环境水体中肠的道感染菌群与几种典型致病菌的QPCR检测及相关性分析

第一篇：环境水体中肠的道感染菌群与几种典型致病菌的QPCR检测及相关性分析

环境水体中肠道感染菌群与几种典型致病菌的QPCR检

测及相关性分析

第 卷 第 期 生 态 科 学 :.年 月

张爱宁,刘丽,史艳丹,刘永军.环境水体中肠道感染菌群与几种典型致病菌的 检测及相关性分析.生态科学，:.?， ,.., , :.环境水体中肠道感染菌群与几种典型致病菌的 检测及相关 性分析

张爱宁,刘 丽,史艳丹,刘永军

西安建筑科技大学环境与市政工程学院,教育部西北水资源生态与环境重点实验室,西安

【摘要】利用定量 方法,对环境水体中的肠道感染菌群及几种致病菌进行 个月的连续检测。结果表明:在污染

严重的水体中,埃希氏大肠菌 是水中肠道感染菌群的主体,其强度接近于用通用引物检测出的肠道感染菌群强度。

当肠道感染菌群拷贝数超过 时,沙门氏菌 和志贺氏痢疾杆菌 也持续被 检出,可以认为是水体病原污染的标志之一:在轻度污染和清洁水体中,当肠道感染菌群拷贝数低于时,通

过通用引物检测到的肠道感染菌群主要是上述 种病原细菌以外的细菌,且 种病原细菌的出现频度和强度与肠道感染菌群之 间没有明显的相关性。

关键词:地表水;肠道感染菌群;病原细菌;定量;相关性:./......中图分类号:.文献标识码: 文章编号: ?.?.，.,‘ :.,.,..。~..,‘ 一,..: ，,收稿日期:?.收稿, ? 接受

基金项目:国家自然科学基金项目 ,陕西省教育厅项目 ,陕西省重点实验室项目作者简介:张爱宁 ?,女,学士,工程师,研究方向为污染环境的分析与评价.?通讯作者,刘永军 一 ,博士,教授,研究方向:环境生物技术与应用.: 期 张爱宁,等:环境水体中肠道感染菌群与几种典型致病菌的 检测及相关性分析引言 下游: ’..’;痢疾杆菌

上游: 由于水环境污染而引起的病原体感染仍是当今 一

世界上危害范围最广的环境问题,全世界每年由于肠 ’,下游: ’..’;道感染引起痢疾的病例多达 亿人次,死亡人数多 伤寒沙门氏菌【’上游: ’.达万人,成为全球疾病之首【。由此,水域性病.’,下游: ’..’:大肠杆菌 ,上游: 原菌的常规监测,对于公共健康来说是非常重要的。

据统计,在中国发生的肠道传染病主要有 种, ’..’,下游: ’..’。包括甲类传染病中的霍乱,乙类传染病中的伤寒、细 菌性痢疾、阿米巴痢疾和甲、戊型病毒性肝炎,丙类

传染病中的除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染.品处理 性腹泻病,年平均发病率为每 万人有.例, % 标准菌株:本研究所用的沙门氏菌

以上的肠道传染病是细菌性痢疾。其次是甲肝和伤寒,标准菌株购自美国菌种保藏中心,痢疾

霍乱一直处于散发流行状态。近年来,其它感染性腹 杆菌 和大肠杆菌 购白 泻病发病率有上升趋势【】。然而这些病原细菌潜在的 陕西省微生物研究所,细菌培养用 肉汤培养基致病风险,没有列入常规水质评价指标之内。水中 蛋白胨, , 酵母膏 在。下

对于水体中病原菌的检测主要基于选择性培养 培养后,离心.收集菌体。和标准的生物化学方法,但这些方法存在一系列的缺 细菌的提取:菌株培养液.或

陷【。人们开始研究分子生物学方法的可行性,以求 地表水样用灭菌离心管离心., 缩短检测和报告时间【。其中之一就是定量聚合酶链 后,弃去上清液:沉淀物加入 的裂解缓冲液

