基于合成生物学技术的微生物燃料电池菌种分子育种研究范文

第一篇：基于合成生物学技术的微生物燃料电池菌种分子育种研究范文

基于合成生物学技术的微生物燃料电池菌种分子育种研究

雍阳春*，孙建中

江苏大学生物质能源研究所，江苏省镇江市学府路301号，212013；*email:

微生物燃料电池(MFC)是一种将生物可利用有机质(包括工农业废弃物、污水中的有机物等)直接转化为电能的新型生物产能装置，可同时实现有机污染物处理和直接产电。其操作条件温和、能量转化效率高、绿色无污染，是一种理想的节能环保生物能源新技术(1，2)。但是，高性能产电微生物菌种的缺乏严重制约了MFC的工业化进程。

本实验室系统分析研究了用于MFC的产电微生物的底物电子释放机制和胞外电子传递机制，在此基础上首次提出并通过合成生物学技术对产电微生物进行定向改造，使微生物的电化学活性及其MFC的产电性能大幅提高(3，4)。一方面，我们研究发现微生物胞内乳酸合成途径是造成胞内电子释放效率低下的主要原因之一。我们通过代谢工程手段，将乳酸合成途径阻断(即敲除乳酸合成关键酶基因ldhA，构建基因工程菌ldhA−)，成功将胞内电子释放到胞外电极，提高了MFC的产电性能(3)。在双室MFC微生物燃料电池中进行研究发现，基因工程菌ldhA−产电性能较原始菌株大幅提高(最高电流提高约30倍，稳定时间至少延长2倍。另一方面，微生物细胞膜通透性差是制约微生物胞内电子向胞外传递效率的瓶颈。我们通过将来源于Pseudomonas的大孔径细胞膜孔蛋白(OprF)人工异源表达在大肠杆菌细胞外膜，通过荧光和酶学方法证实该蛋白的表达使大肠杆菌膜通透性显著提高。进一步，在恒电位放电实验和MFC中研究发现，该基因工程菌(oprF)产电性能大幅提高，并进一步对其机制进行了深入研究。本研究表明微生物菌种的分子育种对提高MFC性能起着关键性作用；而合成生物学技术的应用使MFC菌种的分子育种研究迈上了新的台阶，将加速推进MFC的工业化进程。

参考文献：

1.Logan BE and Rabaey K.2012.Science, 337:686-690.2.Yong YC, et al.2012.ACS Nano, 6: 2394-2400.3.Yong YC, et al.2012.Electrochemistry Communications, 19: 13-16.4.Yong YC, et al.2011.Biosensors & Bioelectronics, 30: 87-92.

第二篇：微生物制药技术及研究前景

微生物制药技术及研究前景

摘要：在人类基因组工程和生物信息学的推动下，生物技术创新日新月异，生物医药产业正在经历一个飞速发展的新阶段，工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。本文通过对研究微生物制药技术的研究和前景的综述，介绍了微生物制药的原理和方法以及可能对人类医学事业产生的积极影响，旨在进一步明确为生物制药在社会发展过程中重要地位。

关键词：微生物制药 生物制品 抗生素

微生物来源的药物通称为生物药物，是微生物在其生命活动过程中产生的，能以极低浓度抑制或影响其他生物机能的低分子量代谢物。包括抗生素和具有其他药理作用的微生物次级代谢产物，以及以微生物次级代谢为先导化合物、通过生物或化学方法制得的衍生物。20世纪40年代青霉素问世，开创了微生物药物的新时代。抗生素在世界范围内广泛使用，使人类许多传染性疾病得到控制；随着微生物制药的发展，它们在肿瘤化疗、器官移植以及高胆固醇血症治疗等方面也发挥重要作用，成为不可缺少的药物[1]。

微生物制药在医药工业中占有重要地位，半个世纪以来微生物转化在药物研制中一系列突破性的应用给医药工业创造了巨大的医疗价值和经济效益。目前全世界为生物药物的总产量占医药工业总产值的15%左右。在我国微生物制药也是医疗工业的支柱行业之一。

1.微生物制药的概念和特点

微生物制药是利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化技术进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产[2]。

微生物制药工业生产的特点是利用某种微生物以“纯种状态”，也就是不仅“种子”要优而且只能是一种，如其它菌种进来即为杂菌。对固定产品来说，一定按工艺有它最合适的“饭”—培养基，来供它生长。培养基的成分不能随意更改，一个菌种在同样的发酵培养基中，因为只少了或多了某个成分，发酵的成品就完全不同。如金色链霉菌在含氯的培养基中可形成金霉素，而在没有氯化物或在培养基中加入抑制生成氯化的物质，就产生四环素。

