臭氧灭菌在非无菌液体制剂生产过程中的应用

第一篇：臭氧灭菌在非无菌液体制剂生产过程中的应用

臭氧灭菌在非无菌液体制剂生产过程中的应用

摘要：简要分析了非无菌液体制剂生产过程中微生物的控制，重点阐述臭氧对生产设备和物料管道内部的灭菌实验方法，以及臭氧发生器的选型和灭菌效果验证。

近年来对臭氧灭菌在制药、生物工程、遗传工程等行业中的应用有大量的报道，在我国药品生产质量管理规范中臭氧灭菌也是被推荐的灭菌方法之一，国家《消毒技术规范》中明确提出臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体、芽孢、病毒和真菌等，破坏肉毒杆菌毒素，这充分地说明了臭氧的灭菌原理和特点，同时也为我们在制药过程中提供了一种全新的灭菌方法。尽管这种方法已被人们所接受，但在具体应用中，绝大多数制药企业仅用于对生产环境的灭菌，而在对生产设备、容器具、反应釜、贮罐和输液、输料、输气管道及内包装材料、工作服、工艺用水等灭菌中，还没有得到广泛的应用。本文着重介绍臭氧在非无菌液体制剂生产过程中对生产设备、容器具、贮罐和输液、输料管道灭菌的经验。

非无菌液体制剂微生物控制现状

非无菌液体制剂在整个药品制剂中占有很大的比例，如合剂、糖浆剂、溶液剂及外用洗剂等。水性液体药剂易被微生物污染，尤其是含有糖类、蛋白质等营养物质更易被污染，在我国液体制剂中绝大部分为中药制剂，其含有大量的糖类、蛋白质等营养物质。2010版《中国药典》对非无菌液体制剂的染菌限度作了严格的规定：细菌、霉菌、酵母菌1mL药液内不超过100个CFU，并不得检出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、活螨及螨卵等，该类药物为非最终灭菌制剂，因此需要在生产过程中对每一个环节微生物污染的程度进行严格控制，来降低最终成品的质量风险。在非无菌液体制剂的生产过程中，除对原辅料、内包装材料、中间产品及生产环境、工艺用水的微生物加以控制外，重点应防止生产设备、工具、容器、贮罐和输液、输料管道对产品的污染，其灭菌是否可靠，将决定成品微生物数量是否合格。

一般液体制剂的生产过程由多个生产环节组成，有各种设备、容器、管道、阀门、仪表等复杂部件连接在一起。传统消毒灭菌一般用75％乙醇浸泡或用纯蒸汽通过管道、容器来进行。用75％乙醇浸泡需大量的乙醇，使生产成本提高许多，一般企业很难做到；最可靠的方法是用纯蒸汽对生产线进行消毒灭菌，而对于规模较小的一些非无菌制药企业来讲，要得到纯蒸汽也是件不容易的事情。

资料表明，臭氧具有很强的杀菌作用。臭氧的灭菌原理：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧气和单个氧原子；后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧分子，不存在任何有毒残留物，无死角，故称无污染灭菌剂，它不但对各种细菌（包括大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对杀死霉菌也很有效。《消毒技术规范》中提出“臭氧对物品表面上的微生物有杀灭作用”。因此，用臭氧灭菌既可靠又经济，同时产品质量也可得到保证。2 臭氧灭菌实验

根据本企业的实际情况，2007年12月起我公司采用臭氧对非无菌液体制剂生产线进行在线灭菌，主要针对生产线上浓配罐、稀配罐、高位槽、灌装设备以及物料管道和生产用容器具等。

2.1实验用设备

现在市面上已有专为此设计出的臭氧发生器，自带压缩机、配置阀门及活结，可自由移动，通过管路将高浓度的臭氧气体输入需灭菌的容器或管道内达到灭菌效果。我公司采用某臭氧设备制造有限公司生产的臭氧发生器，其产量为40g/h，出口臭氧浓度8×10-4,功率为0.55kW。

