农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

第一篇：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

整理人：早熟组赵凤利

一、准备试剂：

1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；

2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。

1).500 mM MES(Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃

2).20 mM Na3PO4·12H2O(BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃

3).1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。

二、实验步骤：

1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；

2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；

3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；

4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；

5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。

6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；

如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。

7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；

8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；

9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；

10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；

11.侵染前，用记号笔标记待转区域；

12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中

13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；

14.将侵染后的烟草放回培养室

15.2-3天后：

1).亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；

2).启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。

参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.

第二篇：六年级下册洋葱表皮细胞实验教案范文

分组实验内容：观察洋葱表皮细胞课案

实验名称：观察洋葱表皮细胞实验内容：教科版小学科学六年级下册，第一单元《微小世界》第5节《用显微镜观察身边的生命世界

（一）》观察洋葱表皮细胞。实验类型：分组实验

实验准备：教师：按学生妹三人一组，每组：洋葱、小刀、清水、滴管、镊子、吸水纸、载玻片、盖玻片、显微镜、放大镜。学生：书本、抹布。实验教学过程：

一、谈话导入

师：这是一个洋葱，如果从它的内表皮上揭下一块，你能看到些什么？如果用上放大镜又能看到些什么？如果用上显微镜又能看到些什么？

二、制作洋葱表皮玻片标本

1、师：为了能更好地观察它，首先我们要制作一个玻片标本。（师演示）1)在一个干净的玻璃载片中间滴一滴清水

2)用镊子把取下的洋葱表皮放到栽玻片的水滴中央，注意标本要平展开，不能折叠。

3)用盖玻片（或另一个玻璃载片）倾斜着盖到标本上面，放盖玻片时，先放一端，再慢慢放下另一端，注意不要有气泡。

4)从标本的边缘滴一滴稀释的碘酒，并把玻片微微倾斜，再用吸水纸吸掉多余的水。

2、学生以组为单位制作玻片标本

二、用肉眼和放大镜观察洋葱表皮

1、先用肉眼观察洋葱表皮，将看到的画在科学记录本上（或书上13页）

2、材料员发给每位同学放大镜，大家用放大镜观察洋葱表皮将看到的画到科学记录本或书上。

3、交流用肉眼和放大镜观察到的有何不同。

三、用显微镜观察洋葱表皮

实验过程：

1、用小刀将洋葱表皮剥下一薄层，用显微镜观察。

2、制作洋葱切片：先取下一小片，用镊子取下，轻放在滴了碘酒的载玻片上，用盖玻片从右向左滑动放在切片上，再用吸水纸吸去多余的水。

3、将制作好的切片放在显微镜下，调好焦距观察

4、观察时用左眼观察显微镜，右眼看图，右手画出细胞形状图

5、填好实验报告册，得出结论 实验结论：

洋葱表皮是由无数细胞构成的。生物体是由细胞构成的，的。细胞是有生命的，它会生长、繁殖、变化、衰老和死亡。生物体生长发育的过程中就是在它生长、繁殖、变化的过程，生物体的衰老、死亡也是由细胞的衰老、死亡引起的 师：如果我们将洋葱表皮的玻片标本放到显微镜下观察，又会有什么新的发现呢？

2、师出示显微镜，介绍各部分的名称、功能及使用方法（如果学生五年级时已使用过，也可叫学生介绍老师指导更正，具体内容见13页）

3、每2人一个显微镜观察洋葱表皮，不会使用的同学可根据13页的提示进行操作。每组的材料员监督大家进行规范的操作，对不规范操作且不改正的同学取消其使用资格。同样将显微镜下的发现画到科学记录本或书上。

4、交流我们在显微镜下的发现

（洋葱表皮由一个个比较规则的多边形组成。洋葱表皮上的一个个小房间似的结构，是洋葱的细胞。阅读12页的资料，了解胡克发现细胞的故事。让学生谈谈对细胞的认识。）