式反应 方法研究【,用这一方法可使从测样.~ ,.,.乙酸钠, 到出结果的时间缩短到几个小时圳。本研究利用包括., ,反复吹打使之重悬,加入

痢疾杆菌,沙门氏菌 ?.混匀,.离心后

将上清转入一只新管中,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇 和大肠杆菌 类肠道病原细菌在

内的肠道感染细菌通用引物【 同时利用上述几种病: : 体积比 ,混匀,离心., 原细菌的特异性引物,通过定量方法检测西安市;取上清后,加入.倍体积的异丙醇后离心;不同地表水体中多种病原菌的分布情况,为进一步对 沉淀用 的%乙醇洗涤,离心弃乙醇。

水体进行全面的病原性污染风险评价奠定基础。标准曲线:用 固体培养基经平板计数, 测得培养液中细菌的浓度。用上述苯酚.氯仿法提取 材料和方法细菌总,将总 倍梯度稀释,以此为 标准曲线制作的摸板,每个稀释梯度平行 组,.取样地点 利用梯度稀释的细菌提取物 检测的 值

选取西安市区洁净水体 水源水、轻度污染水 与相应的细菌细胞密度对数值的离散与回归分析绘

制标准曲线。肠道感染菌群 检测的标准曲线 体 景观水 和严重污染水体 纳污水体和污水处理

厂出水 为研究对象。从 年 月~ 年 月,每 以大肠杆菌检测的标准曲线代替。

个月的、、日分别从黑河、北湖、兴庆湖、’产 河和北石桥污水处理厂采集水样。采样位点为水深.分析

/ 处。同时记录每个被调查水样的其它辅助资料, 在 体系中加入荧光试剂 ,利

包括、温度、浊度、游人密度以及船只等。用荧光信号实时检 进程。荧光试剂盒购于天根

生化科技公司北京。反应体系总体积,.引物合成

内含× / ,上下游引物 肠道感染菌群通用引物】,上游: 分别为.? ~,模板。将反应管放入定 / 一 ’, 量仪 美国.。扩增条件:生 态 科 学 卷

表 地表水体中肠道感染细菌群与几种病原细菌的检出强度 ℃预变性, ℃, ℃, ℃ , 感染菌群的强度,平均检出值为 ~.℃,共 个循环。每隔.读数一次,阈值设 ~;痢疾杆菌和沙门氏菌的平均检出值

分 别 为和~ 定为最初的 ~ 个循环荧光值标准偏差的 倍。

用于水体病原细菌检测的样品平行 组,环境水一。种致病菌的总强度接近于肠道感染

样中目标细菌强度的确定是通过已知细胞模板拷贝 菌群强度。说明污染严重的水体中,病原细菌主要为

数 的病原细菌 标准曲线推断出的相 上述 种病原细菌。对数量。检出频率以阳性率来表示,是阳性样本数与

总样本数的比值。.地表水体中不同病原细菌检出强度分布

图 所示为不同地表水体中肠道感染菌群与结果与讨论种病原细菌检出强度的分布情况。在污染严重的水体 中 图 , ,肠道感染菌群的检出强度在

.地表水体中肠道感染菌群及病原细菌强度检测 之间,大肠杆菌从各种水体检出的强

度最高,分布在之间,沙门

对西安市洁净水体、轻度污染水体和严重污染水

体共 个地表水体中肠道感染菌群和 种病原细菌利 氏菌和痢疾杆菌也持续被检出,检出强度分布在

用 法进行连续 个月的检测,检测结果如表 之间, 种病原菌的总强度接 所示,每个水体的检测样本数分别为。近于用通用引物检测出的肠道感染菌群强度。所以, 在洁净水体中 黑河,肠道感染菌群的平均检 对于污染严重的水体,大肠菌是水中肠道感染菌群的

