microRNA反转和定量引物设计(看完就会设计自己的引物)

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第一篇:microRNA反转和定量引物设计(看完就会设计自己的引物)

以hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU

一 设计引物反转录之后扩增所需引物设计

反向引物(反转之后跑PCR所需的引物):每个反向引物的都带有一段固定的序列,可以形成一个茎环,固定的序列为:5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3,在这个序列后加上八个碱基,这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列,就是GAAUCCCU的反向互补:AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列为

5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3,2定量引物设计

正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG

在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列,成熟体除掉后面六个碱基后序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGA,把U变成T即可,最后的序列为:

5,-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3,URP(unified reverse primer):统一反向引物,也是一段固定的序列,TGGTGTCGTGGAGTCG

U6引物

上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA

下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT

二 使用方法:

1反转录之后跑PCR的引物:所有要做的miRNA反向引物的混合,每个10微升RT-PCR的引物:50微升的体系,30微升的水,10微升的正向引物,10微升的URP(内参50微升的体系,30微升的水,10微升U6的正向引物,10微升U6的下游引物)

第二篇:引物设计-hyb总结

引 物 设 计

一.引物设计原则

首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

二.引物设计注意的要点

1.引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。

3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。

4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

三.引物设计的步骤

1.打开NCBI的主页,选择UniSTS,填写目的基因,选择符合要求的引物,导入blast和primer5检测是否符合要求,如果不符合要求再自己重新设计。

2.打开NCBI页面,选择Gene,填写需要查找的基因及源种(例如小鼠mus),找到mRNA的序列号,点击打开,找到相应的mRNA,把序列或者mRNA的accession序号导出到word里面,找出含有内含子的位置,做好标记(从进入Gene页面后,点击Genbank,可以了解这个基因的大小,以及内含子与外显子的大小)或者把mRNA的accession序号导入priemer Designing tool里面,扩增产物是200-250,TM 58-62,至少包含一个内含子,内含子长度可慢慢调试,最终要求Tm,GC%都比较接近,同时self3complementarity的值不能超过3,self complementarity不能超过6,这2个值越低越好。

3.根据引物设计原则,从mRNA序列中找相应的序列作为引物,上引物是5到3,下引物就是与mRNA序列反向互补的。

4.把设计的引物导入blast里检测下在所有基因中是否有非特异性扩增。

5.把全部mRNA序列导入primer5中,查看引物的Tm,GC%含量,是否有发夹结构与二聚体结构,以及错配率,得分,确定引物的可用性。

1.引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;

第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些,如何选择?

◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

◆ OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA(大于50mer)的纯化特别有效。

◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于

99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。

3.引物的OD数如何定量?

答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。4.需要什么级别的引物?

答:引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 < 45base OPC >45 base PAGE 诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE DNA测序 20base左右 OPC 亚克隆,点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE,HPLC 基因构建(全基因合成)根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC

5.最长可以合成多长的引物?

答:引物越长,出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品,全长(还不一定正确)引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多,最后的产量是很低。

6.需要合成多少OD数?

答:根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员,特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。

7.如何检测引物的纯度?

答:实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用EB 染色或银染方式染色。

8.如何计算引物的浓度?

答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致,请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul,加水的体积(微升)按下列方式计算:V(微升)= OD数*(乘)33 *(乘)*(乘)20000 /(除)引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。注意:1 OD260= 33 ug/ml.9.如何计算引物的Tm值?

答:引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度有关。长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41(%GC)– 600/size 公式中,Size = 引物长度。

Tm的定义:Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand.In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature.The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature.The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

答:非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW=(NA * WA)+(NC * WC)+(NG * WG)+(NT * WT)+(Nmod * Wmod)+(Nx * Wx)+(Ni* Wi)+16* Ns– 62.NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。常规碱基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17

常规修饰基团分子量

5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM)537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM)569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12

11.如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。

12.如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前,室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

13.合成的引物5’端是否有磷酸化

答:合成的引物5’为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化,或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化,需要另外收费。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

15.测序发现引物有突变是怎么回事?

答:测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的,碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是99%,副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体(脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。

引物合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在,有不少降低发生的频率建议和措施,但是这些措施还停留在实验室阶段,还没有能够应用到规模化生产中。

16.长链引物为什么出错的几率非常高?

答:引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入,缺失,置换突变的因素客观

条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

17.如果测序发现突变,该如何处理?

答:对您遇到的困惑,我们表示同情。遇到这种情况,首先和我们取得联系,我们的生产人员会检查生产的原始记录,主要是核对合成序列是否和定单一致,我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错,我们建议重新挑取克隆测序,您可能会找到正确克隆的。根据我们经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。

18.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

答:理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象,PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,导致割的条带有时可能比较宽。建议:您如果减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。

19.TaqMan 探针设计的基本原则是什么? 答:下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物(扩增产物50-150bp),但不能与引物重叠。◆长度一般为18-40mer。◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。◆在引物的5’端避免使用G。◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C左右。

有用的荧光染料参数

Name Name 吸收波长 发射波长 colors 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green TET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm Orange HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet

20.Primer设计的基本原则是什么?

答:引物设计的下列原则供您参考。◆引物长度一般在18-35mer。◆G-C含量控制在40-60%左右。◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现,特别是要避免GGGG或更多G出现。◆退火温度Tm控制在 58-60C左右。

◆如果是设计点突变引物,突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?

答:我们多次接到类似的投诉:引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低,怎么会有蛋白质污染?遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好,还不听解释。撇开其他不谈,引物化学合成,哪里有机会污染到蛋白质?

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions Base Composition A260/280 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66

22.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?

答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。

23.引物不纯会有什么后果?

答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3)用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

24.为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来?

答:有些PCR扩增没有成功,怀疑是引物不好。PCR扩增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,最好在实验时设置对照来判定原因。

如果您怀疑引物的问题,请您首先测定您溶解的引物的OD值,看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的,请您告诉我司您的引物编号,我们会复查留存样品。如不明原因,我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增,请您查找其它原因。

25.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

答:如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

26.引物质量好坏的判断标准是什么?

答:合成的引物和您的定单序列一致,而不是能否扩增出您所需要的产物。

27.PCR扩增不出就引物有问题吗?

答:基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段的扩增, GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见(1)RT-PCR。请注意,很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。RT-PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。(2)从基因组中扩增。一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH。

28.PCR扩增有很强的非特异条带,说明引物有污染吗?

答:不能。瞧,扩增目标很弱或没有,道是非特异性条带很亮,说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带,测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染(如RNA中污染基因组)或扩增条件不合适所致。

第三篇:PCR 引物设计的原则和要点

PCR 引物设计的原则和要点

BIOX.CN2005-5-13 9:13:57 来源:生物中国人

引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点:引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加[2]。引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。

6∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的∆G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。

第四篇:测序引物设计指引PCR引物设计方法1引物最好在cDNA的保守

测序引物设计指南

♦PCR引物设计方法:

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。

GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A,最好选择T。

引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G和C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.引物5′ 端和中间△G值应该相对较高,而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)

9.引物的5′ 端可以修饰,而3′ 端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。

引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。

做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

♦总结:

1)避免重复碱基,尤其是G.2)Tm=58-60度。

3)GC=30-80%.4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。

6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80~150bp最为合适(可以延长至300bp)。

7)引物的退火温度要高,一般要在60度以上;

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件,PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物,你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对,发现你所设计的这个引物,在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列,则可能扩出其他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差,从而不能用。

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