2.2实验方法

由于整条生产线从配制到灌装之间，管线和设备连接复杂，而配制和灌装不在同一操作间，管线连接较长，为使灭菌彻底，操作方便，故采用臭氧发生器流动使用，对不同的生产单元进行灭菌。对于臭氧不易通过的部件，进行拆卸并用75％乙醇浸泡，而易通过的部件分别通过活结或软管进行连接，并按操作程序连接好臭氧发生器，开启臭氧灭菌。灭菌过程中对于不能完全密封的单元，则采用臭氧发生器连续工作，产生高浓度臭氧灭菌，以保证其可靠性。

实验表明：若被灭菌物表面湿度＞80％灭菌效果会更好，因此，在灭菌之前需用工艺用水对需灭菌系统进行冲洗。为防止灭菌后产生二次污染，使用臭氧灭菌前先对所在洁净区环境灭菌。在灭菌过程中，对于密封单元开启臭氧发生器工作1h，保留1h；对于不能完全密封单元，采用臭氧发生器连续工作2h灭菌。

2.3实验结果与讨论

通过对该灭菌方法的验证，经测试均符合设定的标准，达到了灭菌效果。我们对2年来生产的上百批产品和以往产品进行比较（表1），发现从2008年开始使用臭氧灭菌后，产品一次合格率高达100%，而以往仅达85%左右。使用臭氧灭菌前，常会出现成品微生物超标而返工，造成企业生产成本的提高。而现在彻底改变了我公司液体制剂微生物超标和返工的现象，使产品的质量得到了保证，降低了企业的生产成本。

表1 2006?2009年产品质量统计 臭氧发生器选型及灭菌效果验证

由于市面上臭氧发生器型号较多，我们根据实际生产需要对臭氧发生器进行了选型，一般的评价指标为：臭氧产量、浓度、可靠性、使用寿命、电耗等。由于单元系统灭菌的发生器的功率比较小，电耗一般不予考虑。对于浓度，由《消毒技术规范》知，臭氧浓度一般在60㎎/m3以上，才对物品表面上的微生物有杀灭作用，而设备内部一般浓度在5×10-5以上才进行灭菌，表面湿度大灭菌效果会更好。

在选用设备时，臭氧产量是最重要参考依据，我们应根据灭菌空间和灭菌浓度进行计算。例如，经估计我们所需要的灭菌空间为100m3，若为密闭容器，要求杀灭管道或设备内表面的微生物，按要求浓度C不低于5×10-5，经计算为84mg/m3，考虑臭氧发生器的臭氧发生量在工作1h后自然衰退率S为62.25％，则选择臭氧发生器发生量W（mg/h）：

W＝CV/（1－S）＝84×100/（1－62.25％）＝22251mg/h

考虑到实际损耗选用时不得＜30g/h。

在生产过程中为了灭菌彻底，不留死角，常采用臭氧发生器连续工作方式，流通臭氧进行灭菌，在选用臭氧发生器时应依据以上方法进行臭氧发生量的估算，使其产生足够浓度的臭氧来灭菌。

臭氧发生器的灭菌可靠性和使用寿命与其工作时间是密切相关的，可通过灭菌效果验证来确定。

臭氧灭菌效果验证过程包括2个方面：(1)臭氧浓度测定：在臭氧发生器工作一定时间后，采用化学分析法或仪器测定法，测定结果不低于60㎎/m3；(2)生物指示剂挑战性试验：将枯草杆菌黑色变种芽孢菌片置于器皿内的灭菌空间内，灭菌结束后取出器皿进行培养，并对结果评价，应＜10CFU/皿。通过以上结果来确定臭氧发生器的工作时间和灭菌时间。

总之，臭氧发生器的选择要结合实际情况，准确估算性能参数，并对其可靠性进行周期性再验证，以防止由于设备原因导致产品的质量风险。在选购臭氧发生器时应有备用机，使用过程中尽可能按“两用一备，一用一备”的原则购置，备用机组在设备维护或修理过程中交替使用，避免停机维护影响正常生产。

