第一篇：C46500黄铜抗脱锌生产
C46500黄铜抗脱锌生产
黄铜在我国的历史已经非常悠久，随着现在新材料的广泛兴起，对于黄铜的抗脱锌等性能的要求也越来越高，各个企业也在加速对黄铜新型合金材料-C46500的研发，目前由于工艺的不稳定，很多厂家还存在一些技术工艺上的细节把控不足，导致生产不稳定，成本浪费严重。以下的几点是我个人在生产和前期开发的一些经验，希望可以对广大铜加工企业有所帮助！
1、黄铜脱锌腐蚀的特征
黄铜脱锌是选择性腐蚀,即合金中活性较强组元的选择性溶解,组元可以是单相固溶体合金中的一种元素,也可以是多相合金中的某一相。选择性腐蚀发生在二元或多元合金中,其中电极电位较负的组元或相优先溶解,如黄铜脱锌。黄铜脱锌腐蚀的发生与Cu-Zn合金中的锌含量有关,当锌含量低于15%时,一般不产生脱锌腐蚀,但合金的抗冲蚀性能差,增加锌含量有利于提高合金的强度和抗冲蚀性能,但发生脱锌腐蚀的倾向增加。当黄铜的含锌量大于20%时,在水溶液中锌元素易优先溶解,而留下多孔的铜,这种腐蚀是黄铜冷凝管主要的破坏形式,其结果使黄铜的强度降低,大大缩短冷凝管的使用寿命。黄铜脱锌腐蚀主要呈现两种形态:一种是均匀的层状脱锌,多发生于含锌量较高的黄铜,且总在酸性介质中;另一种是塞状脱锌,多发生于含锌量较低的黄铜,且在一些微酸性、中性或碱性介质中用作海水热交换器的黄铜经常出现这类脱锌。影响黄铜脱锌腐蚀的因素主要有合金组织结构和外部环境。从相组成看,含锌量大于20%的单相A黄铜,脱锌后留下多孔的铜;而A+B双相黄铜的脱锌,首先是从B相开始的,B相完全转变为疏松的铜后,再扩展到A相;含锌量更高的E相或C相黄铜,由于脱锌会发生EvCvBvA相转变,转变的程度依据脱锌时间、介质和外加电位等外部条件的变化而改变;同时也发现黄铜中含锌量越高,越容易产生脱锌的现象。黄铜的脱锌不仅能在中性的海水、河水、工业水中发生,也能在酸性较强的介质及碱性介质中发生,溶液的pH值对黄铜的脱锌影响不大。黄铜在各种盐类如CuC12,CuSO4,(NH4)2SO4,NaC1的溶液中也能发生脱锌,就形貌特征看,含锌量较高的黄铜在酸性介质中易产生层状脱锌;含锌量较低的黄在中性、碱性介质中易发生塞状脱锌,随介质温度的升高,黄铜的脱锌速度加快。过电位也影响黄铜的脱锌过程和脱锌产物,如E相黄铜在低电位下,由于脱锌会发生EvC相转变,而在高电位下,E相黄铜会直接变成疏松的铜或富铜的A相。此外,脱锌速率也会受到冷加工变形的影响,不同种类的黄铜,其脱锌速率受冷加工变形影响的程度有所不同。
2、防止黄铜脱锌腐蚀的措施
防止黄铜脱锌腐蚀主要是从冶金方面入手,其次也可从改善环境方面考虑。改善腐蚀环境如采用阴极保护、降低介质浸蚀性、添加缓蚀剂等,虽然是防止黄铜脱锌较好的措施,但由于受工况条件的限制,并不能完全抑制黄铜的脱锌。只有通过冶金化方法提高黄铜自身的抗脱锌能力,才能从根本上杜绝黄铜脱锌腐蚀的发生。如采用锌含量较低的红黄铜(Zn质量分数15%),这类合金几乎不产生脱锌,但却不耐冲蚀;或在黄铜中加入砷、硼、锑、磷、锡、铝、稀土等合金元素,这些元素都能在不同程度上防止A黄铜的脱锌,但对A+B双相黄铜的抑制效果不大,在这些元素中尤以加As,B的效果最佳,稀土元素也有较好地抑制脱锌腐蚀的效果，（详细生产指导QQ859284413），对于生产中如何加入，加入量；加入时间等等方面都需要给予明确。
3、黄铜脱锌腐蚀的机理
对黄铜脱锌腐蚀的机理,国内外都做了一些研究,提出了各种研究结论,但目前还不十分完善,主要理论有优先溶解和溶解-再沉积机制、双空位机制和渗流机制 [1-2]。2.1 优先溶解和溶解一再沉积机制 优先溶解机制认为,黄铜腐蚀过程中,合金表面的锌从黄铜中优先溶解,然后合金内部的锌通过空位扩散继续溶解,电位较正的铜被遗留下来,呈疏松状的铜层。但这种理论难以说明脱锌造成的脆性开裂深度与锌在室温下扩散系数太低之间的矛盾。LANGENEGGER认为[2] 在黄铜表面与溶液接触处发生了锌选择性溶解,被腐蚀的锌由合金晶格上锌原子的扩散所补偿,锌在活性脱锌前沿被选择性侵蚀,这个前沿不断地向内部移动。按照作者的观点,脱锌相只是在初始黄铜母体的骨架结构中出现,它容许锌离子自由向外扩散,黄铜的脱锌阻力依赖于锌外层电子离开锌原子的难易程度。溶解-再沉积机制认为,黄铜表面上的锌和铜一起溶解,锌留在溶液中而铜在靠近溶解处的表面上迅速析出从而重新沉积在基体上,但这种机制无法圆满地解释铜不可能溶解时的脱锌现象。因为锌溶解的电位远低于铜的阳极溶解电位,铜和锌的同时溶解不可能在任何情况下都能发生。PURSHPA在硫酸中进行了研究,认为最初阶段由于建立了(Cu-Zn)原电池,锌在溶液中优先溶解,但当多孔的铜-氧化铜膜在电极表面形成时,脱锌速度下降,铜、锌同时溶解。这时锌的溶解速度受锌从样品内部通过晶格空位的扩散速度所控制,在这个阶段铜的溶解速度也由于CuO膜的形成而减少,这是因为CuO膜提供了暂时的、不连续的表面保护在腐蚀过程中,以上两种脱锌机理哪一个处于决定性地位取决于腐蚀条件,比如在稀盐酸中会发生锌的选择性溶解,而在浓度较高的盐酸或海水中则发生铜重新析出的脱锌腐蚀,另外,脱锌机制还受到溶解温度、浸泡周期长短的影响。铜和锌是否同时溶解,可以将它们的电位-pH图重叠后预测
4、成分: C46500加锡抗脱锌黄铜
标准：ASTM B432-1991(1992、1993年版)●化学成分： 铜 Cu：59.0~62.0 铅 Pb：≤0.20 铁 Fe：≤0.10 锡 Sn：0.50~1.0 锌 Zn：余量 砷 As：0.02~0.10
中间还需要加入多种小金属、温度控制和辅助材料生产！
第二篇：出口危险货物生产企业声明磷化锌
出口危险货物生产企业声明
本企业出口的化工产品磷化锌共400件，经海运出口至缅甸金额为：USD41000.00该批危险货物已严格按《国际海运危险货物规则》、SN /T 0370.3《出口危险货物包装检验规程第进行包装,经自我鉴定合格，完全符合运危险货物规则》、SN /T 0370.3《出口危险货物包装检验规程第上述内容真实无误，如有虚假，愿承担全部责任。
特此声明。
法定代表人（签字）
出口企业（盖章）
2013-2-17
第三篇：出口脱水果蔬生产企业注册卫生规范
出口脱水果蔬生产企业注册卫生规范
（2003年9月10日由国家认监委国认注［2003］51号文件公布）
1制定依据
本规范根据《出口食品生产企业卫生要求》制定。
2适用范围
2.1 本规范适用于出口脱水蔬菜、脱水果蔬、脱水汤料、脱水调味料（不包括晾晒品）等食品生产企业的卫生注册。
2.2 脱水果蔬是指用各类新鲜蔬菜、新鲜水果为主要原料、配以辅料或其他农产品等原料经热风干燥、低温真空冷冻干燥或其它干燥方式加工而成的食品。
3卫生质量管理体系
3.1 出口脱水果蔬生产企业应当建立保证出口食品卫生的质量体系，并制定体现和指导质量体系运转的质量体系文件。
3.2 出口脱水果蔬生产企业的卫生质量体系应当包括下列基本内容：
3.2.1 卫生质量方针和目标；
3.2.2 组织机构及其职责；
3.2.3 生产、质量管理人员的要求；
