牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新

第一篇：牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新

牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法 安全要求

该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。急救措施

皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。适用范围

该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。职责

进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。

检测原理

用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。方法灵敏度

本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1µg/kg，定量限均为2µg/kg。

注意事项

7.1 整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2 mL/min； 7.2 C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1 阿维菌素标准品

含量≥95.7% 8.2 多拉菌素标准品

含量≥92.6% 8.3 伊维菌素标准品

含量≥93.9% 8.4 乙腈

色谱纯 8.5 甲醇

色谱纯 8.6 三氟乙酸酐 8.7 三乙胺

8.8 异辛烷

8.9 N-甲基咪唑

8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者

8.11 固相萃取柱洗涤液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 µL，混匀。8.12 衍生化试剂

a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.13 1 mg/mL 阿维菌素类药物混合标准贮备液：

分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1 mg/mL的混合标准贮备液，-20℃保存，有效期6个月。

8.14 10 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：

准确量取混合标准贮备液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。8.15 1 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：

准确量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。

8.16 高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17 分析天平

感量0.00001 g 8.18 天平

感量0.01 g 8.19 振荡器

8.20 离心机 8.21 涡旋混合仪

8.22 聚丙烯离心管

mL

8.23 氮吹仪

8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者 8.25 微孔滤膜

0.45 µm 检验步骤 9.1 试料的制备

9.1.1 取混匀后的供试样品，作为供试试料。

9.1.2 取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。

9.1.3 取混匀后的空白样品5 g,添加1 µg/mL的工作液0.05 mL，作为空白添加试料。

9.2 标准曲线的制备

精密量取1 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

9.3 提取

9.2.1 称取(5±0.05)g试料，于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5000 r/min离心10 min。

9.2.2 收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3 合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 µl，混匀，备用。9.4 净化

9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗涤液5 mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2 将备用液过柱，抽干。加异辛烷3 mL洗涤，抽干。

9.4.3 用乙腈5 mL洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中，50 ℃下用氮气吹干。备用

9.5 衍生化

向试管中依次加入衍生化试剂A液100 µL和衍生化试剂B液150 µL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 µL，涡动10 s，密闭反应30 min，加650 µL甲醇混匀。经0.45 µm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。

9.6 测定 9.6.1 色谱条件

9.6.1.1 色谱柱：C18柱，（250×4.6 mm，粒径5 µm）；或相当者； 9.6.1.2 流动相：乙腈+水（90+10，v/v）；

9.6.1.3 流速：1.8mL/min；

9.6.1.4 检测波长：激发波长： 365 nm，发射波长：475 nm； 9.6.1.5 柱温：40 ℃； 9.6.1.6 进样量：20 µL。9.7 测定法

9.7.1 试样溶液和50 ng/mL的标准溶液，作单点校准，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样溶液测定过程中应参插注入标准溶液，以便准确定量。空白、添加、标准溶液高效液相色谱图见附录及附加说明。9.7.2 试剂空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9.8 结果计算和表述

试料中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量（μg/kg），按下式计算：

X = 式中:

X

——试料中相应的阿维菌素类药物的残留量，μg/kg； C

——试样溶液中相应的阿维菌素类药物的浓度，ng/mL； V

——衍生化后试样的总体积，mL； m

——供试试料的质量，g。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.9 结果判定

CV m9.9.1 线性范围

阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在2～300 ng/mL范围考察线性，计算回归方程，其相关系数应≥0.995。9.9.2 准确度

本方法在2～50 μg/kg添加浓度的回收率为70～120 %。9.9.3 精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。9.9.4 判定

当方法学考察结果符合上述规定时，供试组织中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量单个及之和Xi＜检测限时，判定为未检出；方法检测限≤Xi＜最高残留限量时, 判i1i1nn定为符合规定； Xi1ni≥最高残留限量时，判定为不符合规定。

注：仅当Xi≥方法检测限时，Xi为参与阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素总残留量求和计算，故求和公式中0≤n≤3。

9.10 附录及附加说明

阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶中的最高残留限量

药物名称 阿维菌素 多拉菌素 伊维菌素

标志残留物 阿维菌素

多拉菌素 22，23-二氢伊维菌素

动物品种

牛 牛 牛

组织

奶 奶 奶

MRL（µg/kg）不得检出 不得检出 10

附 录 A（资料性附录）高效液相色谱图

LU ***00510152025

图A.1 牛奶空白色谱图

minLU ***200510152025min

图A.2

阿维菌素类药物标准溶液色谱图（50 ng/mL）

LU ***020510152025min3

图A.3 牛奶中空白添加阿维菌素类药物色谱图（10 ng/g）

图中色谱峰: 1-阿维菌素；2-多拉菌素；3-伊维菌素。

第二篇：手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

作者单位：(浙江大学药学院药物分析和药物代谢研究室，杭州 310031)【摘要】 采用chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，建立了正相高效液相色谱(nphplc)法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。经优化，以正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v)为流动相，流速0.5 ml/min;检测波长261 nm。在此条件下，恩替卡韦与光学异构体分离度>4.2;光学异构体的检出限为0.12 mg/l，在0.25～4.0 mg/l浓度范围内有良好的线性关系;日内与日间精密度rsd<4.0%;按标准加入法计算，加样回收率在87.0%～100.8%之间;rsd<3.0%;按外标法计算，加样回收率在98.2%～110.4%之间;rsd<3.0%。本方法可作为恩替卡韦原料药中光学异构体杂质限量的控制方法。