结语

通过以上对非无菌液体制剂生产线灭菌现状的分析，结合我公司日常生产中使用臭氧发生器在线灭菌的经验，并经过验证和大量实验考察，笔者认为采用臭氧发生器对非无菌液体制剂生产线在线灭菌是一种有效的方法，它解决了产品在生产过程中易受污染的难题，使产品的质量得到了有效保证。

第二篇：冻干粉针剂等非最终灭菌的无菌制剂检查要点

冻干粉针剂等非最终灭菌的无菌制剂检查要点

冻干粉针剂等非最终灭菌的无菌制剂检查要点

防止微生物、热原或细菌内毒素、微粒污染 厂房 设备 生产工艺 无菌检查 物料和中间产品 人员

各个阶段（包括灭菌前的各阶段）都必须采取预防措施，以尽可能降低污染

一、厂房 厂房布局和建造 洁净度级别的标准 关键操作区的空气流向 洁净区的压差 洁净区的清洁和消毒 环境监控（包括动态监控）HVAC系统的维护和监控

二、设备

适用于产品的生产、清洁、消毒或灭菌 尽可能采用密闭系统 合理布置和安装

关键参数控制和记录仪表的校准 设备的确认、维护和维修 设备的清洁、消毒或灭菌

共用设备应有防止交叉污染的措施 设备应在确认的范围内使用

三、工艺用水

水处理设施及其分配系统的设计、安装和维护应能确保供水达到适当的质量标准。水系统的运行不应超越其设计能力

注射用水的生产、贮存和分配方式应能防止微生物生长

水源、水处理设施及水的化学和生物学污染状况应定期监测，必要时还应监测细菌内毒素。监测结果以及所采取纠偏措施的记录应予归档

四、生产工艺

1、配制工序

操作区的设置和洁净度级别 配制设备的选型 配料处方 称量操作 称量记录

防止污染和交叉污染的措施

2、过滤工序 过滤器的安装位置 过滤器的相关信息 过滤器完整性试验的方法 过滤前后的完整性试验和记录 过滤器的更换、消毒或灭菌 发现过滤器出问题后的处理

3、无菌灌装工序 关键操作区和生产设备 清洁、消毒或灭菌 动态环境的监控

无菌灌装用各类物料、器具的准备或灭菌处理 生产用气体 人员的无菌操作 装量控制

培养基模拟灌装验证 无菌检验样品的取样

检查等其他活动不能影响正常的生产

4、冻干工序

冻干产品的包装形式、装量 冻干产品的装载方式和装载数量 冻干工艺和曲线 冻干工艺的验证

冻干产品进出冷冻干燥室的操作 冻干机的灭菌 冻干机

关键参数控制和记录仪表的校准 管路的连接 冻干的记录

五、无菌检验 无菌室及环境监控 取样计划 取样量和检验量 培养基和菌种管理 无菌检验方法 样品表面消毒处理

阳性检验结果的调查和处理

六、物料 物料的质量标准 物料的来源 物料的取样和检验 物料的供应商审计 物料供应商的变更

七、中间产品的质量控制

应特别注意监控中间产品微生物和细菌内毒素污染情况 已配制的中间产品含量检测极为关键 澄清度检查 可见异物检查 应100％检查

可制备含有可见异物的标准样品对操作人员进行培训

八、人员 人员的培训 人员的卫生习惯 体检档案和汇总

洁净区内人员的工作服及穿着 无菌操作

粉针车间冻干粉针剂培养基无菌灌装模拟试验是对粉针车间使用F2000/12/600型灌装机在局部百级工作环境中进行冻干粉针剂灌装过程中所采用的各种方法和各种规程防止微生物污染的水平可以达到可接受的合格标准的能力。通过检查确认找出粉针车间进行冻干粉针剂灌装作业过程中的控制要求，为今后对粉针车间进行冻干粉针剂灌装作业管理确定依据。冻干粉针剂培养基无菌灌装模拟试验验证方案

