0.5 ul SacI(10U／L)0.5 ul 质粒DNA5.0 ul 用双蒸水补足至10 ul,混匀，37℃保温过夜。将10止酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶上80V电泳45min，于凝胶成像系统中检测并拍照。2.4 克隆片段的DNA测序测定及分析

将经PCR鉴定和酶切鉴定为阳性克隆的白色菌落做成穿刺管，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行可隆片段的DNA序列测定。

2.5 拟采用的论文技术路线或设计参数技术路线：采用二次改良沉淀法提取散斑壳属的总DNA进行PCR、并回收产物与pUCM一T载体进行连接转入到JM109感受态细胞中，经过筛选进行酶切鉴定、测序、分析。3 论文进度计划

时间 内容 完成情况 2006年9月—2006年10月初 从专业书刊、图书馆、互联网等

媒体收集并整理资料，确定论文题目。已完成 2006年10月中——2006年10底 试验前的准备 已完成 2006年10月——2007年1月 试验 进行 2007年2月——2007年3月 试验分析 待完成 2007年4月——2007年5月 论文撰写 待完成

四、文献综述（附后页）

散斑壳属rDNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析

摘要：本文以松落针病病原菌散斑壳为对象，采用二次改良沉淀法，获得散斑壳菌基因组的DNA。采用真菌通用引物ITS1和ITS4，对这些散斑壳菌的rRNA基因ITS区进行PCR扩增，并回收产物，然后将PCR扩增产物定向克隆到pUCm-T质粒的多克隆区，并转化到大肠杆菌JM109载体菌中，筛选获得阳性克隆菌株，对阳性克隆质粒中的外源DNA片段进行序列测定，并作出分析。关键词: 散斑壳菌 ITS区 PCR 克隆 序列测定

1.引言

松落针病(Lophoderrnium pinastri)是由散斑壳属真菌所引起的一种世界性林木病，该病害对整个林业生态工程建设、产业化发展造成了严重影响，寄主包括多种松树，主要危害Pinus、冷杉Abies、云杉Picea、落叶松Larix等属22个种3个变种和1个栽培变种[1]。该病害从幼树到大树均可侵染，在幼树龄中严重发病时，引起松叶提前脱落，引向树木生长，甚至导致树木死亡，曹成严重的经济损失，这类病在我国也普遍发生，且历史悠久，但长期以来该病害只是被当作一般性的也部病害来对待，没有受到应有的重视，也少有深入细致的研究[2]。但从70年代才有了较系统的研究，目前对该病的研究已有160多年的历史。它隶属于子囊菌亚门Ascomycotina ,盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]。散斑壳属是1826年正式建立的，现已成为斑痣盘菌科中的第一大属，全球共有103余种被报道[4]。该病在Minter(1981)记载松树上有散斑壳l6个种

2． 散斑壳属真菌的分类和研究状况

2.1 散斑壳属的分类和研究概况

散斑壳属真菌是菌物资源中的重要组成部分，属于子囊菌亚门Ascomycotina盘菌纲Discomycetes、星裂盘菌目Phacidiales、斑痣盘菌科Rhytismataceae[3]，这个属是由Chevallie于1826年建立的。它们广泛分布于世界的大部分温带和热带地区，寄主除针叶树外，还包括被子植物及蕨类植物，它们中的相当一部分为植物病原真菌，其引起病害通常为漆斑病或黑痣病，也可细分为枝枯病，叶斑病、梢枯病、果斑病等[5]，Darker(1932, 1967)承认21个种[6]。Minter(1981)在前人研究的基础上，对松树上的散斑壳进行了详细的分类研究，根据子囊果的外部形态以及在子囊果中点作横切片时在寄主组织内埋藏的深度，盾状壳开裂区唇细胞的有无和着色深浅，分生抱子器的有无和大小以在基物中的埋藏深度，针叶上横线纹的有无、颜色和宽度以及生态特征进行分种，共承认16个种[7]，随后Minter等人(1982)和Cannon等人又发表2个新种。我国对该病的研究始于20世纪20年代。朱凤美1927年首次报道我国湖北马尾松上由松针散斑壳L.pinastri引起的落针病[4]。此后对我国多种松树上发现的散斑壳菌都沿用这一种名。直到80年代由于病原菌的分类研究取得突破性进展，从而促进了病理学的深入研究，并取得一系列的新进展，其中最大的特点是新种不断被发现，新记录迅速增加。直至目前，陆续发表了21个新种14个新记录[4]。