【关键词】 恩替卡韦，光学异构体，高效液相色谱法，手性拆分

引 言

慢性乙肝病毒感染一直是全球公共卫生的难题，开发抗乙肝病毒药物也一直是个热点。目前，我国临床上应用的抗病毒治疗药物主要有两类： α干扰素和核苷或核苷酸类似物，主要包括拉米夫定、阿德福韦和阿昔洛韦[1,2]。2005年3月美国fda批准了新一代抗hbv核苷类似物恩替卡韦(entecavir，etv，商品名baraclude)上市[3]。恩替卡韦是一种鸟嘌呤核苷类似物(图1)，图1 恩替卡韦及其光学异构体的化学结构

fig.1 structures of entecavir and its optical isomer在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物，拮抗hbv所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dgtp)，抑制hbvdna聚合酶和逆转录酶，阻断hbv复制。细胞内作用半衰期为15 h，在人体内不被肝细胞代谢，主要从肾脏排出体外。同时，其耐药性好，可有效治疗慢性乙型肝炎，临床应用前景良好[4,5]。

由于手性药物在合成过程中可能引入光学异构体杂质，故采用手性分离方法检查合成产品中光学异构体含量。恩替卡韦及其光学异构体手性分离方法未见报道。本研究采用直接手性hplc法拆分两光学异构体，建立恩替卡韦中光学异构体杂质限量检查方法。

实验部分

2.1 仪器、试剂及材料

lc10a型高效液相色谱仪、spd10a型紫外可见光检测器(日本岛津公司);chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本diacel 公司)。乙醇(tedia)、正己烷(burdick & jackson)及异丙醇(tedia)均为色谱纯;三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司);三乙胺(分析纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂);恩替卡韦及其光学异构体(99.87%，浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。

2.2 色谱条件

色谱柱：chiralpak adh手性柱;流动相：正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v);流速0.5 ml/min;检测波长261 nm;柱温：室温;灵敏度：0.005 aufs;进样量20 μl。

2.3 溶液制备

2.3.1 恩替卡韦供试液及自身对照液的制备 准确称取适量恩替卡韦于50 ml容量瓶中，加乙醇超声溶解，定容，作为储备液(500 mg/l)。准确移取储备液2 ml于10 ml容量瓶中，加正己烷异丙醇(50∶50，v/v)混合溶液(以下简称混合稀释液)定容，得恩替卡韦的供试品溶液(100 mg/l)。取适量供试品溶液，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。

2.3.2 光学异构体对照品溶液的制备 准确称取适量异构体于100 ml容量瓶中，加乙醇超声溶解，定容，作为异构体的储备液(50 mg/l)。准确移取储备液2 ml于10 ml容量瓶中，加混合稀释液定容，作为异构体的对照品溶液(10 mg/l)。

2.3.3 恩替卡韦与异构体混合溶液的制备 取2 ml恩替卡韦供试品溶液和4 ml异构体的储备液于10 ml容量瓶中，加混合稀释液定容，即得浓度各为20 mg/l的混合溶液。

结果与讨论

3.1 不同极性调节剂对保留时间、柱效和分离度的影响

由表1可见，当流动相为正己烷和异丙醇时，调节比例，样品和异构体未达基线分离。加入三氟乙酸，保留时间随着三氟乙酸的增加有所减少，仍未达基线分离，但峰型好。加入三乙胺，两者未分开，但能使异构体的保留时间缩短。再改变正己烷和异丙醇比例，两者分离，但是分离度仅为1.18，理论塔表1 流动相的优化板数都小于650。在流动相中加入乙醇后发现流动相中的乙醇含量明显影响保留时间、分离效果和理论塔板数。乙醇含量越高，理论板数越大。同时乙醇和异丙醇的比例也明显影响分离效果，乙醇比例增高，分离度和理论板数提高，保留时间也增加。当流动相为正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.1∶0.05，v/v)时，分离效果理想(图2c)。

3.2 酸碱性对柱效、分离度和保留时间的影响

3.2.1 三乙胺的影响 固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸(70∶12∶18∶0.1, v/v)的比例，改变三乙胺用量，考察三乙胺含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三乙胺含量增加，理论板数和分离度逐渐提高，保留时间稍有缩短。当流动相中三乙胺比例为0.05%和0.1%时，理论板数、分离度和保留时间基本一致。考虑到碱性大对手性柱的损害大，故选择三乙胺用量为0.05%。