方案制订：

制订日期：

方案批准：

批准日期：

目录

1.概括………………………………………………………………………………………………1 1.1目的 ……………………………………………………………………………………………1 1.2范围 ……………………………………………………………………………………………1 1.3责任 ……………………………………………………………………………………………1 2.确定可接受的合格标……………………………………………………………………………2 3.培养基性能测试…………………………………………………………………………………2 3.1微生物生长性能试验 …………………………………………………………………………2 3.2培养基无菌性试验 ……………………………………………………………………………2 4 模拟分装用无菌粉末……………………………………………………………………………2 4.1模拟分装用无菌粉末应具有的特性 …………………………………………………………2 4.2 无菌性试验……………………………………………………………………………………3 4.3 抑菌性试验……………………………………………………………………………………3 4.4 溶解性试验……………………………………………………………………………………3 5 模拟分装过程操作规程及操作人员控制………………………………………………………3 6 操作过程及无菌环境控制与监测………………………………………………………………4 6.1 模拟分装使用西林瓶及胶塞无菌性检测……………………………………………………4 6.2 微生物控制与监测……………………………………………………………………………4 6.3 尘埃粒子监测…………………………………………………………………………………5 7 取样计划及取样点………………………………………………………………………………5 7.1 取样计划………………………………………………………………………………………5 7.2 取样点…………………………………………………………………………………………6 8 模拟分装…………………………………………………………………………………………6 8.1 无菌粉针剂模拟分装方法……………………………………………………………………6 8.2 液体培养基制备及进入无菌分装区方法……………………………………………………6 8.3 液体培养基分装工具的选用及处理使用方法………………………………………………6 8.4 无菌粉针剂模拟分装试验……………………………………………………………………7 8.5 液体培养基分装………………………………………………………………………………7 9 微生物培养………………………………………………………………………………………7 9.1 阴性对照………………………………………………………………………………………7 9.2 阳性对照………………………………………………………………………………………7 9.3 试验样品培养…………………………………………………………………………………7 10 试验结果评价…………………………………………………………………………………8 11 验证制度及再验证时间安排…………………………………………………………………8 12 确认方案执行日期……………………………………………………………………………9

1、概括

冻干粉针剂培养基无菌灌装模拟试验是在其他各个系统（诸如灭菌系统、公用系统、无菌环境保持系统、设备验证、设备清洗过程验证等）验证工作完成的基础上进行的。采用培养基无菌灌装模拟试验方法进行。1.1、目的

用和实际生产工艺相同的条件与操作方法（包括生产环境），向冻干制品容器（西林瓶）内灌装经除菌过滤器过滤的培养基，然后将此模拟制品在适当条件下培养，以确认工艺过程的可靠性。证明在冻干粉针剂灌装过程中所采用的各种方法和各种规程以防止微生物污染的水平达到可接受的合格标准的能力，或提供保证所生产产品的无菌性的可信限度达到可接受的合格标准的证据。1.2、范围

此验证方案适用于粉针车间冻干粉针剂灌装过程验证。1.3、责任

生产技术部、质量保证部、QC化验室、粉针车间、设备部负责验证方案的执行，主要工作内容如下： ①、编订及实施验证方案； ②、实施确认并提供确认资料； ③、汇编测试资料于最终报告内；

④、协调参与验证过程的人员和部门，确保验证的各项要求；

⑤、将成功的结果及分装过程的需求规范化，并制定相关文件待核准下发。

2、确定可接受的合格标准

警戒限：可信限为95%时污染概率大于0.05%； 合格限：可信限为95%时污染概率小于0.1%。分装量与污染控制数关系表

模拟分装数量/瓶

污染控制数量/瓶

模拟分装数量/瓶

污染控制数量/瓶 3000～4742

0

4743～6294

小于1 6295～7751

小于2

7752～9151

小于3

3、培养基性能测试

模拟分装试验采用胰胨大豆肉汤培养基，通过下述试验对培养基微生物生长性能进行确认。首先根据标准操作规程制备培养基并灭菌后备用。3.1 微生物生长性能试验

将上述灭菌后的培养基分装于100支试管中，在一半数量的试管中接种枯草杆菌，接种量为<100CFU；在另一半数量的试管中接种白色念珠菌，接种量为<100CFU。接种后盖塞、封口，将接种有枯草杆菌的试管放于30～35℃下培养7天，将接种有白色念珠菌的试管放于20～25℃下培养7天。7天内至少有50%以上接种的各试管的培养基中应出现明显的所接种的微生物的生长。3.2 培养基无菌性试验