2.2 散斑壳属真菌的致病性

在国内处许多关于散斑壳属真菌研究的文献中,存在着许多矛盾和分歧,其中最突出的是对该属真菌致病性的看法不同.陈守常、彭旭东、张锡津[8]经过调查研究后认为川东地区华山松落针枯死与病原真菌的侵染无关，而低温是其枯死的主要因素菜。而对于散斑壳属中的松针散斑壳，Hanso和Reindi将这种真菌看作是引起松树落针病的主要病原。面Boyce则认为此菌是弱寄生物或无害的腐生物[9]。林英任[10]经过多年的调查研究后发现，松针散斑壳在由不良因子或其他真菌致死的针叶上腐生的现象确实存在，然而在大多数情况下该菌能危害2、3年生针叶，有时也能侵染球果和长势较差的幼龄针叶。另外，松针散斑壳分布范围甚广，危害树种亦多。因此他认为：松针散斑壳寄生性和致病性的存在无可非议，是松落针病的主要病原。

2.3 散班壳菌的生活史 散斑壳属真菌引起的松落针病是一类比较复杂的病害。由于病原菌种类的不同，寄主松树的生物学特性和各地区自然生态环境等方面的差异，使得不同地区，不同松枝发生的落针病在病原、流行规律有方面均不尽相同[4]。林英任[11]经过研究认为，在安徽、江苏等地的26种（包括22个种、3个变种、1个栽培变种）松树上至少存在散斑壳属病原菌7种，其中松针散斑壳L.pinastri(Schrad)Chev为优势种，可侵染18种不同的松树。主要为害幼、中龄松树的2、3年生针叶，有时也能为害老球果或1年生针叶，严重时造成针叶大量死并脱落，树木长势衰退。何秉章、邓兴林、杨殿清等[11]研究认为，引起大兴安岭樟子松落针病的病原菌为扰乱散斑壳菌L.seditiosum Minter,Stalay et Miller。1年生苗木受害后并不死亡，影响茎、高生长，2、3年生苗木因连年得病受害，病情逐渐加重，生长衰弱以致枯死。原戈、贾云、齐乐贤等等研究认为，引起辽宁东部山区人工红松林落针病的病原菌为大散斑壳L.maximum He et Yang。染病的红松针叶于每年4月中旬、下旬开始显露症状，5月中旬开始落叶，5月下旬至6月上旬为落叶盛期，枝梢光秃。在通常情况下，散斑壳病菌以菌丝或子囊果在松针上越冬，次年春季在松针上产生大量的分生孢子器和子囊果。在阴雨天或潮湿的条件下，子囊果和分生孢子器（部分种缺）吸水膨胀而张开，溢出乳白色的内含物，即子囊孢子和分生孢子，它们借雨滴反溅作用和气流传播。孢子萌发产生的芽管由气孔侵入，也可由微伤侵入。潜育期一个月左右，繁殖期2-4个月。每年6-8月释放子囊孢子，以7月的放散是最多。分生孢子于5-9月放散，但以6-7月的放散量最多[12]。

2.4 散斑壳真菌的分离培养

国外早在上世纪70年代开始就对散斑壳司真菌进行了分离培养的研究，并认为所得到的不同培养类型是由于种内遗传变异所导致

[13]

。刘应高等]对云南

[14松针上的4种散斑壳——L.sichuanense,L.conigenum,l.pinatei,L.indianum进行了单孢分离，获得了各个菌株的培养类型。Johnson[15]在1988年的研究中认为小散斑壳可以在琼脂培养基上形成有形态。许早时[16]对来自国内的21种散斑壳按照组织分离法获得了7株培养物，并筛选了其最适生长培养基，认为MA培养基最适宜于该类菌物的营养生长以及有利于产生分生孢子器和分生孢子，所有菌种在培养60天后均不产生子囊果。

3． 核酸序列分析在真菌系统学中的应用

3.1 rRNA基因ITS区序列分析在真菌系统学中的应用

真菌核酸分子水平的研究, 集中在对基因组DNA 和RNA。基因组DNA 是指有机体在单倍体状态下的DNA 全部含量。广义的基因组也指某一体系(如核或细胞器)中的DNA , 它包括编码或细胞中固有的核糖体DNA(rDNA)、线粒体DNA(m tDNA)、tRNA 基因及其它RNA 编码。同时也包含了一些非编码基因, 如信号序列、间隔序列(内含子基因)、无功能序列(假基因)。真菌的这些基因在结构、功能和变异程度上差别很大, 是真菌在分子各级水平上研究的良好区段。rDNA 是基因组DNA 中的中等重复、并有转录活性的基因家族(gene fam ily), 重复次数在103～ 105。在不同种类真菌中, 由于rDNA 不转录内含子的存在, rDNA 在染色体上的拷贝数不同, 但相差不大[17、18、19 ]。rDNA 一般由转录区和非转录区构成, 转录区包括5S, 5.8S, 17～18S, 25～ 28S rDNA 基因, 这些基因由两个内转录间隔区(in ternal t ran scribed space, ITS)分开。转录区编码rDNA 前体, 在转录后被加工形成5S, 5.8S, 17～ 18S, 25～ 28S rDNA , 其余RNA 在成熟过程中被降解。此外在18S rDNA 基因上游还有外转录间隔区(ex ternalt ran scrib led space, ETS)。ITS 和ETS 包含有rDNA 前体加工的信息。非转录区又称基因间隔区(in tergen ic space, IGS), 它将相邻的两个重复单位隔开, 在转录时有启动和识别作用。它实质上包含ETS 区。广义上把ITS 区和非转录区统称为基因间隔区(IGR: in ternal generegion, 有的又简称IGS)。比较特殊的是ETS 常出现在RNA 前体上, 他在重复块中的位置受5S 位置的影响。在不同真菌种中, 5S 的转录方向不同, 也会导致IGS 的区域的不同[20]。在进化速率上, 编码区比较保守, 可在属、科、目水平上用于不同生物种的比较, 在其中的高度保守区, 所有的异源基因几乎都能与之强烈杂交。18S 和28S rDNA 基因的3p端是高度保守的, 即使在原核与真核生物之间也能建立位点同源性。其中, 18S 比28S 基因更保守, 5.8S基因比18S 基因进化稍快些。18S 和28S rDNA 基因是在系统发育中, 种级以上阶元的良好标记。真菌核糖体基因及间隔区有不同的进化程度，有的序列比较保守，有的序列进化较快，因此可以根据他们的序列，将真菌鉴定到属及属以下种、亚种、变种、甚至菌株的水平[21，22，23]。

核糖体不同序列分类等级表

核糖体序列 适合分类水平5 S rDNA 科（family）及科类以上 5.8S rDNA 属genus）18S rDNA 属、种（species）28S rDNA 属、种、变种(variety)ITS 种、亚种（sister species）、变种、菌株 IGS 种、变种、菌株

利用通用引物对rRNA基因的ITS区段进行PCR扩增并进行序列分析目前已经广泛用于真菌的分类鉴定。ITS区之所以成为系统与进化研究中的重要分子标记，主要是因为：作为18S-28S rDNA的一个组成部分（如图1）[24]，它在核基因组中是高度重复的，通过不等交换和基因交换，这些重复单位间可以发生位点内或位点间的同步进化，即不同ITS拷贝间的序列趋于相近或一致，这为PCR拉增产物的测序奠定了理论基础；而且ITS区的序列较短又非常保守，因此可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR拉增和测序。目前研究中广泛使用的引物是Wihteetal.（1990）设计并通用于真核生物。4.结束语

参考文献

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第三篇：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