3.2.2 三氟乙酸的影响 固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三乙胺(70∶12∶18∶0.05, v/v)的比例，改变三氟乙酸用量，考察三氟乙酸含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三氟乙酸含量的增加，分离度逐渐降低，但均大于3.5。保留时间逐渐变小，理论板数变化不明显。综合考虑选择三氟乙酸含量为0.05%。图2 流动相对恩替卡韦及其光学异构体分离的影响

a.正己烷异丙醇三氟乙酸(nhexane: isopropyl alcohol: trifluoroacetic acid)(60∶40∶0.05，v/v);b.正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid)triethylamine(tea)(75∶20∶5∶0.1∶0.05，v/v);c.正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid: tea)(70∶12∶18∶0.1∶0.05, v/v)。表2 流动相中三乙胺和三氟乙酸含量对恩替卡韦光学异构体拆分的影响

3.3 系统适用性、检出限和线性关系

取配制的恩替卡韦与异构体的混合溶液，连续进样5次，记录峰面积，得恩替卡韦峰面积rsd为2.3%，光学异构体rsd为3.1%;分离度为4.3;恩替卡韦的保留时间约为21～23 min;光学异构体的保留时间约为30～33 min。理论板数按恩替卡韦峰计>2200，色谱图见图3。

取混合溶液(恩替卡韦及其光学异构体各约20 mg/l)，用混合稀释液逐步稀释，测得恩替卡韦及其光学异构体的检出限均为0.12 mg/l(s/n=3)。

外标法：精确移取适量异构体对照液至10 ml容量瓶中，用混合稀释液定容，制成异构体浓度分别为4.08, 2.04, 1.02, 0.51和0.255 mg/l的系列溶液进样。标准加入法：精确移取异构体对照液4, 2, 1, 0.5和0.25 ml，分别置于10 ml容量瓶中，每份加入恩替卡韦储备液2.00 ml，用混合稀释液定容，所得系列溶液中恩替卡韦浓度为100 mg/l，光学异构体浓度分别为4.08, 2.04,图3 恩替卡韦及其光学异构体的色谱图

a.恩替卡韦和光学异构体的混合溶液(mixture of entecavir and optical isomer);b.光学异构体(optical isomer);c.恩替卡韦(entecavir)。1.02, 0.51和0.255 mg/l，进样，记录色谱图。以浓度(x)对峰面积(y)作线性回归，外标法回归方程为y=27206x-2387.3，r=0.9992;标准加入法回归方程为y=27005x+58.287，r=0.9998。光学异构体在0.25～4 mg/l浓度范围内有良好的线性关系。由曲线的斜率可知，两条标准曲线几乎平行，说明恩替卡韦的存在对微量光学异构体的测定影响不大。

3.4 稳定性实验、精密度与相对保留时间

取恩替卡韦(100 mg/l)和光学异构体(1.0 mg/l)混合液，于0, 15和25 h进样测定，观察光学异构体峰面积变化情况。结果测得峰面积rsd为2.1%，表明测定溶液室温放置25 h稳定。

取适量恩替卡韦储备液9份，分别加入不同量的光学异构体溶液，用混合稀释液稀释，制成恩替卡韦浓度各为100 mg/l，含光学异构体高、中、低浓度分别为2.0, 1.0和0.5 mg/l的测定液，每个浓度平行3份，每份重复进样2次，取平均峰面积计算。同法于不同天操作，计算日间精密度。测得日内精密度rsd<1.5%，日间精密度rsd<4.0%(n=3)。

光学异构体的相对保留时间(tr1)以恩替卡韦峰的保留时间(tr2)为参比，计算光学异构体的相对保留值(r= tr1/tr2)。光学异构体相对于恩替卡韦的保留值为1.429±0.004，rsd<1.0%。

3.5 光学异构体的浓度校正因子

准确称取适量恩替卡韦和光学异构体，分别加乙醇溶解、定容，制成储备液。准确量取各储备液适量，加混合稀释液稀释成浓度各为20 mg/l的混合溶液。再逐步稀释成4, 2, 1, 0.5和0.25 mg/l，进样，记录色谱图。根据不同浓度下恩替卡韦和光学异构体所得色谱峰面积，按下列公式计算光学异构体的浓度校正因子(f)。测得该光学异构体的浓度校正因子f=1.10±0.04，rsd=3.96%。f=(a样/a异)·(c异/c样)3.6 回收率实验

按日内精密度测定项下方法配制溶液，根据测得浓度和理论浓度分别计算标准加入法和外标法回收率，结果见表3，获得满意的回收率。表3 光学异构体的回收率实验

3.7 恩替卡韦原料药中光学异构体杂质的检查

取适量恩替卡韦，加乙醇制成0.5 g/l储备液，取该溶液适量，用混合稀释液稀释5倍作为供试品溶液。取供试品溶液适量，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。取对照溶液20 μl进样，调节仪器灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%左右;再精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μl，进样，记录色谱图至40 min。如果在相对恩替卡韦峰保留时间(1.43±5)%处出现色谱峰，峰面积乘上1.10后与自身对照溶液比较，不得大于对照溶液主成分峰面积(<1%)。结果3批样品均未检出光学异构体杂质。

【参考文献】

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