测值为 ~,大肠杆菌,痢疾杆菌和 主体,沙门氏菌和痢疾杆菌强度尽管远低于大肠菌。

沙门氏菌的平均检测值分别为.、在轻度污染水体 图 ,和清洁水体中 图

。和.~。该水体为西,肠道感染菌群的检出强度在 ~ 安市饮用水源水,受到良好的保护,水体没有受到病 之间, 种病原细菌的强度都分布在

原体污染。左右,且不能连续检出, 种病原

在轻度污染水体中 北湖、兴庆湖 ,肠道感染 菌的总强度远低于用通用引物检测出的肠道感染菌 菌群的平均检出值为.~.× ~, 群强度。说明在轻度污染水体和清洁水体中,当总的

大肠杆菌、痢疾杆菌和沙门氏菌的平均检出值分别为 肠道感染菌群浓度低于 时,通过

.~ ~、.~ 和 ~ 通用引物检测到的肠道感染菌群主要是大肠杆菌、沙 门氏菌、痢疾杆菌以外的细菌。~。种致病菌的总和远远低于肠道感染 菌群,说明在洁净水体和轻度污染水体中,通过通用.肠道感染茵群与不同病原细菌检测结果的离散 引物检出的细菌绝大多数为 种致病菌以外的细菌。在严重污染水体中 污水厂出水、、产河 ,肠道 与回归分析 图 表示所有地表水样申用 方法所测得 感 染 菌 群 的平均 检 出值 为..×’ 的肠道感染菌群强度与不同病原细菌强度离散图形.~,埃希氏大肠菌浓度很高,接近于肠道辟掣区

期 张爱宁,等:环境水体中肠道感染菌群与几种典型致病菌的 检测及相关性分析

一 ∞

∞ 鲫 ∞ 舯 ∞ 一邑 崔 崔 ‘罚 ’吾 昌..●

拷贝数对数值 拷贝数对数值 董 邑 皇荟 蛊 毫

●大肠杆菌.●沙门氏菌

●志贺氏菌注:.污水厂出水,.产河, 北湖,.兴庆湖, 一黑河.:●病原菌群 ,? ， ?..拷贝数对数值不同地表水体中病原微生物检出浓度分.能完全一一对应七,目前还不能达到代替传统病原 及回归分析结果。

污染指标的地步,如果要用 方法对地表水体 在对 个地表水体监测的 周内,肠道感染菌

群与大肠杆菌检测值的秩相关系数为.,与 进行健康风险评价,还需要进一步收集 检测

沙门氏菌的秩相关系数为.,与痢疾杆菌的秩 结果以及相关的卫生学数据。

相关系数为.。肠道感染菌群与大肠杆菌之间

有较强的相关性,说明西安市地表水体中的肠道感染 结论 细菌主要是大肠菌群。这与传统方法用大肠菌群来指

示水体病原菌污染状况相一致。但是由于所建立的肠 大肠杆菌从各种水体检出的频度最高,在

道感染菌群通用引物 方法除了能检测水体中 水体受到一定污染后即持续检出。污染严重的水体, 存在的大肠菌群以外,还可以同时检测到水体中痢疾 大肠杆菌是肠道感染菌群的主体,其强度接近于肠道

杆菌和沙门氏菌,和传统方法相比,更能反映水体的 感染菌群检出强度,二者的秩相关系数为.;真实污染状况。加之 方法具有高敏感性以及在地表水体中,当肠道感染菌群 检

检测时间短 在 之内能够完成检测 等优势, 出值超过 时,沙门氏菌和痢疾杆

所以在地表水体病原体污染监测中, 方法检测 菌也持续被检出,虽然其强度远低于大肠杆菌,但这 结果极有可能与传统的大肠菌群检测结果一道,成为 些病原菌存在的可能性变得非常高,可以认为是水体 水体病原污染风险评价的指标。但由于两种方法并不 病原污染的标志之一: