人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及实验室检测策略

第一篇：人感染 H7N9 禽流感病毒标本采集及实验室检测策略

人感染 H7N9 禽流感 病毒标本采集及实验室检测策略

一、标本采集、转送和检测

（一）标本采集 为进行病例诊断，医疗机构应尽早采集病人的相关临床样本。采 集的临床标本包括病人的上呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽 取物、咽漱液和鼻洗液）、下呼吸道标本（如气管吸取物、肺洗液、肺组织标本）和血清标本等。应当尽量采集病例发病早期的呼吸道标 本（尤其是下呼吸道标本）和发病7天内急性期血清以及间隔2-4周的 恢复期血清。如病人死亡，应当尽可能说服家属同意尸检，及时进行 尸体，采集组织（如肺组织、气管、支气管组织）标本。医疗机 构采集的呼吸道标本每份不少于3ml。血清标本每份分为2管，每管不 少于0.5ml。对人感染H7N9禽流感 病例可能暴露的禽类饲养或交易等场 所，由疾控机构采集禽类粪便、笼具涂拭标本和环境污水等标本，技 术要求参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011年版）》。

（二）医疗机构标本检测和转送

1.病例的临床标本采集后，有条件开展核酸检测的医疗机构要 对呼吸道标本开展H7N9禽病毒核酸检测，没有条件开展核酸检测的医 疗机构应立即利用快速抗原检测试剂进行甲型流感病毒抗原检测，H7N9禽流感病毒核酸检测阳性的临床标本按照B类感染性物质进行包 装运输，在低温条件下，48小时内送到当地流感监测网络实验室，由 当地流感监测网络实验室上送到省级疾控中心网络实验 室。甲型快速 抗原检测阳性的标本，按上述相同的包装要求24小时内送当地流感监 测网络实验室开展核酸检测。

2、没有条件开展上述检测工作的医疗卫生机构发现符合病例定 义的病例后，要立即采集相关标本，按照B类感染性物质进行包装运 输，在低温条件下，24小时内送到当地流感监测网络实验室。

3、流感网络实验室的检测策略（流程图见附件）流感网络实验室收检的呼吸道标本每份分为3管，每管应不少于 1ml。1 于检测，另外2 于复核和病毒分离。标本储存应在-70℃ 或以下温度，避免反复冻融。

（1）对于甲型流感病毒抗原阳性的疑似病例，在24小时内进行 H7、H5亚型的检测，如检测阴性，可继续进行甲型H1N1流感和季节性 H3N2流感病毒等检测。

（2）对于有流行病学接触史的疑似病例，在24小时内进行甲、乙型流感通用引物、H7和H5亚型的检测。如上述检测均阴性，不再进 行流感病毒核酸检测。若甲型流感病毒通用引物阳性，H7、H5亚型阴 性，可继续进行甲型H1N1流感和季节性H3N2流感病毒等检测。

（3）在发生病例的地区开展强化监测时，对采集的ILI和SARI 病例的呼吸道标本在48小时内进行甲、乙型流感病毒通用引物，以及 H5、H7亚型的检测。如上述检测均阴性，不再进行流感核酸检测。若 甲型通用引物阳性，H7、H5亚型阴性，按照2010年全国流感监测方案 的要求开展病毒分离。（4）若当地流感监测网络实验室检测结果为H7亚型禽流感病毒 核酸阳性时，应当于48小时内将其中2管呼吸道相关原始标本送省级 疾控中心网络实验室。

（5）省级疾控中心网络实验室在接到医疗机构和本省网络实验 室送检的H7和H5亚型阳性的呼吸道标本时，具备相应生物安全条件的 网络实验室在2周内完成病毒分离工作，并将分离的毒株按要求48小 时内送国家流感中心。未能开展病毒分离的省级疾控中心网络实验室 将阳性病例的原始标本48小时内送国家流感中心开展病毒分离。

（6）各医疗机构采集的双份血清标本48小时内送当地流感监测 网络实验室，由当地网络实验室48小时内将血清标本分别送省级疾控 中心和国家流感中心开展相关抗体检测，进行病例诊断。

（7）对人感染H7N9禽流感 病例可能暴露的禽类饲养或交易 等场所，采集禽类粪便、笼具涂拭标本和环境污水等标本2周内开展 甲型流感通用引物、H5、H7和H9亚型检测。有条件开展病毒分离的实 验室对阳性标本开展病毒分离工作，阳性分离株在2周内送国家流感 中心。没有条件开展病毒分离的实验室在2周内将阳性标本送国家流 感中心。具体技术要求可参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性 禽流感监测方案（2011年版）》。

（8）对于甲型通用引物阳性而不能区分型别或亚型的毒株和阳 性标本要求在48小时内送至国家流感中心。

（9）国家流感中心在接到阳性标本后2周内完成病毒分离工作。

（三）实验室生物安全基本要求

1、H7N9禽流感病毒实验室活动和样本运输按照《人间传染的病 原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行 和审批。并建立H7N9 禽流感病毒及样本保存 制度，并采取可靠的安保措施。

