磁敏传感器竞争免疫法检测牛奶中的氯霉素残留量

第一篇：磁敏传感器竞争免疫法检测牛奶中的氯霉素残留量

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磁敏传感器竞争免疫法检测牛奶中的氯霉素残留量

作者：史晶晶 廉洁 周稳稳 石西增 高云华

来源：《分析化学》2012年第10期

摘要：利用直接竞争免疫原理和巨磁致电阻效应，建立了磁敏生物传感器检测氯霉素的方法。制备氯霉素半抗原芯片，依次加入待测样品、生物素化抗体、链霉亲和素磁颗粒偶联物，使之发生竞争免疫反应，再利用传感器检测芯片上结合的磁颗粒数目。通过对检测条件的优化，建立了氯霉素浓度与磁颗粒数目的标准工作曲线。本方法的检测范围为0.05～100.0 μg/L；检出限为50 ng/L；用于牛奶检测，回收率为95.97%～99.36%；批内相对标准偏差为0.8%～3.9%，批间相对标准偏差为1.1%～1.7%；与ELISA方法的一致相关系数达到0.98。本方法可在30 min内快速完成定量检测，为快速多靶标磁敏竞争免疫检测体系的建立提供了可行性。

第二篇：水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201905）

附件5

水产品中氯霉素的快速检测

胶体金免疫层析法

（KJ201905）

范围

本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。

原理

本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为

GB/T

6682

规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

正己烷。

3.1.2

丙酮。

3.1.3

乙酸乙酯。

3.1.4乙腈

3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。

3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。

3.1.7

氯化钠

3.1.8

复溶液：称取0.12

g磷酸二氢钠

(3.1.5)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16

g

(3.1.6)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A

2.8

mL、溶液B

7.2

mL、氯化钠(3.1.7)0.85

g，用水溶解并稀释至100

mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。

3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。

3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。

3.2

标准物质

氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。

表1

氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

氯霉素

Chloramphenicol

56-75-7

C11H12Cl2N2O5

323.13

注：或等同可溯源物质。

3.3标准溶液配制

3.3.1

氯霉素标准储备液（1

mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10

mg，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1

mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。

3.3.2

氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1

mg/mL）（3.3.1）0.1

mL，置于10

mL

容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10

μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。

3.3.3

氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10

μg/mL）（3.3.2）0.01

mL分别置于10

mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01

μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。

3.4材料

3.4.1固相萃取小柱：Cleanert

Silica，200

mg/6mL。LOT：0170198。

3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。

3.4.2.1

金标微孔。

3.4.2.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

离心机：转速≥4000

r/min。

4.4

电子天平：感量分别为

0.01

mg和

0.01

g。

4.5

样品浓缩仪：如有需要。

4.6

环境条件：

温度：15～25℃，相对湿度：≤60%。

5分析步骤

5.1试样制备

取具有代表性样品约500

g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。

5.2试样提取和净化

准确称取试样6

g（精确至0.01

g）置于50

mL具塞离心管中，依次加入1

mL水和8

mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5

min，以4000

r/min离心5

min。转移全部乙酸乙酯层于50

mL具塞离心管中，加入正己烷25

mL，氯化钠1

g涡旋混匀，4000

r/min

离心1

min，上清液待净化。5

mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5

mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600

µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1

min，作为待测液。

5.3

测定步骤

5.3.1

检测卡与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸

5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.3.2

试纸条与金标微孔测定步骤

吸取150

µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3

min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3

min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5

min内进行结果判定。

5.3.3

检测卡测定步骤

吸取150

µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8

min，对结果进行判定。

5.4质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白样品6

g或适量（精确至0.01

g）置于15

mL具塞离心管中，加入180

μL氯霉素标准工作液（0.01

μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.3

μg/kg，一式2份，按照

5.2和5.3步骤与样品同法操作。

结果判定要求

通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。

6.1

无效

控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

6.2

阳性结果

检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。

6.3

阴性结果

检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。

6.4质量控制要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

结论

如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。

性能指标

8.1

检测限

氯霉素为0.1

μg/kg。

8.2

灵敏度

灵敏度应≥98%。

8.3

特异性

特异性应≥90%。

8.4

假阴性率

假阴性率应≤1%。

8.5

假阳性率

假阳性率应≤10%。

注：性能指标计算方法见附录A

9其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T

22338-2008

动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定

(包括所有修改单)。

附录

A

定性方法性能计算表

样品情况a

检验结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异(χ2)

χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

灵敏度（p+）

p+=N11/N1.特异性（p-）

p-=N22/N2.假阴性率(pf-)

pf-=N12/N1.=1-灵敏度

假阳性率(pf+)

pf+=N21/N2.=1-特异性

相对准确度

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

a由基准方法检验得到的结果；

b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。

验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。

主要起草人：李倩、阎安婷、陈煜、杨国伟。

第三篇：食用油中苯并（a）芘的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201910）

附件10

食用油中苯并（a）芘的快速检测

胶体金免疫层析法

(KJ201910)

范围

本方法规定了食用油中苯并（a）芘的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用于食用油中苯并（a）芘的快速测定。

原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苯并（a）芘经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苯并（a）芘进行定性判定。

试剂和材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T

6682规定的二级水。

3.1

试剂

3.1.1

正己烷：色谱纯。

3.1.2

乙腈：色谱纯。

3.1.3

二甲基亚砜（DMSO）。

3.1.4

NaH2PO4•2H2O。

3.1.5

Na2HPO4•12H2O。

3.1.6

氯化钠。

3.1.7

吐温-20。

3.1.8

氢氧化钠溶液（2

mol/L）：称取80g氢氧化钠用水溶解，并定容至1L。

3.1.9

PBST溶液：称取0.2965

g

NaH2PO4•2H2O、2.9

g

Na2HPO4•12H2O、8.76

g氯化钠与0.55

g吐温-20用水溶解并定容至1

L。

3.2

参考物质

苯并（a）芘参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥95%。

表1

苯并（a）芘参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子质量

苯并（a）芘

Benzo(a)pyrene

50-32-8

C20H12

252.32

注：或等同可溯源物质。

3.3

标准溶液的配制

苯并（a）芘标准储备液（0.1 mg/mL）：精密称取适量苯并（a）芘标准品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.1 mg/mL的苯并（a）芘标准储备液；或可直接购买苯并（a）芘标准储备液。0

℃~5

℃避光保存备用，有效期1年。

3.4

材料

苯并（a）芘胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为食用油。

3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。

3.4.2

试纸条或检测卡。

仪器和设备

4.1

移液器：100

µL、1

mL、5

mL和10

mL。

4.2

涡旋混合器。

4.3

离心机：转速≥4000

r/min。

4.4

电子天平：感量为0.01

g。

4.5

氮吹仪或空气吹干仪（带温度控制）。

分析步骤

5.1

试样制备

取适量有代表性样品充分混匀。

5.2

试样提取和净化除脂

称取10

g油样于离心管中，加入5

mL

正己烷（3.1.1）和15

mL

DMSO（3.1.3）并混合均匀。漩涡振荡2min，然后4000

r/min离心2

min。弃去上层正己烷层。加入5

mL

正己烷（3.1.1），漩涡振荡30

s，然后4000

r/min离心30

s。弃去上层正己烷层。加入10

mL

氢氧化钠溶液（2

mol/L）（3.1.8）和15

mL正己烷（3.1.1），漩涡振荡30s，然后4000

r/min离心30

s。吸取上层正己烷层于15

mL离心管，4000

r/min离心2

min。取全部正己烷层于氮吹管中，50℃氮吹或空气吹10

min，吹干后加入200μL

DMSO（3.1.3）复溶，混合均匀，此为待测液。

5.3

测定步骤

打开试纸筒，取出所需数量的红色反应微孔（取出微孔后，立即盖好桶盖，以防受潮）。往微孔中加入200

μL的PBST溶液，再加入50

μL待测液，上下抽吸5~10次至微孔试剂混合均匀，室温（20℃~25℃）反应7

min。将已做好标记的试纸条插入至上述红色微孔中，使样品垫充分进

入样品中，并计时7

min。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，进行结果判定。

5.4

质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1

空白试验

称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2

加标质控试验

准确称取空白试样（精确至0.01

g）置于玻璃试剂瓶中，加入一定体积的苯并（a）芘标准储备液（0.1

mg/mL）（3.3.1），使试样中苯并（a）芘浓度为10

μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

结果判定方式

由于长时间放置会引起质控线（C线）与检测线（T线）颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。试纸条与检测卡如图1所示。结果判定也可根据产品说明书进行。

6.1

读数仪测定结果

通过读数仪对结果进行判读，根据不同厂家仪器规定进行判读。

无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

阳性：若检测结果显示“+”（阳性），表示试样中含有待测组分且其含量大于等于方法检出限。

阴性：若检测结果显示“-”（阴性），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限。

6.2

目视判定

通过对比质控线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。

无效：质控线（C线）不显色，无论检测线（T线）是否显色，均表示实验结果无效。

阳性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）不出现或出现但颜色浅于质控线（C线），表示试样中含有待测组分且其含量高于方法检出限，判为阳性。

阴性：质控线（C线）显色，若检测线（T线）颜色深于或等于质控线（C线），表示试样中不含待测组分或其含量低于方法检出限，判为阴性。

6.3

质控实验要求

空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。

C

T

S

C

S

T

C

T

S

C

T

S

C

T

S

C

T

S

加样孔

无效

阴性

阳性

B．检测卡

吸水纸

NC膜

样品垫

无效

阴性

阳性

C线

T线

A．试纸条

图1目视判定示意图

结论

当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。

性能指标

8.1

检测限

10μg/kg。

8.2

灵敏度

≥95%。

8.3

特异性

≥85%。

8.4

假阴性率

≤5%。

8.5

假阳性率

≤15%。

注：性能指标计算方法参见附录A。

其他

本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB

5009.27-2016《食品安全国家标准

食品中苯并（a）芘的测定》。

本方法使用试剂盒可能与苯并（a）蒽、苯并（b）荧蒽、苯并（e）芘、苯并（j）荧蒽等物质存在交叉反应，当结果判定为阳性时应对结果进行确证。

附录A

定性方法性能计算表

表A.1性能指标计算方法

样品情况a

检测结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

灵敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特异性（p-，%）

p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果。

b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位：广东省食品检验所。

验证单位：成都市食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。

本方法主要起草人：熊含鸿、王立亚、简德威、陈思敏、雷毅

第四篇：酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮

酶联免疫法检测虾中的呋喃唑酮代谢物

摘要建立养殖虾类中 AOZ残留 ELISA筛选方法。方法: 酸性条件下利用 2-硝基苯甲醛衍生化, 乙酸乙酯提取, 正己烷去杂质后进行 ELISA分析。结果: 方法最低检测限为 013 Lg/kg, 向样品中添加浓度为 015、110和 310Lg/kg3个梯度标准品溶液时,平均回收率范围为 9017% ~ 9519%, RSD 为 4124% ~ 5142%。结论: 实验证明该方法适合养殖虾类中 AOZ残留筛选。

关键词：虾肉;呋喃唑酮代谢物;ELISA

一、前言

呋喃唑酮（FZD）,又名痢特灵,是一种广谱抗菌药物，属于硝基呋喃类药物，是人工合成的化学药。常被掺放在饲料中，用于水产品养殖传染病的预防与治疗[1]。药代动力学研究表明，呋喃唑酮在动物体内的代谢非常快，现已明确此类抗生素的原型在体内 4 d 后，就已完全分解成其代谢物，所以分析呋喃唑酮时，只能分析其代谢物[2]。经研究表明，呋喃唑酮的代谢物中有相当数量是以其完整侧链 3-氨基-2-恶唑烷酮即 AOZ 与蛋白结合的残留物形式存在, AOZ 进一步代谢可产生具致癌、致突变作用的羟乙基肼[3]，因此检测呋喃唑酮代谢物(AOZ)的残留更具有现实意义。呋喃唑酮在畜产品和水产品中的残留，通过食物链传递给人类,会使人体受到损害。另外,其作为人畜共用药，长期微量摄入易使人体产生抗药性，导致呋喃唑酮药物失去医疗功效[4]。