2.微生物制药技术

微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物[3]。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容：

2.1菌种的获得

根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来，进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

2.2高产菌株的选育

由于为生物基因突变是对即发生的，人们正在寻求基因的定向突变经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌株，况且，在突变型菌株中又只有一小部分是理想得的正突变体菌株，而有害突变体往往占很大比例；另一方面，从自然界筛选得来的菌株药物代谢合成能力低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条件下，大多只产生不带10mg/L产物[4]，而对于工业生产来说，如果不尽心改良，势必造成成本过高，因而没有工业生产价值；即使是以用于工业生产的菌株，危机不断提高产量、降低成本，军中改良也是手段之一要想使菌种产量不断提高，最根本的还是要依靠本身固有的遗传特性，这就必须不断的进行军中选育、改良。

工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。育种的方法包括：自然选育、诱变育种、杂家育种、基因工程技术改良菌种。

2.2.1自然选育 自然选育是指为生物细胞群体不经人工处理的自发突变进行菌种选育的育种方法。自然选育也称自然分离，主要是对菌种加以纯化，以获得遗传背景较为均一的细胞群体。一般菌种经过多次传代或长期保存后，由于自发突变或异核体和多倍体的分离，使有些细胞的遗传性状发生改变，造成菌种不纯，生产能力下降，亦即菌种退化。因此在工业生产和发酵研究中要经常进行自然分离，纯化菌种。但微生物的自发突变频率很低，正突变频率更低，因而通过自然选育虽能提高菌种生产力或获得某种优良特性菌株，但一般俩说，效率低、进展慢，效果不显著。因此，经常将自然选育和有变育种交替使用，这样可以收到良好的效果。

2.2.2诱变育种

诱变育种使用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，易诱发遗传突变，然后采用渐变、快速和高效的筛选的方法，从中选出所需要的变株。采用这种方法，微生物菌种突变的频率比自发突变有大幅度的提高，但所诱发的遗传性状的改变时随机的，因而需要进行大量的筛选。诱变育种在工业微生物育种中应用最早。当前，发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法之一。

诱变剂育种的方法但很多，了归纳起来可分为物理诱变剂、化学诱变剂、和生物诱变剂三大类。

物理诱变剂包括紫外线、快中子、X射线、γ射线、β射线、激光、微波等。化学诱变剂有烷化剂、嵌合剂、碱基类似物、亚硝酸、抗生素。生物诱变剂有噬菌体和转座引子。

2.2.3杂交育种

杂交育种是将两个基因型不同的亲株的某些遗传信息，通过杂交重新组合与同一个充足体重，形成新的遗传型个体的过程。杂交育种包括准性生殖、接合、原生质融合。其中原生质融合包括选出标记菌株，两亲株分别制备原生质体，原生质体的再生，融合子的选择五个步骤。

2.2.4基因工程技术改良菌种

多年来，由于大量使用甚至滥用抗生素，一直普遍出现耐药菌，人们希望有更多的新抗生素代替现有瓶中，而常规方法从微生物中发现新抗生素已经越来越难，如果采用诱变育种方法来寻找新品种，存在选育周期长、效率低以及盲目性、随机性的问题。基因工程，即重组DNA技术的实际应用，从分子水平上揭开了遗传的奥秘。随着这一技术的不断发展和完善，重组DNA技术已在微生物菌种改良中起着越来越重要的作用，在工业上已经取得有重要意义的成果。

在微生物菌种改良上，重组DNA技术可实现微生物药物的产量单位上的提高，如增加限速酶基因拷贝数，引入抗性基因和调节基因，通过克隆抗生素的全部结构基因改变表达体系提高产量。重组DNA技术还可通过以下四个方面实现菌种改良（1）阻断支路代谢，增加有效组分含量（2）构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌（3）构建生产新型化合物的基因工程菌（4）引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状[5]。

2.3微生物药物产生菌的保藏

原始菌种一半活性较低，不能马上用于生产，必须经理自然分离和人工诱变，需要做大量的工作才能获得稳定的优质菌株，将这个优质菌株保存起来是工业菌株管理的一道必要程序，在发酵工业生产中某种产品能否持续高产，大部分依赖于菌种的稳定性。菌种保存的方法有：(1)移植培养保藏法（2）液体石蜡保藏法（3）沙土保藏法（4）麦粒保藏法（5）低温保藏法（6）冷冻干燥保藏法（7）L-干燥保藏法（8）双层管瓶保藏法（9）液氮超低温保藏法。[6]2.4微生物药物的发酵工艺

根据操作方式不同，发酵工艺分为间歇发酵，连续发酵和流加发酵三种类型，其中流加发酵在生产和科研上应用最为广泛。在发酵工艺中反映发酵过程变化的参数分为物理参数、化学参数和生物学参数三大类，这些参数的变化直接影响到发酵工业的生产率和产物品质。对发酵工艺过程影响较大的是发酵温度、pH值、溶解氧、泡沫、菌体浓度和基质、发酵时间[7]等6个方面，他们分别对发酵过程的影响这里不做赘述。发酵工艺简要步骤如下：

（1）首先要了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。

（2）其次要了解生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提取方法和产品质量。

（3）选择一种较好的化学合成培养基做基础，先做一些试验性实验，考察微生物药物的产量和品质。不断调整各种营养物质和其他物质的配比来改善产品的质量。

（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径[8]。

(6)选择培养及原料时也应考虑经济效益。

2.5微生物药物的分离、精制和鉴别

2.5.1微生物药物的分离提取

微生物药物的分离提取的方法有：溶剂萃取法，离子交换法[9]。2.5.2微生物药物的精致

经过分离提取所得的产品一般仍为粗品，需要进一步精制，由于粗品的纯度较低，量很少，进一步精制主要借助色谱技术。按照分离机理，色谱法可分为媳妇色谱、分配色谱、离子交换色谱和排阻色谱。20世纪60年代以后基于技术的进步发展了高压液相色谱技术，其机理与经典色谱相同，但分离效率大大提高[10]。

2.5.3微生物药物的鉴别

迄今发现的抗生素级其他有生理活性的微生物产物已逾万种，采用各种方法和模型其目的是增加新活性化合物出现的几率，但在筛选中绝大多数化合物都是已知的，所以微生物产物的鉴别在微生物制药工业中也是一个重要步骤[11]。现阶段主要利用的微生物药物快速准确鉴别的技术是LC-UV（液相色谱-紫外光谱连用技术）、LC-MS（液相色谱-质谱联用技术）、LC-IR（液相色谱-红外连用技术）及LC-NMR（液相色谱-核磁共振连用技术）。

3.我国微生物制药的研究进展

过去5年中国创新微生物药物筛选与发现研究获进展，目前已拥有12万株40万份的药用微生物菌株和20万个微生物发酵提取品，微生物产物高通量筛选模型150多个，获得了一批微生物药物先导化合物或候选物，为创新微生物药物研发奠定了良好基础。中国医学科学院医药生物技术研究所所长蒋建东近日披露这一信息时称，中国是拥有生物多样性最多的国家，具有研究开发利用微生物药用资源优势。目前已建立了200万样次的规模化微生物药物高通量筛选平台，每年都有新的微生物药物品种申请临床批件，其中可利霉素已完成Ⅲ期临床试验，力达霉素和埃博霉素等正进行Ⅱ期临床试验。微生物药物已占全球药品市场20%以上，占中国内地市场的35%以上[12]。

4.结语与展望

微生物制药工业在医药工业中所占的比例越来越大，这种技术相比于化学合成的方法更为简便，而且经济效益也更高。微生物制药技术作为一项新兴的技术，在世界各国卫生医疗、环境保护等领域已经取得了卓越的成绩。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。如胰岛素、氨基酸、牛痘等微生物制药技术成熟发展的产物。21世纪初在微生物制药领域中，宝曲这一科研成果成为利用微生物制药成功的典范，尤其是在心脑血管领域占有举足轻重的作用。一方面随着制药工艺的不断完善和成熟，微生物制药必然能够解决更多传统制药工艺所不能解决的问题，有利于加速医药卫生事业的发展。另一方面现代社会以追求绿色高科技，可持续发展为目标，随着能源日益稀缺传统医药发展瓶颈日趋严重，微生物制药将在医疗领域发挥重大作用。

参考文献

[1]吴剑波．微生物制药[M]．北京：化学工业出版社，2002． [2]盛祖嘉.微生物遗传学.第二版.北京：科学出版社，1987 [3]王艳红，贾桂燕，余丽芸，等．微生物制药本科实验教学改革的探索 与实践[J]．安徽农学通报，2011(1)：175—176 [4]岑沛霖，蔡谨，工业微生物学，背景；化学工业出版社教材出版中心，2000 [5]陈代杰，微生物药物学，上海：华东理工大学出版社，1999 [6]中国科学院微生物所《菌种爆仓手册》编著组，菌种保藏手册.北京：科学出版社，1980 [7]郭勇，生物技术制药.北京：中国轻工业出版社，2001 [8]邬行彦等.抗生素生产工艺学.北京：化学工业出版社，1994 [9]严希康.生化分离技术.上海：华东理工大学出版社，1996 [10]杨松成.生物医药学中的液相色谱-质朴连用.北京：中国人民公安大学出版社，1999 [11]顾觉奋.微生物药品化学分析.北京：爵士医学科学出版社，1999 [12]吴杭，微生物药物产生菌功能基因组学研究进展，上海，2000