将上述灭菌后的培养基分装于100支无菌试管中，盖塞、封口。其中50支试管放于30～35℃下培养7天，同时将另外50支试管放于20～25℃下培养7天。7天内各试管培养基中应无任何微生物生长。

4、模拟分装过程操作规程及操作人员控制

4.1、模拟分装试验中使用的西林瓶和胶塞的清洗、灭菌，分装设备的清洗、消毒，与产品接触的分装设备部件的清洗、灭菌、安装过程必须遵循与实际生产操作相同的标准操作规程。4.2、灌装机灌装速度保持与正常冻干粉针剂灌装及半压胶塞生产时的速度相同。

4.3、所有参加模拟试验的操作人员均应经过GMP、无菌操作、无菌更衣程序技术等相关知识的培训并经考核合格。

4.4、参加模拟试验的操作人员数及人员构成应严格控制，非规定的验证小组成员严禁在模拟试验过程中进入模拟试验现场，模拟试验现场人员数不得超过5人，人员的进入及退出应严格执行标准操作程序，减少不必要的人员进入及退出次数。可进入模拟试验现场的人员名单如下： 部门

姓名

部门

姓名 设备部

质量保证部

生产技术部

QC化验室

QC化验室

粉针车间

QC化验室

粉针车间

粉针车间

粉针车间

粉针车间

粉针车间

5、操作过程及无菌环境控制与监测

进行模拟试验过程中，对以下各项进行监测。5.1、模拟试验使用西林瓶及胶塞无菌性检测：

按第6条取样计划的规定要求，对模拟试验使用的西林瓶及胶塞进行取样，检测其无菌性，合格标准为各样品不得存在无菌性不合格情况。5.2、微生物控制与监测：

①、在模拟试验过程中，对操作人员的无菌服、手套、眼镜、胸前、前臂等部位的微生物数量进行监测。其取样方法、取样频率、取样要求、取样点分布见第6条取样计划。合格标准：手套全部检出菌数<2个、霉菌<1个；

一个操作人员双臂、前胸的3个取样点检出菌数之和<10个。

②、对无菌区墙壁、门、设备以及操作人员可能接触的各种表面进行无菌程度检验。其取样方法、取样点、取样频率见第6条取样计划。在进行取样时其取样面积应保持在25cm2。合格标准：局部百级区全部检出菌数<3个、霉菌<1个；

万级区全部检出菌数<10个、霉菌<2个，地面检出菌数<25个、霉菌<3个。③、对空气中微生物数量进行监测，其取样方法、取样点、取样频率见第6条取样计划。合格标准：局部百级区全部检出菌数<1个； 万级区全部检出菌数<10个、霉菌<3个；

④、微生物数量监测试验所采用的培养基应为经过无菌及微生物生长性能检验合格的培养基。⑤、污染调查、微生物鉴别方法、污染发生时应采取的措施执行相关标准操作程序。5.3尘埃粒子监测

按第6条取样计划的规定要求，对灌装室进行空气质量监测，其监测结果应能证明关键区域空气质量达到百级洁净区的空气质量标准。

6、取样计划及取样点 6.1取样计划：

监测项目

取样方法

取样频率

取样要求

模拟试验西林瓶无菌检查

随机取样

每灌装500瓶取样一次

每次取样10支

模拟试验使用胶塞无菌检查

随机取样

每灌装500瓶取样一次

每次取样10枚

操作人员无菌性检查

棉签擦拭法

模拟试验开始前，试验进行一半时间，试验结束后，分别对操作人员进行取样监测

取样时，被取样的操作人员应离开分装机，在灌装室的一角将双臂平伸，静止不动，取样人员按棉签擦拭取样法在最短时间内取样。每次对同一操作人员进行取样监测时，其取样点应不相同