3.2.4 环境卫生的要求；
3.2.5 车间及设施卫生的要求；
3.2.6 原料、辅料卫生的要求；
3.2.7 生产、加工卫生的要求；
3.2.8 包装、储存、运输卫生的要求；
3.2.9 有毒有害物品的控制；
3.2.10 检验的要求；
3.2.11 保证卫生质量体系有效运行的要求。
3.3 低温真空冷冻干燥产品加工企业必须按照《国际食品法典委员会危害分析和关键控制点（HACCP）体系及其应用准则》的要求建立和实施HACCP体系。
4卫生质量方针和目标
4.1 出口脱水果蔬生产企业应制定本企业的卫生质量方针、目标和责任制度，并贯彻执行。
4.2 企业最高管理者应确保卫生质量方针、目标和责任制度的有效实施。
4.3 生产企业应建立保持文件化的质量体系，确保出口脱水食品的生产符合本规范的要求。5组织机构及其职责
5.1 出口脱水果蔬生产企业应当建立与生产相适应的、能够保证其产品卫生质量的组织机构，并规定其职责和权限。
5.2 出口脱水果蔬生产企业应建立一级（直属工厂最高领导）品管机构，对工厂监管负全面管理职责。
5.3 品管部门有充分权限以执行品质管理任务，其负责人有停止生产或出货的权力。
5.4 品质管理部门应有食品检验机构，卫生管理机构，作业现场品质人员配置。
5.5 生产负责人与品质管理负责人不得兼任。
5.6 低温真空冷冻干燥企业品质管理部门应设立HACCP领导小组。，6生产、质量管理人员卫生的要求
6.1 与食品生产有接触的人员必须经体检合格后方可上岗。
6.2 生产、质量管理人员每年进行一次健康检查，必要时做临时健康检查；凡患有影响食品卫生的疾病者，必须调离食品生产岗位。
6.3 生产、质量管理人员保持个人清洁，不得将与生产无关的物品带入车间；工作时不得戴首饰、手表，不得化妆；进入车间时洗手、消毒并穿着工作服、帽、鞋，离开车间时换下工作服、帽、鞋。
6.4 清洁区、非清洁区加工人员及检验人员工作服、帽应用不同颜色加以区分，集中管理，统一清洗、消毒、发放。
6.5 清洁区加工人员还应戴口罩和发罩。
6.6 生产、质量管理人员应当定期接受加工卫生、卫生质量体系等内容的培训，并经过考核合格后上岗。
6.7 配备足够数量的、具备相应资格的专业人员从事卫生质量管理工作和实验室技术检测工作。7环境卫生的要求
7.1 出口脱水果蔬生产企业不得建在有碍食品卫生的区域，厂区外周围环境应清洁卫生，无物理、化学、生物等污染源，空气、地表和地下水洁净无污染。
7.2 厂区内不得兼营、生产、存放有碍食品卫生的其他产品。
7.3 厂区路面平整、无积水，厂区无易起灰尘的地面。主要通道硬化，非通道地面适当绿化。
7.4 厂区卫生间有冲水、洗手、防蝇、防虫、防鼠设施，墙裙以浅色、平滑、不透水、无毒、耐腐蚀的材料修建，并保持清洁。
7.5 生产中产生的废水、废料的排放或者处理符合国家有关规定。
7.6 厂区建有与生产能力相适应的符合卫生要求的原料、辅料、化学物品、包装物料储存等辅助设施和废物、垃圾暂存设施。
7.7 根据工艺要求需设立原料前处理场所的，不得对厂区环境造成污染。
7.8 生产区与生活区隔离。锅炉房应设在下风向位置。
8车间及设施卫生的要求
8.1 车间面积与生产能力相适应，布局合理，排水畅通，通风良好。
8.2 车间地面用防滑、坚固、不透水、耐腐蚀的无毒材料修建，平坦、无积水并保持清洁；车间出口及与外界相连的排水、通风处安装防鼠、防蝇、防虫等设施。
8.3 车间内墙壁、屋顶或者天花板使用无毒、浅色、防水、防霉、不脱落、易于清洗的材料修建，墙角、地角、顶角具有弧度。
8.4 车间窗户有内窗台的，内窗台下斜约45°；车间门窗用浅色、平滑、易清洗、不透水、耐腐蚀的坚固材料制作，结构严密。
8.5 按照加工流程，根据不同的清洁程度，分设与加工间相连的更衣室，更衣室内配备有更衣镜及与加工人员数目相适应的便鞋架、水鞋架及挂衣帽架等更衣设施，要避免个人衣物与工作服形成交叉污染；更衣室设有更衣柜的，应采用不发霉、不生锈、易清洁的材料制作，并保持干燥；更衣室应有消毒措施，清洁卫生，通风良好，有适当照明。
8.6 视需要设立与更衣室相连接的卫生间。卫生间有冲水装置、洗手消毒设施及换气装置，备有洗涤用品和不致交叉污染的干手用品，水龙头为非手动开关，门窗不直接开向车间，室内应保持清洁，通风良好。卫生间外备有拖鞋架和专用拖鞋。
8.7 加工间入口处设有靴鞋消毒设施。加工间入口处和加工间内适当的位置设足够数量的洗手消毒设施，备有洗涤用品及消毒液，水龙头为非手动开关。
8.8 加工间内工序布局合理，清洁加工区、非清洁加工区之间应严格分开，不形成交叉污染。
8.9 加工间内操作台、工器具、传送带（车）、摆料盘用无毒、不生锈、易清洗消毒、坚固耐用的材料制作。烘干机、冻干机内不得有生锈、油漆、网带脱落破损等有可能污染产品的部件，干燥室内壁光滑，不易脱落。
8.10 蒸煮、油炸、烟熏、烘烤加工设施的上方，应设与之相适应的排油烟和通风装置，加工车间天花板不得存有凝结水。
8.11 易产生粉尘的加工工序应相对隔离，并配备相应的除尘设施。
8.12 挑选包装间温度符合产品要求，一般不高于零上20摄氏度；空气干湿度要符合产品要求；挑选包装间应有良好的空气杀菌设施和充足照明设施。挑选包装工人必须戴口罩，穿白色软底鞋；包装物料进口和产品出口等通道设置必要的防护设施，防止仓库操作工人及其他非清洁区人员出入包装间。
8.13 包装间光线充足。车间内位于工作区域照明设施的照度不低于220 Lux，包装间、检验台上方的照度不低于540Lux。车间照明设施应装有防护罩。
8.14 烘干机、冻干机及有温度要求的成品库应安装温度显示和自动记录装置；各部位温度必须控制在加工工艺要求的范围之内。
8.15 加热和制冷设备的温度计、显示装置、压力表须符合要求，并经定期校准。
8.16 在加工间内适当位置设工、器具清洗消毒处或消毒间，供有82℃的热水或消毒剂，使用消毒剂的必须配备相应的充足清洁水容器以冲净工器具上的消毒剂。
8.17 加工过程中相关工序应设立除磁性金属物设施。
9原料、辅料卫生的要求
9.1 原料应来自经检验检疫机构备案的种植基地、或者具备农药检测合格证明、或者具备产地环境无污染证明。
9.2 企业应建立完善的农残监控体系，确保原料农残符合进口国有关要求。
9.3 蔬菜、水果、其他植物产品原料必须采用新鲜或冷藏的。成熟适度，风味正常，无病虫害，无腐烂。半成品原料必须来自出口食品卫生注册、登记企业。
9.4 辅料应当符合国家有关卫生规定，有生产厂检验合格证；严禁使用进口国不允许使用的辅料。原料、辅料进厂后应专库存放，经过进厂验收合格后方准使用；超过保质期的原料、辅料不得用于食品生产。
9.5 加工用水（冰）符合国家《生活饮用水卫生标准》或者其他必要的标准，每年对水质的公共卫生防疫卫生检测不少于两次，每周一次微生物检测，每天一次余氯检测。自备水源应当具备有效的卫生保障设施。
10生产、加工卫生的要求
10.1 生产设备布局合理，并保持清洁和完好。
10.2 应确定加工过程的关键工序，制定操作规程并得到连续有效的监控，对监控失效期间的产品应及时隔离处理，并采取有效的纠偏措施。