第三篇：分子克隆3—蛋白质相互作用研究技术

蛋白质相互作用研究技术

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

七、。。

导言

一、多数蛋白质研究工作可分为四个类别：

1.二、蛋白质-蛋白质相互作用研究的3个层次

1.研究的目的是确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，此时要撒大网，因此生理意义暂时不被看重；

2.感兴趣的相互作用蛋白质已被确定，研究的目的是通过详细分析生物学功能，来确定相互作用的生理学意义和影响。

3.某中相互作用已被发现，并且被证实是生理性的，此时研究的目的是提供一种高通量的方法，以发现能够按所需的方式调节这种相互作用的试剂。

三、与蛋白质相互作用直接相关的另一领域是分子模建：

四、各种技术应用分析：

1.所列方案（1~6），不能证明观察到的相互作用是直接或间接的，如果研究目的是确定直接相互作用，最终使用的方法中必须采用纯化的蛋白质。

2.特定蛋白质的内在性质在某种程度上决定了哪种技术能有效的用于分析蛋白质相互作用；`` 3.双杂交和基于GST-融合的筛选方法（方案1，2，3）适用于撒大网式的应用研究。方案2，3只是用来确定体外的相互作用,这种体外的相互作用应当进一步在体内通过单独的方法来证实。

4.对于相互作用在生理上的证实和探索，采用内源蛋白质的免疫共沉淀（方案4）和FRET（方案5）的方法更可取；

5.为快速分析过去已确定的相互作用，双杂交和GST沉降分析具有一些明显的优势；

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用(一)`引言

1.细菌表达的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白被用于直接测定蛋白质-蛋白质相互作用，以及亲和纯化。

2.融合蛋白的设计依赖于所选择的检测方法和计划采用的筛选方式。

[1].对于文库筛选，将尽可能大的探针蛋白包括进去可以增加检测到的相互作用的数目。

[2].如果探针蛋白含有已知的相互作用区，并且他们用于证实预期的相互作用，那么仅含有这些结构区域的融合蛋白可能更好。

3.GST成分可以二聚化并能产生背景。

4.筹划Far Western 印记实验需要考虑的因素：

[1].最重要的因素是：在没有过多降解和不溶解蛋白质的条件下合成融合蛋白的能力。

[2].从不同融合蛋白制备物得到的结果可能有所不同，所以监控融合蛋白的状态是非常重要的，这包括纯化期间和纯化后，如果蛋白质被存放，还包括使用前后。[3].有助于确认蛋白质-蛋白质相互作用特异性的两个对照是 a)用融合蛋白突变体探测，这种突变体可以破坏相互作用； b)用标记GST来探测膜。？

[4].最终，还要确定是否用变性/复性循环来探测膜，这样设计是为了使错误折叠的蛋白质重新折叠成天然构像。

a)从SDS-PAGE转移到膜的蛋白质通常不需要变性和复性，如果在检测SDS-PAGE时没有产生蛋白质-蛋白质相互作用，那么引入变性/复性过程可能产生阳性结果； b)在探测表达文库覆盖印记的滤膜时，许多研究人员发现变性/复性是必需的步骤。[5].5 5.5(二)实验方案

1.Materials [1].缓冲液和溶液 [2].2.Methods: [1].放射标记蛋白探针的制备 [2].探测膜

3.3(三)注意事项

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

(一)`引言

1.GST-pull down 利用了GST对谷胱甘肽偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。该技术对探测蛋白质在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。2.GST-pull down通常有两种应用：

