WB03 酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿概要

第一篇：WB03 酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿概要

农产品与食品质量检测技术教学资源库

酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿

准备好物品后即可进行检测操作，首先进行样品处理。取1mL纯牛奶样本，加入一根小试管，再加1mL去离子水，涡动1min混匀；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小试管，再加入960μL样本稀释液稀释，涡动1min混匀。

接下来，吸取50μL牛奶样本到微孔中，做2孔平行，并记录所在位置。再取三聚氰胺标准品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并记录所在位置。然后，每孔各加50μL酶标物，每孔再加入抗试剂50μL，轻轻振荡均匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境中反应30min。

取出微孔板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液250μL，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。接下来各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境反应15～20min。取出微孔板，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。

测定完成后我们得到了三聚氰胺标品和样本的吸光度平均值，如表格所示。首先进行三聚氰胺的定性分析，根据样本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺浓度范围为1ppb-3ppb，再乘以稀释倍数50得出此纯牛奶中三聚氰胺的浓度为50ppb-150ppb。

接着我们进行三聚氰胺的定量分析，先计算百分吸光率和三聚氰胺浓度的对数，如表格中所示。

然后，以标准品百分吸光率为纵坐标，三聚氰胺标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线，如图所示。将样本的百分吸光率带入标准曲线的公式中，计算出样本所对应的浓度为1.77ppb，乘以稀释倍数50得到样本中三聚氰胺实际残留量为88.5ppb。

第二篇：液体乳中三聚氰胺的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201907）

附件7

液体乳中三聚氰胺的快速检测

胶体金免疫层析法

(KJ201907)

范围

本方法规定了液体乳中三聚氰胺的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于巴氏杀菌乳、灭菌乳、调制乳和发酵乳中三聚氰胺的快速测定。

原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的三聚氰胺与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中三聚氰胺进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T

6682规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

甲醇。

3.1.2

三羟甲基氨基甲烷（Tris）。

3.1.3

1mol/L盐酸：移取83

mL浓盐酸，加入900mL水中，定容至1

L。

3.1.4

甲醇水溶液：准确量取50

mL甲醇和50

mL水，混匀后备用。

3.1.5

稀释液：准确称取6.05

g

Tris（3.1.2）和8.5

g

1mol/L盐酸（3.1.3），加水定容至1

L，混匀后备用。

3.2

参考物质

参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥99%。

表1

三聚氰胺参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子质量

三聚氰胺

Melamine

108-78-1

C3H6N6

126.12

注：或等同可溯源物质。

3.3

标准溶液的配制

三聚氰胺标准储备液（1000

μg/mL）：精密称取适量三聚氰胺标准品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用甲醇水溶液（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1000

μg/mL的三聚氰胺标准储备液；或可直接购三聚氰胺标准储备液。4℃避光保存备用，有效期3个月。

3.4

三聚氰胺胶体金免疫层析试剂盒

3.4.1

金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

3.4.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：200

µL、1000

µL和5

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

电子天平：感量为

0.01

g。

4.4

环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。

分析步骤

5.1

试样制备

取适量有代表性样品充分混匀。

5.2

试样提取

准确称取样品0.5

g于离心管中，加入5

mL稀释液（3.1.5），涡旋混匀提取5

min，即得待测液。

注：试样提取过程可按照试剂盒说明书，不做限定。

5.3

测定步骤

5.3.1

试纸条与金标微孔测定步骤

吸取150~200

μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5~10次使混合均匀，不要有气泡，40℃温育3

min，将检测试纸条（3.4.2）样品端垂直向下插入金标微孔中，40℃温育5

min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。

5.3.2

检测卡测定步骤

吸取150-200

μL样品待测液于检测卡加样孔（3.4.2）中，室温反应3-5

min，进行结果判定。

5.4

质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白试样100

g（精确至0.01

g）置于100

mL玻璃溶液瓶中，加入250

μL三聚氰胺标准溶液（1000

μg/mL）（3.3），使试样中三聚氰胺浓度为2.5

mg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

注：可参考标准品的说明书配置操作。

结果判定要求

通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视结果判读如图1。

6.1

无效

控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

6.2

阳性结果

6.2.1

消线法

检测线（T线）不显色，控制线（C线）显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性（如图1试纸条/检测卡目视判定示意图）。