无菌灌装区无菌性检查

棉签擦拭法

模拟试验开始前，试验进行一半时间，试验结束后，分别根据取样点要求对无菌区进行取样监测

根据取样点要求取样，取样面积固定，每次取样面积为25cm2。每次应选择不同位置取样，其重点为操作者可能接触的各种表面。

空气微生物数量监测

沉降平皿法

每小时取样一次

根据取样点分布图布置培养皿，各取样点每小时更换取样皿进行检测。灌装机附近设置四个以上的取样平皿连续暴露取样。另有一个平皿应放置于微生物监测室情况最差的部位。

浮游菌采样

每30分钟监测一次

取样操作时应由专人进行

尘埃粒子监测

粒子计数器

每30分钟监测一次

监测应由专人按标准操作程序进行 6.2 取样点：

①、操作人员无菌性检查取样点：操作人员的无菌服、手套、眼镜、胸前、前臂等部位。

②、无菌灌装区无菌性检查取样点：其取样重点为无菌灌装区内墙壁、门、设备表面以及操作人员可能接触的各种表面。每次取样应包括：一侧内墙壁，无菌灌装区内门把手，胶塞清洗机开门螺旋，灌装机上塞料斗，西林瓶灭菌烘干隧道出口处理瓶转盘，灌装机控制面板，物料周转桶、周转托盘等处。③、空气微生物数量监测沉降平皿法取样点：取样点见附件《冻干粉针剂培养基无菌灌装模拟试验空气微生物监测沉降平皿取样点分布图》。

④、空气微生物数量监测浮游菌测试取样点：按无菌灌装区面积等分进行取样，每个测试点距离1米，测试点距内墙面0.5米，另外在分装面、胶塞清洗机胶塞出口处、西林瓶灭菌烘干隧道出口处分别增加一个测试点。

⑤、尘埃粒子监测取样点：按无菌灌装区面积等分进行取样，每个测试点距离1米，测试点距内墙面0.5米，另外在分装面、胶塞清洗机胶塞出口处、西林瓶灭菌烘干隧道出口处分别增加一个测试点。

7、模拟灌装

7.1 冻干粉针剂模拟灌装方法：

冻干粉针剂模拟灌装方法采用将一定量的无菌液体培养基通过灌装机灌装于西林瓶中并进行半压胶塞，然后在冻干机内进行冻干试验并进行全压胶塞，压铝盖密封。模拟试验量为5000瓶。7.2 液体无菌培养基制备方法：

将经过第3项检测合格的培养基在配制室内按每30g加1L注射用水的比例配制50L液体培养基备用。

7.3 无菌粉针剂模拟灌装试验：

7.3.1 模拟灌装试验用西林瓶数量：按生产工艺要求准备7000支无菌西林瓶。7.3.2 模拟灌装试验用胶塞数量：按生产工艺要求准备7000枚无菌胶塞。7.3.3 模拟灌装试验用铝盖数量：按生产工艺要求准备7000枚铝盖。

7.3.4 模拟灌装试验用周转盘数量：按生产工艺对周转盘进行清洁消毒，以每只周转盘装量290支计算，准备25只洁净周转盘备用。

7.3.5 模拟灌装试验灌装量：每支西林瓶灌装7ml液体培养基。

7.3.6 液体培养基的除菌过滤：对在配制间配制好的液体培养基按正常生产工艺要求进行除菌过滤并存放于无菌储罐内。

7.3.7 灌装机灌装速度：灌装机灌装及半压胶塞速度为260瓶/分。7.3.8 模拟灌装试验操作流程：按冻干粉针剂生产工艺流程进行。

7.3.9 模拟灌装试验灌装过程要求：在进行模拟灌装试验时，当灌装进行至一半时，使设备空转一小时以上再继续进行模拟灌装试验，完成剩余的试验制品的灌装。

7.3.10 根据5.1项及6项要求，在每台灌装机分装完成500瓶时，随机抽取未分装的西林瓶及胶塞10枚供检测使用。

7.3.11 冻干模拟试验：培养基灌装半压胶塞以后，将半压胶塞的样品瓶转移到冻干机内，进行冻干的模拟试验。试验中，冷冻温度不得低于3℃。冻干时间设定为24小时，抽真空、全压塞后按生产工艺要求进行铝盖密封作业。至此供试品已全部制备完成。