10.3 对加工过程的食品接触表面如切菜机、冻干机、烘干传送网带、前加工流水线、操作台、工具、容器手推车辆和工人的手、工作服等应定时清洗、冲霜、消毒，并定期做微生物检测。
10.4 不便于直接清洗的加热蒸发排管、成品冷藏间地面应定期维护和消毒。
10.5 班前班后进行卫生清洁工作，专人负责检查，并作检查记录。
10.6 对加工过程中产生的不合格品、跌落地面的产品和废弃物，在固定地点用有明显标志的专用容器分别收集盛装，并在检验人员监督下及时处理，其容器和运输工具及时消毒。
10.7 应当对不合格品产生的原因应当进行分析，并及时采取纠正措施。
10.8 加工间原料入口、废料出口应有防蚊蝇设施；废料出口尽可能远离原料进口，废料应及时、妥当地通过合理渠道处理到厂外；废料运输车辆不得污染厂区。
10.9 成品应经金属探测器检验合格。金属探测器应定时进行校准。
10.10 挑选包装间应采取适宜的消毒措施。
11包装、储存、运输卫生的要求
11.1 用于包装食品的物料符合卫生标准并且保持清洁卫生，不得含有有毒有害物质，不易褪色。11.2 包装物料间干燥通风，内、外包装物料分别存放，不得有污染。
11.3 运输车辆定期消毒，保持干燥、卫生、无污染及异味；制冷、保温车状态良好。
11.4 成品专库储存，未经包装的产品不得进入成品库。
11.5 原料库、烘干机、冻干机、冷冻间、成品库的温度符合工艺要求，库内保持清洁，定期消毒，有防霉、防鼠、防虫设施。
11.6 库内成品与墙壁距离至少30厘米，与地面距离至少15厘米，与顶棚距离至少60厘米。垛位之间至少能使工人通过，垛位有管理卡。库内不得存放有碍卫生的物品；同一库内不得存放可能造成相互污染或者串味的食品。
12有毒有害物品的控制
12.1脱水食品生产企业要建立有毒有害物品的专用储存库，标识清楚，专人管理。
12.2杀虫剂及其他化学药品的使用必须经过批准，未经批准不得使用。
12.3 严格执行有毒有害物品的储存和使用管理规定，确保厂区、车间和化验室使用的洗涤剂、消毒剂、杀虫剂、燃油、润滑油和化学试剂等有毒有害物品得到有效控制，避免对产品、产品接触表面和包装物料造成污染。
12.4脱水食品生产企业应列出有毒有害物品清单，建立使用记录。
13检验的要求
13.1 企业有与生产能力相适应的内设检验机构和具备相应资格的检验人员。检验机构应直接由厂长领导，对产品质量有否决权。
13.2 企业内设检验机构具备相适应的微生物、农残、二氧化硫等检验工作所需要的标准资料、检验设施和仪器设备，检验仪器按规定进行计量检定，检验要有检测记录。
13.3 企业内设检验机构必须对原料、辅料、半成品按标准取样检验，并出具检验报告。
13.4 对检验不合格的原料、半成品、成品应及时出具报告并隔离不合格品，督促指导相应管理者在加工过程中及时采取纠偏措施。
13.5 成品出厂前必须按生产批次进行检验，出具检验报告；检验报告应按规定程序签发及保存。13.6 使用社会实验室承担企业卫生质量检验工作的，应当签有合同，并且该实验室应当具有相应的资格。
14保证卫生质量体系有效运行的要求
14.1 制定原料、辅料、半成品、成品及生产过程卫生控制程序，并有效执行，做好记录。
14.2 建立并执行卫生标准操作程序并做好记录，确保加工用水（冰）、食品接触表面、有毒有害物质、虫害防治等处于受控状态。
14.3 对影响食品卫生的关键工序，要制订明确的操作规程并得到连续的监控，对关键工序的监控必须有记录。
14.4 制定和执行对不合格品的控制制度，制度包括不合格品的标识、记录、评价、隔离处置和可追溯性等内容。
14.5 制定产品标识、质量追踪和产品召回制度，以保证出厂产品在出现安全卫生质量问题时能够及时召回。
14.6 制定和执行加工设备、设施的维护程序，保证加工设备、设施满足生产加工的需要。14.7 制定和实施职工培训计划并做好培训记录，保证不同岗位的人员熟练完成本职工作。14.8 建立内部审核制度，每半年进行一次内部审核，一年进行一次管理评审，并做好记录。
14.9 对反映产品卫生质量情况的有关记录，制定标记、收集、编目、归档、存储、保管和处理的程序，并贯彻执行；所有质量记录必须真实、准确、规范并具有卫生质量的可追溯性，保存期不少于2年。
第四篇：迎“疫”而上奋力夺取抗疫生产“双胜利”
油田局（分公司）迎“疫”而上
奋力夺取抗疫生产“双胜利”
2020年新春伊始，油田局(分公司)在市局（公司）坚强领导下，在疫情防控和企业复工复产“双线战役”中，统一思想、坚定信心，明确任务、落实责任，咬定目标任务不放松，奋力夺取疫情防控和生产经营“双胜利”。现汇报如下：
一、工作开展情况
（一）疫情防疫战一线
共产党员冲向前。面对突如其来的新型冠状肺炎疫情,1月26日晚,接到官庄工区党工委命令后,局（分公司）主要负责同志第一时间到岗，立即向党支部20名党员,下达紧急召集令；1月27日八点，支部20名党员全部返岗，投入到疫情防控的主战场。20名党员兵分两路，分包恒山小区和运输南苑两个近5000人的居民区值守点，实行领导带班，党员轮流值班，做好车辆人员出入登记、测量体温等工作，成立党员突击队，先后发放宣传材料4000余份,制作标语10余幅，劝返1000多人次，所包居民区无一例疫情发生，构建了一道疫情防护的“安全墙”。
防疫物资早准备。为保证“疫”线干部职工安全，油田局（分公司）及早入手、多方协调、积极采购，1月27日上午，第一批一次性口罩1000个，84消毒液50斤，酒精50斤及时购置到位。随后，根据疫情进展以及企业复工复产，陆续分批购进一线作业防护面罩、测温仪、N90防护口罩、一次性医用口罩、84消毒液和酒精等防疫物品，切实做好防疫卡点值班和企业复工复产的防疫物资储备工作，充分保障员工人身健康安全。
（二）卷烟营销勇争先
部署谋划早。2月7日，油田分公司在市局微信调查问卷的基础上，再次组织卷烟营销人员通过微信问卷调查、电话直接沟通等形式扎实开展“线上”调研，迅速、准确的收集辖区零售客户现有库存、销售需求、开门复工等信息，通过数据信息分析，初步研判疫情对辖区卷烟市场影响的程度，及时为复工复产营销策略制定及调整做好精准服务准备。
工作执行快。牢固树立“效率就是效益”的理念。接到市局（公司）复工通知后，局（分公司）主要负责人于2月14日向官庄工区党工委书记和工区分管领导当面汇报，协调办理物流配送车辆通行证1份，单位生产经营用车和私家车通行证6份，充分做好卷烟配送复工复产准备。
积极协调辖区2个大型连锁商超的负责人，向其讲明情况，寻求帮助，对方答应一旦卷烟开始配送，车辆调配不及，他们的民生物资保障用车提供给我们免费使用，用于往返物流中心运输卷烟。
严格贯彻市局（公司）“卷烟”不过夜的要求，抽调销售、专卖6人组成“党员突击队”，驾驶单位公车、私家车以及三轮摩托将因卡点管控、道路封闭无法送货到户的卷烟，第一时间送到辖区村口，送到社区卡口，送到商店门口，确保卷烟不在单位过夜，迅速将卷烟由配送状态转化为消费状态。