2、未经培养的临床样本的分装、灭活和核酸提取应当在生物安 全二级实验室生物安全柜内开展。工作人员应着防护服，佩戴眼罩、N95及以上水平的 等个人防护装备。

3、H7N9禽流感病毒的分离培养须在生物安全三级实验室进行。

4、样本采集及实验活动过程中产生的医疗废物要分类收集，经 压力蒸汽灭菌或其他可靠灭菌后，按医疗废物收集处置。

二、标本检测结果反馈和报告 开展实验室检测的各级流感监测网络实验室和国家流感中心要 在检测工作完成后24小时内将标本信息和检测结果录入到 “中国流感 监测信息系统” “传染病监测技术平台信息管理系统” 或（环境标本）中。病例标本检测结果在24小时内由流感监测网络实验室所在疾控中 心反馈到病例所在医院，由医院进行病例的报告。

第二篇：2014年人感染H7N9禽流感病毒培训试题(参考答案)

2014年人感染H7N9禽流感病毒培训试题（参考答案）

1、什么是流感？

流行性感冒，简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。最常见的流感起病突然，畏寒、寒战，高热，体温可达39～40℃，伴头痛、全身肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽喉痛、干咳，可有鼻塞、流涕等。如无并发症，多于发病3～4天后症状好转，但咳嗽、体力恢复常需1～2周。轻症者如普通感冒，症状轻，2～3天可恢复。

2、什么是禽流感？

禽流感主要是指禽中流行的由流感病毒引起的感染性疾病。禽流感病毒可分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和无致病性禽流感病毒。高致病性禽流感病毒目前只发现H5和H7两种亚型。由于种属屏障，禽流感病毒只在偶然的情况可以感染人，既往确认感染人的禽流感病毒有H5N1、H9N2、H7N2、H7N3、H7N7、H5N2、H10N7，症状表现各不相同，可以表现为呼吸道症状、结膜炎、甚至死亡。人感染高致病性H5N1禽流感病毒后常表现为高热等呼吸道症状，往往很快发展成肺炎，甚至急性呼吸窘迫综合症和全身器官衰竭，甚至死亡。

3、什么是H7N9禽流感病毒？

流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白(HA)的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白(NA)的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。H7N9亚型流感病毒既往仅在禽间发现，在荷兰、日本及美国等地曾发生过禽间暴发疫情，但未发现过人的感染情况。

4、H7N9禽流感感染病例的主要临床表现？

患者一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽、少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛、腹泻等全身症状。重症患者病情发展迅速，多在发病3～7天出现重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰。常快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，部分患者可出现胸腔积液等表现。

5、如何预防H7N9流感？

流感是一种急性呼吸道感染性疾病。勤洗手、室内勤通风换气、注意营养、保持良好体质有利于预防流感等呼吸道传染病。出现打喷嚏、咳嗽等呼吸道感染症状时，要用纸巾、手帕掩盖口

鼻，预防感染他人。此外，还要特别注意尽量避免直接接触病死禽、畜。

6、公众如何保护自己？

保持勤洗手、咳嗽和打喷嚏时遮掩口鼻等个人卫生习惯，能够有效预防流感等呼吸道传染疾病。同时还应避免接触病死禽、畜。

7、医务人员感染H7N9禽流感病毒的风险大吗？

由于医务人员比普通公众接触患有感染性疾病病人的机会更多，建议医务人员在诊治病人过程中采取必要的防护措施。在接诊疑似或确诊H7N9禽流感病例时，应采取标准预防加飞沫传播预防和接触预防。

第三篇：医院人感染H7N9禽流感病毒 - 武威市卫生局

医院人感染H7N9禽流感病毒

核酸检测标准操作程序

一、目的确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。

二、适用范围

医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函„2013‟383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电„2013‟29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。

三、样本采集、运送和保存

尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时，应优先采集。

根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考

核。样本的采集应当严格按照SOP进行。

样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可臵于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应臵于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。

样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。

四、PCR检测

（一）样本处理

样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架臵于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件，可于-20℃冰箱暂存。

（二）试剂准备

试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。

（三）加样

加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

按试剂、仪器说明书完成加样和PCR反应管准备。

（四）PCR扩增检测

PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区，按顺序臵于PCR仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参数。

（五）结果分析

根据所用试剂盒说明书设臵基线值（baseline）。荧光阈值（threshold）设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为原则，且Ct值应大于

所设臵的扩增循环数（或显示为undet）。使用仪器配套软件自动分析结果。

（六）质量控制

检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样本检测时，至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本（多份阴性质控样本设臵对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。

试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，按试剂盒说明书进行。

（七）实验结果的判定与解释。

按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测，并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。

五、检测结果报告

按照试剂盒说明书进行。

六、其它注意事项

（一）人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能，在检测过程中必须采取生物安全防护措施（使用眼罩、N95型口罩等）。样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室，经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。

（二）注意仪器设备的日常和定期维护，加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无DNA酶和RNA酶PCR反应管、离心管、带滤芯吸头等应进行每批质检。

（三）实验应严格分区操作；各区物品、工作服等均应当专区专用，不得交叉使用。实验后应及时清洁工作台，以防污染。

（四）每批实验室后，可采取实验室通风、10%次氯酸钠溶液擦洗地台面、紫外照射等措施，消除可能存在的扩增产物气溶胶污染。

（五）使用中国疾控中心制备试剂开展检测工作时，可参考相应试剂盒说明书（见附件1、2）有关要求。