附件2

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

and GH3-8)resulted in decrease of rice fertility.This result suggested that auxin plays a critical role in regulating flower development.The detection of the auxin distribution in panicle development showed that auxin is affinitive relation with panicle development.The transgenic plants with repressed expression of OsDR8 showed reduced resistance or susceptibility to Xanthomonas oryzae pv.oryzae and Magnaporthe grisea causing bacterial blight and blast, respectively.The putative product of OsDR8 was highly homologous to an enzyme involved in the biosynthesis of the thiazole precursor of thiamine.Exogenous application of thiamine could complement the compromised defense of the OsDR8-silenced plants.The expression level of several defense-responsive genes including the earlier functional genes of defense transduction pathway, OsPOX and OsPAL, and the downstream genes of the pathway, OsPR1a, OsPR1b, OsPR4, OsPR5 and OsPR10, was also decreased in the OsDR8-silenced plants.These results suggest that the impact of OsDR8 on disease resistance in rice may be through the regulation of expression of other defense-responsive genes and the site of OsDR8 function is on the upstream of the signal transduction pathway.In addition, the accumulation of thiamine may be essential for bacterial blight resistance and blast resistance.We found a mutant with lesion mimics on the leaves through selecting a T-DNA insertional rice pool.The inserted T-DNA was inserted into the open reading frame(ORF)of a gene named OsDR9.The predicted encoding product of OsDR9 consists of 180 amino acids that is an unknown functional protein.OsDR9 had very low expression level in the stem and young panicle but higher level in seedling, flag leaf, sheath and callus;no OsDR9 expression was detected in the root.In addition, OsDR9 had higher expression level in old leaf than young leaf.The mutant was highly resistance to Magnaporthe grisea causing fungal blast disease and bipolaris oryzae causing Cochliobolus miyabeanus disease in field.Histochemical detection and DNA fragmentation of the leaves developed lesion mimics showed that the cell death had the same features of apoptosis.In addition, the expression of pathogenesis related(PR)proteins genes PR4 and PR8 as well as a blast resistance related gene AOS2 was upregulated in the mutant.The mutant also accumulated autofluorescent materials, salicylic acid and phytoalexins(both momilactone A and sakuranetin).The mutant contained elevated levels of superoxide and H2O2.A 10.5-kb fragment harboring the OsDR9 gene from rice variety Nipponbare was transferred into the mutant.Lesion mimic phenotype was disappeared in the transgenic plants, indicating that knockout of OsDR9 by T-DNA insertion caused the lesion mimic mutant phenotype.These results suggest that OsDR9 is a negative regulator in rice disease resistance and apoptosis.Key words: Oryza sativa;bacterial blight;fungal blast;auxin;salicylic acid(SA);jasmonic acid(JA);basal resistance;development;expansin;GH3;thiamine;lesion mimic mutant(LMM);apoptosis;phytoalexin;reactive oxygen species(ROS)

第四篇：蛋白质序列、性质、功能和结构分析

蛋白质序列、性质、功能和结构分析

基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL检索。

1、疏水性

分

析

ExPASy的ProtScale

程

序（http:// PHDhtm: http:

EpitopeInfo: http://epitope-informatics.com/Links.htm

5、蛋白质功能预测 蛋白质序列分析的一般流程如下图。图1 蛋白质序列分析的一般流程（1）基于序列同源性分析的蛋白质功能预测 至少80个氨基酸长度范围内具有25%以上的序列一致性才提示可能的显著性意义。未知功能序列对库检索的一般分析策略如下： ①和运行Blastp程序的服务器（http://，将目的序列粘贴到输入框中，点击“search”即可。数据库PROSITE是由专家根据生物学知识审编的SWISS-PROT蛋白质序列中有生物学意义的位点（sites）、模式（patterns）和轮廓（profiles）的数据库，包括酶活性位点、辅因子结合位点、二硫键位点等。此库可以帮助确定新的蛋白质序列是否属已知的家族。其网址为： http://

PFAM: http://可用于对查询蛋白质序列相似性分析以确定其结构。

c、ISSD数据库

http://www.protein.bio.msu.su/issd/。d、HSSP数据库

http://www.sander.embl-heidelberg.de/hssp/。e、蛋白质结构分类数据库（SCOP）蛋白质结构分类数据库（structural classification of proteins，SCOP）http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。f、Dali/FSSP数据库

http://www.embl-ebi.ac.uk/dali/。（2）蛋白质二级结构预测

蛋白质多重序列对齐结果进行蛋白质二级结构预测的PHD程序：

http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html（3）蛋白质三级结构预测 a、与已知结构的序列比较

采用BlastP程序直接搜索NRL-3D、SCOP等数据库，如果在连续100个氨基酸范围内含有大于40%的一致性，那么在蛋白质结构上则具有较为显著的相似性。此种情况下，即预测中结果按照同源模建（homology modeling）方法能够提供详细而准确的结果。在25~40%之间则难以提供精确的结果。

如果无法在NRL-3D数据库找到匹配序列，下一步则是搜索HSSP数据库。最简单的方法是用BLAST或FASTA程序搜索蛋白质序列数据库（SWISS-PROT，Trembl，PIR）。序列检索系统（sequence retrieve system，SRS）能够提供大于25%的序列一致性。如果检出结果含有HSSP数据库的信息，那么在字段DR中会有注释。如果与HSSP数据库中的蛋白质含有超过25%的序列一致性，那么一般认为该蛋白质至少和HSSP数据库中的蛋白质具有相似的折叠模式。

b、同源模建

Swiss-Model服务器（http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html）提供自动化财同源模建分析任务。c、穿针引线（threading）算法和折叠识别 有如下程序资源： TOPITS: http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html frsvr