营销服务准。油田辖区现有人口12.5万人，常住人口约7.8万人，近5万人常年外出务工。油田局（分公司）紧盯因疫情而无法外出务工人员这个庞大的消费群体，及时调整卷烟营销策略。
对于7家准予开门营业的连锁超市提供营销保障服务，积极向营销中心申请，增加订货频度，最大限度满足订货需求，通过他们民生保障配送渠道满足油区中心区域和偏远农村的卷烟消费需求；对于32个居民小区门口的烟酒商行提供营销精准服务，客户经理及时网上了解卷烟需求信息及复工状态，给与一定程度的货源倾斜，尽力保障其货源供应，切实满足社区居民消费需求；对于因疫情限制开门经营能力一般的商户提供营销提醒服务，客户经理通过电话、微信进行定期拜访，关注复工状态，宣传货源政策，促其及早订货，切实提高辖区商户复工率和订货成功率。
截止3月11日，共销售1052箱卷烟，占卷烟销售计划3230箱的32.6%，超全市平均进度6个百分点。
（三）市场监管尽主责
一是扎实开展市场经营状况摸底排查，通过电话、微信及现场调查相结合的方式，监控市场动态，有重点的指导、提醒、督查零售户进行规范经营，有针对性地对可疑零售户进行集中检查和盯防，加大对违法违规大户的管控力度，切实扎紧市场篱笆，严防卷烟非法流通。
二是配合送货员跟班作业，既做好送货到位督查，又了解辖区卷烟配送存在的实际困难，针对疫情防控封闭管理举措，分层分级逐户研究送货对策，专销协同发力，确保及时配送到户。
三是加强与物流部门的沟通，进行线上可疑快递单号筛选，实地深入包裹分拣线、快递代收点、快递超市进行有针对性排查，切断疫情期间各类违法卷烟中转、外流渠道。
二、存在的困难
一是受河南油田企业经济效益影响，油区大量人员在新疆、中东地区进行石油勘探外包工作，人口流动性大，连续多年卷烟销量呈现下降趋势。
二是2019年12月，辖区卷烟市场进行重新划分，城区、唐河、新野三地的近90户农村商户并入我辖区，低档位卷烟需求增多，卷烟结构提升困难。
三、下一步工作打算
一是稳定销量。抓住外出务工人员出行、各行各业复工生产等机会，拓宽经营思路，最大程度地挖掘市场消费潜力。特别是刚刚划转的农村市场，积极与零售客户沟通，密切关注客户诉求，及时掌握并竭力帮助客户解决经营中的难题，建立良好客我关系，确保量不流失，完成全年销售目标任务。
二是提升结构。围绕辖区实际，及时分析市场动态，引导客户优化货源结构，做实事件营销、主题营销，以消费升级带动结构升级，同时，从4月份开始，向市公司营销中心申请，限制低三类以下卷烟的投放，推动销售结构稳步提升，确保单箱目标任务的顺利实现。
**油田烟草专卖局（分公司）
2020年3月12日
第五篇：利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸
微生物发酵工程案例教学
利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸
Dae-Kyun Ro1*, Eric M.Paradise2*, Mario Ouellet1, Karl J.Fisher6, Karyn L.Newman1, John M.Ndungu3, Kimberly A.Ho1, Rachel A.Eachus1, Timothy S.Ham4, James Kirby2, Michelle C.Y.Chang1, Sydnor T.Withers2,Yoichiro Shiba2, Richmond Sarpong3 & Jay D.Keasling1,2,4,5
（杨豫鲁翻译）
摘要：疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，并且每年杀死超过一百万的人口。抗药疟原虫突变系Plasmodium falciparum2,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。虽然人工合成的抗疟药以及相关疫苗已经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的临床检验4，5。而青蒿素，一种从Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），对抗药性疟原虫Plasmodium spp的抑制效果非常明显。可惜的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾患者大都难以承受其昂贵的价格6。青蒿素的人工全合成也非常困难，而且花费很大7。不过利用微生物工程发酵合成其前体青蒿酸（一种合成青蒿素的可靠来源）,却是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法8，9。这里我们将介绍如何通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达100ug/L）：对其甲羟戊酸途径进行调控，并且转入编码amorphadiene（等价于amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素P450酶(CYP71AV1)的基因。这两种酶均源自青蒿，而且后者经过三步氧化作用将amorpha-4,11-diene转变成青蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对疟疾的治疗中去。
内容:我们通过三个步骤构建能合成青蒿酸的基因工程酵母：（1）改造酵母焦磷酸法尼酯（FPP）生物合成途径中的相关基因，增加FPP的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前体去合成固醇；（2）将青蒿中的amorphadiene合酶基因ADS转入到高FPP生产株中，从而转化FPP为amorphadiene；（3）克隆青蒿中特异的细胞色素P450酶基因（这种酶通过三步氧化将amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在amorphadiene生产株内表达（见图1）。青蒿素生物合成的第一步反应由ADS10催化，它已经被鉴定并且用于在大肠杆菌
微生物发酵工程案例教学
图1| 图中所示为同时表达CYP71AV1和CPR的基因工程啤酒酵母菌株EPY224中青蒿酸的合成途径。蓝颜色显示的是啤酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的基因；紫色显示的是因upc2-1表达被间接正调节的基因； 红线指示菌株EPY224中被抑制的ERG9；绿色箭头指示从焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合成途径，这条途径已经从青蒿被完全引入到啤酒酵母当中，在CYP71AV1和CPR共同作用下经过三步氧化将amorphadiene转变为青蒿酸。途径中间产物IPP, DMAPP和GPP分别代表异戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯焦磷酸酯和焦磷酸牻牛儿酯。