1)确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间新的相互作用；

a)未知蛋白可能受浓度的限制，为确定新的相互作用，未知蛋白质必须以足够的量存在，以使这种相互作用能用所选择的检测方法观察到。b)放射标记的细胞裂解液时最常用的蛋白质来源

c)在实验前要考虑：实验目的，探针蛋白的表达等。2)证实探针蛋白与已知蛋白间可疑的相互作用；

a)各种蛋白质来源可用于确定和探询这种相互作用。

b)用于检测相互作用的方法是由能否获得对靶蛋白的抗体来决定的；如果抗体得不到，那么就可利用S标记的体外翻译蛋白或靶蛋白用表位做标签。必要时，可用编码蛋白的质粒转然培养细胞，以增加分析蛋白质的丰度。c)控制质量作用（如非特异性聚集）的影响，并确认探针蛋白同靶蛋白分子间结合的特异性是非常重要的。

d)结合特异性的最好控制是包括一种带有突变相互作用域的GST融合蛋白，丧

35失与这种突变探针蛋白的结合就表明靶和探针间的正常结合是特异性的。e)测试假定靶蛋白与GST间的结合也很重要。

3)3

这两种实验的设计和实施都有所不同。

3.GST-pull down必须对每个蛋白质复合物的分析进行优化：

1)发生相互作用的缓冲液；

2)与融合（探针）蛋白混合的把蛋白的量；所需材料的量主要由把蛋白的丰度和相互作用的亲和力决定（实验开始时两个参数通常是未知的。）3)清洗球珠的条件； 4.4(二)实验方案 A.材料

1.缓冲液和溶液

1）裂解缓冲液：? 2）50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液：在裂解缓冲液中配。（Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols.It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use.）

3）溶于50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)中的还原型谷胱甘肽（20mmol/L）

（glutathione;γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）

4）

2.专用设备

1)沸水浴

2)翻转样品旋转仪（有，无？）3)谷胱甘肽琼脂糖球珠 3.细胞和组织 4.附加试剂 B.方法

预清除细胞裂解液

1.将细胞裂解液与50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25g GST在4℃翻转混合孵育2h（实验室内如何实现？）。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用1×106~1×107个细胞的裂解液。（细胞裂解液提前制备好是否可以？若提前制备好，放于4℃还是-20℃）

a)预清除步骤主要是从裂解液中除去与GST成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。b)如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么做预清除并不总是必须的。包含两种对照很重要：GST加球珠和仅有球珠。

c)在用35S标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质相互作用时，预清除步骤有助于降低本底。

d)实验的目的是比较GST与GST融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除细胞裂解液。（多少算足够？以蛋白质的浓度定？还是靶蛋白的表达量来定？）

e)试剂有效的混合是成功的关键，为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是500~1000l。

2.在微量离心机上以最大速度在4℃离心混合物2min。（13,000 rpm）3.将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。

探测细胞裂解液

4.设定两个含等量预清除细胞裂解液及50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液的微量离心管。在一个管中加约（~5-10 µg）的GST蛋白，另一管中加约（~5-10 µg）的GST融合探针蛋白。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。两个反应中加入的探针和对照蛋白终浓度应该是相同的。（终浓度相同的意义是什么？如果融合蛋白不纯化，如何确保其浓度相同？）

5.在微量离心机上以最大速度离心样品2min。（13,000 rpm）（谷胱甘肽琼脂糖球珠的分子量，其连上蛋白后是否可以沉淀下来？）

6.在新的离心管中收集上清。这些样品可通过步骤10中的SDS-PAGE进行分析。（进行分析的目的：How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate.以优化实验条件）

7.用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心混合物1min。弃去上清。重复洗三次。（4次---cold spring harbor protocol）8.（可选）加入50l 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心2min。（洗脱方法的缺点：若多次洗脱，最后终体积较大，后续上样较麻烦。所以多数研究者选择将球珠煮沸以使目的蛋白与GST融合蛋白分离。）

9.将球珠（来自步骤7）或洗脱蛋白质（来自步骤8）与等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合。

检测相互作用蛋白质

10.将样品煮沸4min并作SDS-PAGE分析。

11.检测与GST融合蛋白结合的蛋白质的方法取决于细胞裂解液是否被的目的。

5S标记以及实验a)如果目的是检测与融合蛋白结合的所有的35S标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用X线胶片曝光进行放射自显影。

b)如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从SDS-PAGE转移到膜上，进行免疫印迹分析。

c)如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色。

(三)注意事项

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 1.缓冲液和溶液 2.专用设备 3.细胞和组织 4.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 5.缓冲液和溶液