6.2.2

比色法

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅或几乎不显色，表明样品中三聚氰胺含量高于方法检测限，判定为阳性（如图1试纸条/检测卡目视判定示意图）。

6.3

阴性结果

6.3.1

消线法

检测线（T线）、控制线（C线）均显色，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性（如图1试纸条/检测卡目视判定示意图）。

6.3.2

比色法

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中三聚氰胺含量低于方法检测限，判定为阴性（如图1试纸条/检测卡目视判定示意图）。

试纸条

手持端

C线

T线

样品端

检测卡

加样孔

T线

C线

C线

T线

T线

T线

C线

C线

阴性

阳性

阳性

阴性

消线法

比色法

结果无效

检测装置示意图

图1

试纸条/检测卡目视判定示意图

6.4

质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

6.5

读数仪测定法

按读数仪说明书要求操作直接读取并进行结果判定。

结论

三聚氰胺与灭蝇胺有交叉反应，当检测结果为阳性时，应对三聚氰胺结果进行确证。

性能指标

8.1

检测限

2.5mg/kg。

8.2

灵敏度

灵敏度应≥99%

8.3

特异性

特异性应≥85%。

8.4

假阴性率

假阴性率应≤1%。

8.5

假阳性率

假阳性率应≤15%。

注：性能指标计算方法参见附录A。

其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定，可根据试剂盒说明书进行操作。方法使用者应使用经过验证的满足本方法规定的各项性能指标的试剂、试剂盒。

本方法参比标准为《食品安全国家标准原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T

22388-2008）。

本方法使用试剂盒可能与灭蝇胺存在交叉反应，当结果判定为阳性时，应采用实验室仪器方法《食品安全国家标准原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T

22388-2008）对三聚氰胺结果进行确证。

附录A

快速检测方法性能指标计算表

表A.1性能指标计算方法

样品情况a

检测结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

灵敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特异性（p-，%）

p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；

b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位：北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）

验证单位：山东省食品药品检验研究院、四川省食品药品检验检测院、江南大学

主要起草人：史娜、吴燕涛、孙蕊、王丽、潘攀、张丽华

第三篇：WB03 腐竹中二氧化硫的快速检测操作视频配音稿概要

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腐竹中二氧化硫的快速检测操作视频配音稿

首先，进行样品处理，将腐竹剪碎，混合均匀备用。打开电子秤，取一样品杯，称取1.0g腐竹。取量筒，量取49mL蒸馏水，加入样品杯，混匀。再往样品杯中加入0.5mL亚硫酸盐提取液，超声浸泡10min，期间振荡数次。

接下来进行检测，浸泡液中取上清液2.5mL加入比色皿，再加入3滴检测液A，吹吸混匀。打开速测仪，设置好项目参数，将比色皿放入仪器内调零。取出比色皿，加入3滴检测液B，吹吸混匀，静置5min，放入仪器进行检测。

经速测仪检测，此样品中亚硫酸盐的含量＞250.0mg/kg，超出亚硫酸盐的标准限量200.0mg/kg，因此，结果判断为超标。可以将腐竹样品留存，送相关部门作进一步检测。

第四篇：WB03 肉串中亚硝酸盐的快速检测操作视频配音稿概要

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肉串中亚硝酸盐的快速检测操作视频配音稿

首先，进行样品处理，将肉串剪碎，混合均匀备用。打开电子秤，取一样品杯，调零，称取1.0g肉串。取一量筒，吸取49mL蒸馏水，加入样品杯，混匀，放入超声波提取仪超声10-15min。

吸取超声后的浸泡液20mL加入小样品杯，加入0.5mL亚硝酸盐提取液1号，再加入0.5mL亚硝酸盐提取液2号，吹吸混匀，静置1min。之后进行过滤操作，将浸泡液缓慢倒入滤纸中，滤液备用。

接下来进行检测，取比色皿，加入1.0mL滤液，1.0mL蒸馏水，再加3滴检测液A，吹吸混匀。打开速测仪，设置好项目参数，将比色皿放入仪器内调零。取出，加入3滴检测液B，吹吸混匀，静置3min，放入仪器进行检测。

经速测仪检测，此样品中亚硝酸盐的含量＞200.0mg/kg，超出亚硝酸盐的标准限量30.0mg/kg，因此，结果判断为超标。可以将肉串样品留存，送相关部门作进一步检测。