中合成amor phadiene11。为了确定对是否要促进细胞内FPP的合成，我们将ADS基因插入由GAL1 启动子控制转录的pRS425质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入ADS基因的酵
微生物发酵工程案例教学
母只合成少量的amorphadiene（图2，菌株EPY201，4.4mg/L）。
图2 |柱状图显示基因改造过程不同阶段啤酒酵母菌株的amorphadiene合成能力，这些菌株的详细介绍请见正文。为减小实验误差，均在同一条件下培养144小时后取样测定，amorphadiene合成水平也被定量化。纵坐标表示总产量，为平均值±标准差(n =3)。
所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我们对FPP合成途径进行了总共五次的基因工程改造。几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体过程如下：首先，将一种截短的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（我们所学生化书中为译为β-羟基-β-甲基-戊二酰辅酶A还原酶，简称HMGCoA还原酶，又简称tHMGR12，是固醇合成的限速酶）过表达，可提高amorphadiene的合成产量近五倍（图2，菌株 EPY208）；其次，利用一个methioninerepressible启动子(PMET3)13，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后第一步）的ERG9基因进行负调控，可将amor phadiene的合成量再增加两倍（图2，菌株EPY225）；然后，尽管upc2-1, 一个可以加强UPC２（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）14活性的半显性突变体等位基因，在已有菌株 EPY208背景下过表达（图2，菌株EPY210）对amorphadiene合成的提高起的作用并不显著，但结合对ERG9基因的负调控，其过表达可将amorphadiene的合成量提高到105mg/L（图2，菌株EPY213）；再次，在酵母染色体更远处在转进一个tHMGP拷贝可以将将其合成量再增加50%达到149mg/L（图2，菌株 EPY 219）；最后，虽然编码FPP合酶的
微生物发酵工程案例教学
基因（ERG20）过表达对amorphadiene合成总量（图2，菌株 EPY224）的提高效果非常小，但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10%。将所有这些对基因的修饰综合在菌株EPY224上，amorphad iene的合成量已经达到了153mg/L , 是之前所报道这种倍半萜(烯)最大合成水平的几乎500倍15。
（王易龙翻译）
现在我们已经得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但为能将amor phadiene转变成青蒿酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化amorphadiene转变成青蒿酸的酶的基因。青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一类十分有特性的细胞次级代谢产物。我们假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进行了一次基因组比较分析。由于先前已经有文章报道过对青蒿的无细胞化验，并且证明在青蒿中是一种特异的细胞色素P450酶17对amorphadie ne进行专一性羟化（图1）。我们直接从由向日葵和莴苣这两种菊科作物提供的基因数据构建的已表达序列标志（EST）数据库中检索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs）。然后通过使用针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族）高度特异的简并引物，从青蒿毛状体细胞的互补DNA库中分离出几个特定的P450片段。接着利用BLAST分析法18将这些片段与向日葵和莴苣的ESTｓ比对，我们惊奇地发现有一个青蒿P450基因片段与来自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上达相似度达85-88%），而同其他非菊科植物的P450序列相似度较低（氨基酸水平上小于50%）。这表明相对于非菊科植物，P450基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保守的。因此，从青蒿中分离出的这段P450基因是编码菊科保守性倍半萜内酯生物合成酶一个非常好的候选者。
随后相应的完整P450cDNA（CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。系统进化分析法显示CYP71AV1和其他的P450s（像催化类单萜羟化的CYP71 D13/
18、催化倍半萜羟化的CYP71D20以及二萜类化合物羟化的CYP71D16）有很近的亲缘关系。这进一步表明从青蒿中获得的P450在萜类化合物代谢中存在的潜在作用。为了保证异源表达的CYP71AV1可以发挥正常功能，协同它进行氧化还原反应的天然配体，NADPH：细胞色素P450氧化还原酶（CPR），同样从青蒿中成功分离，并且其生化活性已经在体外被证实。(细胞色素c 和 NADPH 的米氏常数(Km)分别为4.3±0.7 μM 和 23.0±4.4 μM(平均值 ±标准差, n ＝3))。
在配体分子CPR的参与下，我们研究了在活细胞体内CYP71AV1是否可以催化amorphadie 19
21微生物发酵工程案例教学
ne转变为多级氧化产物：转基因酵母株EPY224中被转入了一个整合有CPR和CYP71AV1基因并且由半乳糖诱导启动子调控的基因载体，经半乳糖的诱导表达后，用醚对酵母细胞体和培养基分别进行抽提，并对馏分进行气象色谱—质谱联合分析(GC–MS)。分析结果显示，在同时表达CYP71AV1 和 CPR的细胞株EPY224细胞体及其培养基中，一个独特的单色谱峰被检测出，但是在只表达CPR的EPY224中并未检测到这个峰，并且，几乎95%的这种特异化合物是来源于细胞体的。而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合（图 3）。在摇瓶培养条件下，同时表达CYP71AV1 和CPR的EPY224菌株青蒿酸产量为32 ± 13 mg/L(平均数 ±标准差, n＝7)。更为重要的是，其中间代谢产物，青蒿醇和青蒿醛在细胞体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%还少，并且根本没有青蒿醛被检测出）。
我们证实，通过用碱性缓冲液（pH为9的Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分离出，而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为2%。青蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面。利用这个特点制定了一种便捷提纯方法：用醚对清洗缓冲液进行抽提，然后经过一步简单的凝胶柱层析分离抽提物，就可以得到纯度高于95%的青蒿酸。在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为115mg，而通这种方法的，我们可以得到76mg的提纯产物。最重要的是，经 1H and13C原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与从青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样，并且同先前的文献报道十分吻合22，23。因此，可以确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸。
（周景峰翻译）
转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相比，其细胞体干重的4.5%相当于青蒿中1.9%的青蒿酸和0.16%的青蒿素，但是所需的时间非常短（酵母4-5天，而青蒿则需要几个月的时间）。因此，转基因酵母菌珠的单位生产效率比青蒿高了近两个数量级。
P450酶三步氧化法曾在植物赤霉素生物合成途径中有过报道24，25。我们通过体外酶法检测CYP71AV1是否在amorphadiene转化为青蒿酸的三个过程中都起到催化作用。从啤酒酵母菌株YPH499中分离微体，这些微体仅表达CPR或者同时表达CPR和CYP71AV1。将微体在不同的合成途径中间体（amorphadiene，青蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养（图4）。对照组微体仅表达CPR，没有催化任何合成途径中间体以到更高级的氧化产物。但是我们发现包含CYP71AV1和CPR的微体将amorphadiene、青蒿醇和青蒿醛更加高效地转化成了青蒿酸。这
微生物发酵工程案例教学
些体外实验毫无疑问地证明：重组CYP71AV1可以在amorphadiene的C12位置催化三次氧化反应。虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种C11，13双键还原酶（作用于醛）参与青蒿素的生物合成 17。我们不排除在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应，但是体外实验中重组的CYP71AV1将amorpha-4, 11-diene高效转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素。
图3：气相层析质谱法（GC-MS）分析从青蒿蒿和转基因酵母中获得的青蒿酸
a． 表达CPR或者CPR和CYP71AV1的啤酒酵母菌株细胞体使用碱性缓冲液冲洗后，经酸化和醚抽提提纯。青蒿酸用乙烷从青蒿的叶子里提取。在进行GC-MS分析之前，每个样品的甲酯化产物需经三甲基硅烷-重氮甲烷提前处理。内标物（IS）是4-辛基苯甲酸的甲酯化物。
b，c．从酵母（b）和青蒿（c）中得到的青蒿酸的质谱和保留时间。RT表示保留时间，以分钟计。
微生物发酵工程案例教学
图4：体外酶法测定CYP71AV1的活性。从啤酒酵母菌株YPH499中分离获得的微体表达CPR（对照组）或者CPR和CYP71AV1(CYP71AV1组)。
a-c．每一种酶的测定分别加入（a）10µM amorphadiene，（b）25µM 青蒿醇，或者（c）25µM 青蒿醛。底物的色谱峰用星号标出。醚提取物经过衍生，并用GC-MS在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189，204，218，220和248）。酶反应的产物按照预期得到：1，青蒿醇（保留时间13.20分钟）；2，青蒿醛（保留时间11.79分钟）；3，青蒿酸（保留时间13.58分钟，甲酯化后检测）
总的来说，我们采用改造FPP生物合成途径的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株。该方法通过表达amorphadiene合成酶，一种新型的细胞色素P450和与之相关的来自青蒿的氧化还原酶来提高青蒿酸的产量。据了解，相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多待改进之处8，9，但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法。保守分析证明，在使产品效价最优化的情况下，青蒿素结合治疗法将会远远降低于现在用于疟疾治疗的价格。除了节省费用之外，这种生物合成方法不会受到像天气和政治气候等因素的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。进一步说，从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致使产物受到污染，从而减少了纯化的费用。
微生物发酵工程案例教学
方法：
对于啤酒酵母的增殖与鉴定、CYP71AV1和 CPR基因的克隆以及青蒿醇和青蒿醛的半合成等实验过程中所使用的手段方法的详细描述请见补充信息。
化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于Apin Chemicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取。青蒿植株被栽培在加州大学伯克利分校的温室当中，并且都是从种子开始培育的。GC—MS法分析Amorphadiene：用GC—MS对不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量进行测定，使用十二烷阻止Amorphadiene的挥发。为了定量衡量Amorphadiene产量水平，用于测定标准曲线的Amorphadiene（90%纯）是通过大肠杆菌菌株发酵制备的。
青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：将经过预培养的在600nm（A600）下吸光度达到0.05的EPY224菌株（已经被转入pESCURA::CPR 或者 pESCURA::CPR/CYP71AV1）接种到25ml合成培养基中。该培养基不含组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%的葡萄糖、1.8%的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸。300C下恒温培养120小时，然后将培养混合物进行离心，留下细胞体。再用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）冲洗细胞体，加入2M的HCl将缓冲液的pH调至2.0，用混入4-烷基苯甲酸（10ug/ml）的乙酸乙酯进行萃取。萃取馏分经50ul 2M的四甲基硅烷-重氮甲烷和10%的甲醇衍生。在进行GC-MS分析前，产物还要经过以（1：1）的醚和戊烷为洗脱剂的凝胶色谱提纯。
（阳 震翻译）
最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（70eV，Agilent Technologies）分析，毛细管柱为DB5（0.25毫米内径 ×0.25µ×30m，J&W Scientific）。气相色谱的加热程序从80℃（保持2分钟），以每分钟20℃的梯度递增到140℃。产品分离时由5℃/min的速度增加到220℃。采用火焰电离色谱检测标准品时为了定量，没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化。发酵及产物的核磁共振分析:使用1升的生物反应器（New-Brunswick Scientific），在30℃的条件下，培养酵母菌93个小时。2%的半乳糖的诱导酵母细胞，600nm下测OD值为1.7，最终的细胞浓度OD值A600达到5.0。搅拌速度从100rmp变到500rmp，每分钟通氧0.5L，使得溶氧量始终保持在40%，青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀物中提取出来，再使用含有78%的乙烷，20%的乙酸乙酯和2%的乙酸的硅胶管柱提纯。分离得到的青蒿酸（纯度大于95%）的结构采用College of Chemistry NMR Facility at the University of California提供的1H和13C NMR500MHz核磁共振仪进行分析。
体外酶法测定:用重组质粒pESCURA::CPR或者pESCURA::CPR/CYP71AV1与1升的啤酒酵母
微生物发酵工程案例教学
YPH499培养物，加入2%的半乳糖转化24小时。微体使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速离心去除前面提到的细胞里的蛋白质杂质26。取大约500µg的微体蛋白，100mM pH 7.5的磷酸加缓冲液, 10或者25µM 的培养基，100µM NADPH和一个NADPH的重建体系（5mM 葡萄糖-6-磷酸和2个单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）。反应在24℃下轻微搅拌作用24小时。反应完成之后加酸至pH 为2，然后使用乙醚抽提。产物采用与上面所述相同的气相加热程序。使用包含了相对于产物典型的六种离子（121，189，204，220和248）的固定离子检测（SIM）法进行检测。
更过补充信息请查阅在线网页www.xiexiebang.com/nature.致谢：
感谢提供官方CYP数据的Nelson教授，进行从青蒿中提纯青蒿酸工作的Ockey教授和McPhee教授的。感谢提供pδ-UB的N.A.Da.Silva, 提供pRH127-3和pRH973的R.Y.Hampton,提供 pBD33 和 pBD36的 J.Rine。感谢菊科基因组计划的R.Michelmore和其他成员对本项目的支持。最后感谢梅林达-比尔盖茨基金会、美国农业部、美国国家科学基金会、Institute for OneWorld Health、Akibene Foundation、University of California Discovery Grant、the Diversa Corporation 提供资金支持。
参考文献：
[1] World Health Organization.World Malaria Report 2005.(WHO, Geneva, 2005).[2] Korenromp, E.L., Williams, B.G., Gouws, E., Dye, C.& Snow, R.W.Measurement of trends in childhood malaria mortality in Africa: Anassessment of progress toward targets based on verbal autopsy.Lancet Infect.Dis.3, 349–-358(2003).[3] Marsh, K.Malaria disaster in Africa.Lancet 352, 924(1998).[4] Hoffman, S.Save the children.Nature 430, 940–-941(2004).[5] Vennerstrom, J.L.et al.Identification of an antimalarial synthetic trioxolane drug development candidate.Na ture 430, 900–-904(2004).[6] Enserink, M.Infectious diseases: Source of new hope against malaria is in short supply.Science 307, 33(2005).[7] Schmid, G.& Hofheinz, W.Total synthesis of Qinghaosu.J.Am.Chem.Soc.105, 624–-625(1983).[8] Acton, N.& Roth, R.J.On the conversion of dihydroartemisinic acid into artemisinin.J.Org.Chem.57,3610 –-3614(1992).[9] Haynes, R.K.& Vonwiller, S.C.Cyclic peroxyacetal lactone, lactol and ether compounds.US patent 5,310,9 46(1994).[10].Mercke, P., Bengtsson, M., Bouwmeester, H.J., Posthumus, M.A.& Brodelius,P.E.Molecular cloning exp ression, and characterization of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme of artemisinin biosynthesis in Art emisia annua L.Arch.Biochem.Biophys.381, 173–-180(2000).微生物发酵工程案例教学