6.专用设备 7.细胞和组织 8.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

(一)`引言(二)实验方案(三)注意事项

第四篇：大豆重要农艺性状的QTL定位及分子标记辅助育种研究

大豆重要农艺性状的QTL定位及分子标记辅助育种研究 大豆重要农艺性状大多数是数量性状，受多个基因控制，其表现很大程度上受环境的影响。利用分子标记构建饱和的大豆分子连锁图谱，可用来研究大豆基因组的排列和特征，标记和追踪有经济意义的基因，分析复杂的农艺性状的遗传特征，并且发现和克隆控制农艺性状的基因。本研究利用黄淮夏大豆科新3号为父本、中黄20为母本杂交得到192个F2:3家系，利用F2分离群体构建的含122个SSR标记、覆盖1719.6cM、由33个连锁群组成的连锁遗传图谱。利用复合区间作图法，对F2:3家系的有效分枝数、主茎节数、百粒重、蛋白质含量和油份含量等农艺性状的调查数据进行QTL分析，共检测到三个与株高相关的QTL，贡献率均为6％；一个与主茎节数相关的QTL，贡献率为6％；一个与有效分枝数相关的QTL，贡献率为6%；一个与单粒重相关的QTL,贡献率为5%；三个与百粒重相关的QTL，贡献率分别为10%、9%和7%；两个与蛋白质含量相关的QTL，贡献率分别为5％和6%；一个与油分含量相关的QTL，贡献率为8％。同时，利用东北春大豆绥农14为父本、绥农20为母本杂交得到580个F2分离群体。利用单标记分析方法对90个单株的株高、节数、荚数、蛋白质含量和油分含量等农艺性状的调查数据进行了QTL分析，检测到两个与株高相关的QTL，贡献率分别为42%和23%；三个与节数相关的QTL，贡献率分别为35%、17%和11%；两个与荚数相关的QTL，贡献率分别为13%和14%；两个与秕粒数相关的QTL，贡献率分别为30%和17%；两个与生物重相关的QTL，贡献率分别为12%和11%；一个与百粒重相关的QTL，贡献率为16%；三个与虫食率相关的QTL，贡献率分别为11%、12%和13%；三个与病粒率相关的QTL，贡献率分别为10%和13%。同时利用复合区间作图法对东北春大豆群体的F2分离群体的农艺性状的数据进行QTL分析，检测到一个与株高相关的QTL，贡献率为23%；一个与百粒重相关的QTL，贡献率为7%；一个与虫食率相关的QTL，贡献率为12%；一个与病斑率相关的QTL，贡献率为25%。这些标记为本试验的进一步研究奠定了基础，可以应用于分子标记辅助育种，为培育具有优良农艺性状的高产、高油或高蛋白品种提供理论依据。

关键词：大豆连锁遗传图谱SSR标记复合区间作图法QTL 贡献率

第五篇：聚羧酸高效减水剂的低温合成技术及性能研究

聚羧酸高效减水剂的低温合成技术及性能研究

---青岛鼎昌新材料 引言近年来，混凝土外加剂的生产已经朝着高性能、无污染方向发展。以聚羧酸系为代表的第三代高性能减水剂大量应用于大型建设工程。该类减水剂的主要优点是掺量低、减水率高、高分散性、高保坍性、引言

近年来，混凝土外加剂的生产已经朝着高性能、无污染方向发展。以聚羧酸系为代表的第三代高性能减水剂大量应用于大型建设工程。该类减水剂的主要优点是掺量低、减水率高、高分散性、高保坍性、引气量小、不泌水等，是配制高强度、高耐久性、大流态等高性能混凝土的首选减水剂，并被国内外公认为环保型高性能减水剂，对此类减水剂的合成研究是当前混凝土外加剂研究领域的最热门课题之一。

目前，聚羧酸合成技术已经比较成熟、稳定，但仍存在着合成温度比较高(60 ～80 ℃)，整个反应时间比较长(5 ～7 h)，生产效率低的问题对于在低温条件下、高效合成减水剂的工艺罕见报道，因此开发出一种合成温度低、反应时间短的合成方法显得尤为重要。本研究从降低聚合反应的温度(20 ～25 ℃)入手，以异戊烯醇聚氧乙烯醚、甲基丙烯磺酸钠、丙烯酸、复合引发剂 E 等为原料，在较短反应时间内(2 h)，通过自由基共聚合反应合成聚羧酸高效减水剂，实现一种聚羧酸减水剂的低温合成技术。试验

2． 1 主要原料和设备

异戊烯醇聚氧乙烯醚(TPEG2400)，工业品;甲基丙烯磺酸钠(SAMS)，化学纯;丙烯酸(AA)，工业品;去离子水，工业品;氢氧化钠，分析纯;引发剂 E。

DF-101S 集热式磁力搅拌(河南智诚仪器有限公司);DW-1 型电动搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂);分析天平(上海精密仪器有限公司);NJ-160A 水泥净浆搅拌机(无锡市建鼎建工仪器厂);蠕动泵(保定创锐泵业有限公司)。2． 2 聚羧酸减水剂的制备