(fold

recognition

server): http://www.mbi.ucla.edu/people/frsvr/frsvr.html 123D: http://www-lmmb.ncifcrf.gov/~nicka/123D.html THEADER

and

THEADER2: http://globin.bio.warwick.ac.uk/~jones/threader.html http://globin.warwick.ac.uk/~jones/threader.html

7、蛋白质分子进化分析

同源蛋白质（homolog）进一步可分为直系同源（ortholog）和旁系同源（paralog）。前者指在不同物种中具有相同功能和共同起源和基因，后者则指在同一物种内具有不同功能、但也有共同起源的基因，例如同是起源于珠蛋白的α珠蛋白、β珠蛋白和肌红蛋白。

早期基于序列同源性来区分蛋白质家族的不同层次。由于在分子进化过程中，组成一个蛋白质序列的所有氨基酸并不具备同样的进化速率，具有重要功能位点的氨基酸显然进化较慢，因此单纯基于序列相似性并不合理。蛋白质进化过程中反映出重要氨基酸组群进化速率较慢而形成的保守性。这一结果体现在很多蛋白质家族成员之间蛋白质序列相似性可能只局限于某个序列区域或结构域中。因此，蛋白质超家族的概念已发展成为具有某种共同结构域的所有分子组成的分子集合。这一概念将蛋白质超家族进行了扩大。这一点也反映在PDB数据库的处理中，即PIR数据库不只依据序列的相似性，而且结合结构域的分析进行蛋白质家族和超家族分类。

蛋白质分类数据库（ProtoMap）：http://www.protomap.cs.huji.ac.il/。如果发现一个未知蛋白质序列和较多不同种属或同一种属的蛋白质序列具有较高的同源性（大于30%），那么提示待分析蛋白质序列可能是相应家族的成员，从而可从分子进化的角度对蛋白质序列进行综合分析。基本步骤包括：

①用待分析蛋白质序列检索蛋白质序列数据库，获取同源性较高的蛋白质序列。此过程可通过NCBI/Blastp程序分析。

②将所有相关序列组织成FASTA格式，作为后续进行Clustal W/X软件分析的输入数据。

③采用Clustal W/X算法对这些序列进行聚类分析，可联网到http://www.ebi.ac.uk/clustalw/或直接使用Clustal W/X软件进行。④根据蛋白质序列多重对齐结果绘制分子进化树。采用本地化软件MacVector、DANMAN、TreeView等进行。

第五篇：大豆热激转录因子基因GmHsfA1的克隆、结构分析及功能鉴定

大豆热激转录因子基因GmHsfA1的克隆、结构分析及功能鉴定

热激转录因子(heat shock transcription factor, HSF)在调节植物对逆境胁迫(特别是热胁迫)应答和相关基因表达方面起重要作用。我们采用生物信息学和比较基因组学方法结合RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术，从大豆基因组中克隆到一个热激转录因子基因GmHsfA1，其cDNA全长1781bp，编码一段由510个氨基酸组成的多肽(accession number:AY458843)。序列比对和结构分析显示，GmHSFA1与番茄热激转录因子LpHSFA1之间的同源性最高，二者间的氨基酸序列相似性达到52.46%。GmHSFA1包含4个重要功能域，即DNA结合域DBD（DNA binding domain）、寡聚域OD（oligmerization domain）、核定位信号NLS（nuclear location signal）和C端激活域CTAD（C-terminal activation domain）。

通过定量PCR和RT-PCR分析显示，GmHsfA1在大豆不同组织和不同发育时期都有稳定表达（组成型表达模式），高温和高盐诱导能加强其表达，而NAA、GA和ABA等外源激素处理可降低其表达。遗传转化和Northern杂交结果表明，在常温(28℃)下，转基因大豆植株中GmHsfA1的表达量比非转基因对照植株明显增加，而在高温(45℃)诱导下，含有35S-GmHsfA1的转基因植株的热激蛋白基因(GmHSP70)表达量比非转基因植株高出8倍以上。热诱导实验表明，转基因植株的耐热温度高达52℃，比非转基因植株（仅耐42℃）提高了10℃。这说明GmHSFA1具有激活或上调GmHSP70基因表达的功能，其过量表达能够明显增强转基因大豆的耐热能力，而且还具有一定的耐旱能力。上述结果证明GmHSFA1是一个新的、有功能的大豆热激转录因子，对于研究耐逆相关基因的调控机理和培育耐逆性强的基因工程大豆等作物新品种具有重要意义。

关键词： 大豆 热激转录因子 基因克隆 遗传转化 过量表达 耐热性