第五篇：酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮

酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮代谢物

摘要建立养殖虾类中 AOZ残留 ELISA筛选方法。方法: 酸性条件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去杂质后进行 ELISA分析。结果: 方法最低检测限为 013 Lg/kg, 向样品中添加浓度为 015、110和 310Lg/kg3个梯度标准品溶液时,平均回收率范围为 9017% ~ 9519%, RSD 为 4124% ~ 5142%。结论: 实验证明该方法适合养殖虾类中 AOZ残留筛选。

关键词：虾肉;呋喃唑酮代谢物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特灵,是一种广谱抗菌药物，属于硝基呋喃类药物，是人工合成的化学药。常被掺放在饲料中，用于水产品养殖传染病的预防与治疗[1]。药代动力学研究表明，呋喃唑酮在动物体内的代谢非常快，现已明确此类抗生素的原型在体内 4 d 后，就已完全分解成其代谢物，所以分析呋喃唑酮时，只能分析其代谢物[2]。经研究表明，呋喃唑酮的代谢物中有相当数量是以其完整侧链 3-氨基-2-恶唑烷酮即 AOZ 与蛋白结合的残留物形式存在, AOZ 进一步代谢可产生具致癌、致突变作用的羟乙基肼[3]，因此检测呋喃唑酮代谢物(AOZ)的残留更具有现实意义。呋喃唑酮在畜产品和水产品中的残留，通过食物链传递给人类,会使人体受到损害。另外,其作为人畜共用药，长期微量摄入易使人体产生抗药性，导致呋喃唑酮药物失去医疗功效[4]。

1990 年 7 月欧盟颁布 2377/90/EEC 条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为 A 类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为 1.0 μg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995 年起欧盟、日本、美国等都开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼，虾及禽类进行残留检测[5]。同许多国家一样，我国农业部制订的 NY5070-2002《无公害食品水产品中鱼药残留限量》及 GB18406.4-2001《无公害水产品安全要求》规定，水产品中不得检出呋喃唑酮，同时禁 止在饲料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中残留的监测方法主要有高效液相色谱法[7-8]、酶联免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶联免疫法已受到广泛重视。本试验主要 使用酶联免疫法对出口虾中呋喃唑酮代谢物AOZ 的残留做快速检测。

福建省诏安县海利水产有限公司，是一家集水产品加工、销售、研究、开发和养殖于一体的大型出口企业。该公司于2005年引进投建，厂房和生产布局按照《出口食品生产企业卫生注册登记管理规定》和美国FDA法规及欧盟指令进行设计建造，厂区占地面积八万平方米，全封闭配套中央空调的水产加工车间二万平方米，生产车间配套高效臭氧杀菌设施，制冷水机和大型制冰机等各种先进加工设备，冻库储存能力达6000吨，同时配套建设大型对虾养殖场及虾苗孵化场，拥有一支高素质员工队伍，年加工生产水产品15000吨以上，产品近二十种，主要有冻生虾、冻熟虾、冻面包虾、寿司虾、冻鱿鱼、冻罗非鱼等。公司秉承共同发展的目标，不断完善质量管理体系，执着追求品质,先后获得了《卫生注册证书》、《输美水产品HACCP验证证书》，2005年11月通过了BRC认证，2006年1月通过了ISO9001认证，2008年通过了欧盟相关质量认证，产品获得了国外消费者的肯定和喜欢，远销日本、美国、加拿大、墨西哥和香港等国家和地区，在国外赢得了市场。公司自建成投产以来，企业迅速发展壮大。

1材料与方法

1.1

样品

均来自福建省海利水产有限公司。

1.2

主要仪器及设备

MK3 型酶标仪: Thermo 公司；Scientz-10 型均质机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 电子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；4K15 型高速冷冻离心机：Sigma公司；HH-w600s 恒温水箱：山东鄄城新科教学仪器厂；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

试剂与溶液

呋喃唑酮代谢产物-AOZ 试剂盒：北京望尔生物技术有限公司；灵敏度为 0.125 μg/kg，包括：AOZ 标准溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、浓缩缓冲液、浓缩提取/洗涤液、衍生试剂、浓缩酶标记物、底物溶液、反应终止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