一定量的 TPEG2400 单体和 SAMS 置入四口烧瓶中，加入适量的去离子水，开启蠕动泵，于2 h 内匀速滴加引发溶剂 E 及 AA 水溶液，反应过程中温度保持在 20 ～25 ℃，滴加完成后，用 w(NaOH)=40% 的水溶液调节体系 pH 值至中性，即得聚羧酸产品。2． 3 产品性能测试

水泥净浆流动度与 1 h 经时流动度的测量，按照 GB/T 8077-2012《混凝土外加剂匀质性试验方法》，水灰比 0． 29，减水剂掺量 0． 18%，分别测定水泥净浆流动度和水泥砂浆减水率。结果与讨论

3． 1 酸醚比对减水剂分散性能的影响

在 25 ℃条件下，固定甲基丙烯磺酸钠(SAMS)的配比，引发剂 E 用量为 0． 18%((相对于所有单体总摩尔量的百分比，下同)，保持其他操作条件的相同情况下，考查不同酸醚比 n(AA)∶ n(TPEG2400)对减水剂分散性和分散保持性能的影响，试验结果见图 1。

由图 1 可知，随着 n(AA)∶ n(TPEG2400)的增大，净浆流动度逐渐增大。当 n(AA)∶ n(TPEG2400)= 4时水泥净浆流动度达到280 mm，1 h 后保持在270 mm。主要是由于减水剂吸附到水泥颗粒表面，TPEG 中的PEO 侧链在水泥颗粒间产生良好的空间阻碍作用，使水泥颗粒不能彼此靠近，有效阻碍水泥的絮凝，且-COOH 与 PEO 侧链的比例适当，主链上带电荷基团的静电斥力和侧链上的空间位阻效应的协同作用充分发挥，分子结构合理，各官能团协调作用，使减水剂的分散性及分散保持性最好。当 n(AA)∶ n(TPEG2400)﹥4 时水泥净浆流动度开始明显下降，可能是因为丙烯酸浓度增大，丙烯酸的自聚倾向增强，很容易形成均聚物，导致水泥的分散性能及分散保持性能下降。

3． 2 SAMS 用量对减水剂分散性能的影响

在 25 ℃条件下，固定 n(AA)∶ n(TPEG2400)为 4∶ 1，引发剂 E 用量为 0． 18%，保持其他操作条件的不变情况下，考查不同甲基丙烯磺酸钠对减水剂分散性和分散保持性能的影响，试验结果见图 2。

由图 2 可知，随着 SAMS 用量的增加，水泥的净浆流动度先增大后减小。当 SAMS 用量0． 3 mol 时，减水剂的初始净浆流动度达到 280 mm，1 h 后保持在 270 mm。这是因为 SAMS 具有亲水基团-SO 3 H，具有较好的减水性和缓凝效果，随着 SAMS 用量的增加，聚合产物的分散性显著提高，但其用量过大时，SAMS 具有一定的链转移作用，会影响减水剂相对分子质量的大小，易生成不易溶于水的聚合物。

3． 3 引发剂 E 对减水剂分散性能的影响

在 25 ℃条件下，固定 n(AA)∶ n(TPEG2400)为4∶ 1，SAMS 0． 3 mol，保持其他操作条件的不变情况下，考查不同引发剂 E 用量(相对于所有单体总摩尔量的百分比)对减水剂分散性和分散保持性能的影响，试验结果见图 3。

由图 3 可知，随着引发剂用量的增加，水泥的净浆流动度先增大后减小，当引发剂用量为 0． 18% 时，水泥净浆初始流动度达到 280 mm，1 h 后仍保持在 270 mm。当用量继续增加时，水泥的净浆流动度反而下降。

这是因为，在聚合反应中，引发剂不仅能起到引发聚合反应的作用，且具备一定的调节分子量作用。引发剂用量较少时，所得聚合物的主链聚合度相对较高，分子量较大，容易产生絮凝，当引发剂用量过高时，所得聚合物的主链聚合度过低，分子量较小，所带的负电基团较少，静电斥力小，减水剂的分散性能降低。1

3． 4 反应温度对减水剂分散性能的影响 固定 n(AA)∶ n(TPEG2400)为 4∶ 1，SAMS 的用量 0． 3 mol，引发剂 E 用量 0． 18%，在室温下，采用恒温水浴锅控制反应温度 10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃进行实验，考查不同反应温度对减水剂分散性和分散保持性能的影响，试验结果见图 4。