7.3.12 取样原则：由于培养基灌装试验分为两个阶段进行，因此将全部样品分为四个不同时间段进行样品标示，即第一阶段灌装试验开始时、第一阶段灌装试验结束时、第二阶段灌装试验开始时、第二阶段灌装试验结束时四个时间。其标记法为“1-1”、“1-2”、“2-1”、“2-2”。标记点为周转盘。

8、微生物培养 8.1 阴性对照：

在模拟灌装过程中，使用20支洁净试管灌装7ml培养基，密封后进行现场用培养基无菌性试验。其20瓶阴性对照品应均不得长菌。8.2 阳性对照：

为确认无菌灌装容器中培养基的促菌生产能力，取低浓度菌接种于进行挑战性阳性试验用的4支对照试管中，2瓶接种浓度<100个微生物/0.1ml的枯草杆菌芽孢；另2瓶接种浓度<100个微生物/0.1ml的白色念珠菌。接种后将接种枯草杆菌芽孢的西林瓶放于30～35℃下培养7天，将接种有白色念珠菌的西林瓶放于20～25℃下培养7天。7天内至少需有1支容器被证实有菌生产。如2个容器内均没有菌增殖，则应在确认试验操作有误后，重复试验1次，此次试验应在2个容器内均有菌生产的情况。8.3 试验样品培养：

模拟灌装生产的全部样品在适宜的温度下培养14天，先在较低温度（20～25℃）下培养7天，然后在较高温度（30～35℃）下培养7天，较低温度与较高温度一般相差10℃。在第三天和第七天之间至少观察培养基灌装品的微生物的生产情况一次，并且在检测期间的最后一天至少再观察一次，并对污染的瓶中的微生物进行总结其特点。若发现污染应明确记录样品号及数量，同时应检查铝盖、胶塞的密封情况；若有破损应记录并检查其破损原因。对于微生物污染的样品应进行鉴别试验，鉴别的内容至少应包括菌落、细胞形态学及革兰染色特性等。

9、试验结果评价

评价无菌模拟灌装试验结果的主要指标之一是微生物污染水平，如果试验结果证明其污染水平超过规定的合格限度（参见第2项规定），则应立即停止生产，调查并记录污染产生的原因。在调查结束并采用相应的措施后应重复进行培养基无菌模拟灌装试验。原因调查至少应包括如下项： a、生产环境微生物监测数据； b、生产环境悬浮粒子监测数据； c、人员污染的监测数据；

d、HEPA过滤器的完整性检测、粒子、风速等； e、操作间的空气流向、压差； f、操作人员的操作方法、培训情况； g、模拟灌装试验过程中的异常情况； h、无菌室生产工具及其他用品的储存状况； i、鉴别污染微生物的种、属，以寻找污染源的线索； j、无菌室的清洁、清洁堆规程的培训及执行情况； k、无菌生产用设备的控制系统和监测系统的校正； l、生产前、生产后过滤器的完整性检测结果； m、相关产品、相关生产过程存在的问题等。

原因调查结束后，应根据调查所确定的或可能发生的原因制定纠正或改进方案并予以实施。当改进方案实施之后应重复模拟灌装试验。

10、验证制度及再验证时间安排

10.1对于新建的冻干粉针剂生产线在其正式投入生产前必须进行培养基无菌模拟灌装试验，合格后才可投入生产；

10.2对于已投入使用的冻干粉针剂灌装生产线，每年至少进行2次培养基无菌模拟灌装试验； 10.3每个在冻干粉针剂灌装生产线上的工作人员，每年至少参加1次成功的培养基无菌模拟灌装试验；

10.4当生产用设备、设施，从事冻干粉针剂灌装生产操作的人员结构，工艺方法有重大改动时均必须进行培养基无菌模拟灌装试验，以证明其改动对已经验证了的冻干粉针剂灌装工艺过程不产生不良影响。

11、确认方案执行日期

方案执行日期为：年月日~年月日

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