样品处理

虾去头去壳，取可食用部分，制成均质物。

1.4.2

样品制备

1）称取 1 g 已均质的样品于 50 mL 离心管中，依次加入 4 mL 超纯水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生试剂，漩涡振荡 1 min。置 37 ℃的恒温培养箱中温育，静置过夜（约 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍缓冲液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振荡混合约 1 min。

3）离心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯层）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮气吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先将残留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振荡 1 min。

5）将玻璃试管置于 80℃～100℃热水浴中约 3min，以减少水相与有机相间的乳化现象。6）离心 10 min（3 000 r/min），吸去上层液（正己烷），弃掉，再吸取下层液（水层）备用。

1.4.3测定

1）将 AOZ 试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。

2）取出相应数量的微孔，各个标准液和待测样品各做 2 个平行样，做好记录。

3）于适当的微孔中分别加入 50 μL 标准溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前处理的样品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀释的酶标记物。

6）轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温（25 ℃）下避光静置温育 50 min。

7）微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，轻敲盘子四周，使其充分混合。

10）于室温（25 ℃）下避光静置温育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反应终止液。

12）用酶标仪于波长 450 nm 下判读。

1.5

数据处理

1）计算（B/B0）×100 值。用样品和标准溶液吸光度值（B）除以零标准吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值为纵坐标，以样品浓度的对数值为横坐标，做标准对数曲线。

3）根据每个样品的 B/B0值就可以从曲线上读出相对应样品的浓度

2结果

2.1

标准曲线的绘制

AOZ 标准品的 ELISA 检测结果见表 1。

2.4

试验过程中的注意事项

1）A回温试剂（20℃-24℃）。B恒温孵育，避免光线照射。

2）、将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。

3）加入50ul标准或处理好的样品液到各自的微孔中，每个孔加入样品或标准时注意更换移液器的吸头。

4)加入50ul酶标记物溶液（红帽）到每一个微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗体溶液（黑帽）到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育1小时，覆盖上薄膜。

6)倒出孔中的流体将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250ul样品洗涤缓冲液充入孔中，重复两次。

7)加入100ul基质/发色剂到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟。

8）加入100ul反应终止液到每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取吸光值。

9）试剂盒内容物要完全回稳后再进行操作，否则，会出现吸光值偏低或没有吸光值。

10）温浴时若室温太低或太高，请适当延长或缩短温浴时间，或直接在恒温培养箱中进行。

11）加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

12）加样和洗板过程中，要避免微孔间的相互污染。

13）整个试验过程中，勿使微孔干燥。

结论

本试验用酶联免疫法检测了海利水产有限公司中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留状况，结果表明绝大多数的水产品符合规定，只有极少数部分有残留。用酶联免疫法对虾肉呋喃唑酮代谢物 AOZ 残留进行测定，操作简易，不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，作为一种快速筛选手段，在食品工业中有着广阔的推广应用前景，尤其在水产品出口企业中，但酶联免疫试剂盒的价格将是最大的制约因素。

参考文献：

[1] 景立新,孙武平,杨钦德,等.分光光度法快速测定海虾中呋喃唑酮残留量[J].光谱实验室，2006(5)：547-549

[2] 周新,张欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 测定鱼干中的呋喃唑酮代谢物[J].分析测试学报,2007,26(9):262-263

[3]许蓓,徐志祥,王凤侠,等.动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究[J].食品研究与开发,2007,28(12):145-148

[4]罗杰,李健.呋喃唑酮间接竞争 ELISA(ciELISA)检测法的建立[J].中国海洋大学学报,2005,3,35(20):213-218

[5]许春兰,院榕生,刘小根,等.酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的检测中的应用

[J].食品研究与开发,2007,28(5):124-126

[6]吴富忠, 欧阳立群.水产品中呋喃唑酮、呋喃西林药物残留的HPLC 法测定[J].中国卫生检验杂志,2006,16(7):812-813

[7]艾晓辉，刘长征，罗玉霜，等.水产品中呋喃唑酮含量的高效液相色谱检测法[J].淡水渔业，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友穷，毕士川，等.高效液相色谱法测定水产品中呋喃唑酮的残留量[J].色谱，2005，23(1)：114

[9] 沈美罗,宋红波,耿雪冰，等.酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留[J].水产学报，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹会兰.原子吸收法间接测定呋喃唑酮[J].分析试验室,2006,25(8):88-90