由图 4 可知，减水剂的分散性随着反应温度的升高呈现曲线变化。反应温度在 25 ℃时，所得减水剂性能最佳，可使水泥初始静净浆流动度达到 280 mm，1 h 后保持在 270 mm。当温度高于 25 ℃时，引发剂 E 分解速率较快，聚合速度太快，支链太多，残余单体数量较多，聚合反应不完全。当温度低于 20 ℃时，引发剂 E分解速率降低，聚合速度变慢，单体转化率降低。

3． 5 投料方式对减水剂分散性能的影响 根据自由基聚合原理，投料方式的不同会影响大单体和丙烯酸的共聚倾向及大单体的转化率。在25 ℃条件下，固定 n(AA)∶ n(TPEG2400)为4∶ 1，SAMS 的用量0． 3 mol，引发剂 E 用量0． 18%，反应时间2 h，此处主要考查了不同投料方式对减水剂分散性能的影响:(1)全混法:将 TPEG、SAMS、AA、引发剂 E 一次性投入三口烧瓶中，控制温度进行反应 2 h。(2)半混法:将一定配比的 TPEG、SAMS、AA 投入三口烧瓶中，引发剂 E 混合均匀后连续滴加 2 h 进行反应。(3)分别滴加法:将一定配比的 TPEG、SAMS 投入三口烧瓶中，AA 及引发剂 E 分别同时以滴加加入。试验结果见图 5。

由图 5 可知，相同条件下，采用分别滴加法所得减水剂流动度较大，初始净浆流动度达到 280 mm。主要原因是全混法和半混法反应体系中，活性较大的单体先行聚合，剩余活性较小的单体聚合速率较低，使得产品中有效成分较少，且分子量不均匀。而分别滴加法有效的控制了活性较高的单体的加入速率，所得产品结构合适、分子量均匀，其净浆的流动度及保留性比较理想。因此，试验中采用分别滴加法。

3． 6 反应时间对减水剂分散性能的影响

在 25 ℃条件下，固定 n(AA)∶ n(TPEG2400)为 4∶ 1，SAMS 的用量 0． 3 mol，引发剂 E 用量 0． 18%，保持其他操作条件的相同情况下，考查不同反应时间对减水剂分散性和分散保持性能的影响，试验结果见图 6。

在聚合反应中，自由基聚合反应，一般不存在中间产物，反应体系除了生成一定分子量的聚合物，就是未反应的单体。随着反应时间的增长，减水剂大分子链上接枝的不同官能团的数目随之增加，反应程度也随之增加，所得减水剂的流动度也随之增大。由图 6 可知，反应时间 2 h 时，所得减水剂性能最佳，可使净浆度达到 280 mm。当反应时间超过 2 h，净浆流动度基本保持不变，因此最佳反应时间为 2 h。

3． 7 采用最佳工艺制得的减水剂性能测定

在25 ℃条件下，n(SAMS)∶ n(AA)∶ n(TPEG2400)=0． 3∶ 4． 0∶ 1． 0，2 h 内匀速滴加引发剂 E 及共聚单体AA 于 SAMS、TPEG 混合溶液中，共聚单体 AA 溶液先于引发剂 E 溶液滴加完毕，再用 w(NaOH)=40% 的水溶液中和，制得聚羧酸系减水剂。对此减水剂进行了水泥净浆性能测试，在水灰比为 0． 29，掺量为 0． 18%条件下，水泥净浆初始流动度为 280 mm，1 h 经时流动度为 270 mm，减水率达到 29%。合成的聚羧酸减水剂在低掺量下表现出很好的分散性与分散保持性能，且减水效果较好。结论

(1)本文研究一种聚羧酸减水剂的低温生产工艺，通过单因素实验分析，得到最佳工艺条件:反应温度25 ℃，n(SAMS)∶ n(AA)∶ n(TPEG)=0． 3∶ 4． 0∶ 1． 0，引发剂 E 用量为 0． 18%，反应时间 2 h;(2)采用最佳工艺条件合成得到的减水剂，在水灰比为 0． 29，掺量为 0． 18% 条件下水泥净浆初始流动度为 280 mm，1 h 经时流动度为 270 mm，具有较好的分散性与分散保持性能;(3)在混凝土中掺加采用最佳工艺制得的聚羧类减水剂，其减水率可达 27%，且强度越发稳定。与国内目前广泛应用的聚羧酸类减水剂相比，该减水剂减水率高，保坍性好，合成工艺简单，且聚合反应过程在室温下即可完成，耗能更低，成本较低，具有良好的性价比和市场竞争力。

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