[11] Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D.& Keasling, J.D.Engineering a mevalonate pathwa y in Escherichia coli for production ofterpenoids.Nature Biotechnol.21, 796–-802(2003).12.Donald, K., Ha mpton, R.& Fritz, I.Effects of overproduction of the catalyticdomain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym e A reductase on squalenesynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.63, 3341–-3344 [13] Gardner, R.G.& Hampton, R.Y.A highly conserved signal controls degradation of 3-hydroxy-3-methylglut aryl-coenzyme A(HMG-CoA)reductase in eukaryotes.J.Biol.Chem.274, 31671–-31678(1999).1[4.]Davies, B.S.J., Wang, H.S.& Rine, J.Dual activators of the sterol biosynthetic pathway of Saccharomyces cerevisiae: Similar activation/regulatory domains but different response mechanisms.Mol.Cell.Biol.25, 7375–-7385(2005).[15]Jackson, B.E., Hart-Wells, E.A.& Matsuda, S.P.T.Metabolic engineering to produce sesquiterpenes in yeast.Org.Lett.5, 1629–-1632(2003).[16] Seaman, F.C.Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae.Bot.Rev.48, 121–-592(1982).[17]Bertea, C.M.et al.Identification of intermediates and enzymes involved in the early steps of artemisinin biosynthesis in Artemisia annua.Planta Med.71,40–-47(2005).[18] Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W.& Lipman, D.J.Basic localalignment search tool.J.Mol.Biol.215, 403–-410(1990).[19] Lupien, S., Karp, F., Wildung, M.& Croteau, R.Regiospecific cytochrome P450limonene hydroxylases from mint(Mentha)species: cDNA isolation,characterization, and functional expression of(2)-4S-limonene-3-hyd roxylase and(2)-4S-limonene-6-hydroxylase.Arch.Biochem.Biophys.368, 181–-192(1999).[20]Ralston, L.et al.Cloning, heterologous expression, and functional characterization of 5-epi-aristolochene-1, 3-dihydroxylase from tobacco(Nicotiana tabacum).Arch.Biochem.Biophys.393, 222–-235(2001).[21] Wang, E.et al.Suppression of a P450 hydroxylase gene in plant trichomeglands enhances natural-product-based aphid resistance.Nature Biotechnol.19,371–-374(2001).[22] Elmarakby, S.A., El-Feraly, F.S., Elsohly, H.N., Croom, E.M.& Hufford, C.D.Microbiological transformations of artemisinic acid.Phytochemistry 27,3089–-3091(1988).[23]Kim, S., Han, J.& Lim, Y.Revised assignment of 1H-NMR signals of artemisinicacid.Planta Med.62, 480–-481(1996).[24] Helliwell, C.A., Poole, A., Peacock, W.J.& Dennis, E.S.Arabidopsisent-kaurene oxidase catalyzes three steps of gibberellin biosynthesis.PlantPhysiol.119, 507–-510(1999).[25]Helliwell, C.A., Chandler, P.M., Poole, A., Dennis, E.S.& Peacock, W.J.The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway.Proc.Natl Acad.Sci.USA 98,2065–-2070(2001).[26] Pompon, D., Louerat, B., Bronine, A.& Urban, P.Yeast expression of animaland plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol.272,51–-64(1996).
点击咨询 