1990 年 7 月欧盟颁布 2377/90/EEC 条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为 A 类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为 1.0 μg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995 年起欧盟、日本、美国等都开始禁止这类抗菌剂在食用的畜禽及水产动物中使用，并严格执行对输入的食用鱼，虾及禽类进行残留检测[5]。同许多国家一样，我国农业部制订的 NY5070-2002《无公害食品水产品中鱼药残留限量》及 GB18406.4-2001《无公害水产品安全要求》规定，水产品中不得检出呋喃唑酮，同时禁 止在饲料中添加[6]。目前呋喃唑酮在食品中残留的监测方法主要有高效液相色谱法[7-8]、酶联免疫法[9]、分光光度法、原子吸收法[10]等，酶联免疫法已受到广泛重视。本试验主要 使用酶联免疫法对出口虾中呋喃唑酮代谢物AOZ 的残留做快速检测。

福建省诏安县海利水产有限公司，是一家集水产品加工、销售、研究、开发和养殖于一体的大型出口企业。该公司于2005年引进投建，厂房和生产布局按照《出口食品生产企业卫生注册登记管理规定》和美国FDA法规及欧盟指令进行设计建造，厂区占地面积八万平方米，全封闭配套中央空调的水产加工车间二万平方米，生产车间配套高效臭氧杀菌设施，制冷水机和大型制冰机等各种先进加工设备，冻库储存能力达6000吨，同时配套建设大型对虾养殖场及虾苗孵化场，拥有一支高素质员工队伍，年加工生产水产品15000吨以上，产品近二十种，主要有冻生虾、冻熟虾、冻面包虾、寿司虾、冻鱿鱼、冻罗非鱼等。公司秉承共同发展的目标，不断完善质量管理体系，执着追求品质,先后获得了《卫生注册证书》、《输美水产品HACCP验证证书》，2005年11月通过了BRC认证，2006年1月通过了ISO9001认证，2008年通过了欧盟相关质量认证，产品获得了国外消费者的肯定和喜欢，远销日本、美国、加拿大、墨西哥和香港等国家和地区，在国外赢得了市场。公司自建成投产以来，企业迅速发展壮大。

1材料与方法

1.1

样品

均来自福建省海利水产有限公司。

1.2

主要仪器及设备

MK3 型酶标仪: Thermo 公司；Scientz-10 型均质机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ALC.210.4 电子天平:ACCULAB；DRP-9082 型恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；4K15 型高速冷冻离心机：Sigma公司；HH-w600s 恒温水箱：山东鄄城新科教学仪器厂；MS1 Minishaker:IKA；1 000、200、20 μL 微量移液器：GILSON。

1.3

试剂与溶液

呋喃唑酮代谢产物-AOZ 试剂盒：北京望尔生物技术有限公司；灵敏度为 0.125 μg/kg，包括：AOZ 标准溶液（0、0.05、0.15、0.45、1.35、4.05 ng/mL）、浓缩缓冲液、浓缩提取/洗涤液、衍生试剂、浓缩酶标记物、底物溶液、反应终止液。正己烷，乙酸乙脂，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl。

1.4方法

1.4.1

样品处理

虾去头去壳，取可食用部分，制成均质物。

1.4.2

样品制备

1）称取 1 g 已均质的样品于 50 mL 离心管中，依次加入 4 mL 超纯水、1.5 mL 1 mol/L HCl，100 μL 衍生试剂，漩涡振荡 1 min。置 37 ℃的恒温培养箱中温育，静置过夜（约 16 h）。

2）加入 5 mL 原倍缓冲液，0.4 mL 1 mol/L NaOH，5 mL 乙酸乙酯，振荡混合约 1 min。

3）离心 10 min（3 000 r/min），取 2 mL 上清（乙酸乙酯层）至 10 mL 玻璃管中，于 50 ℃下氮气吹干。

4）于此玻璃管加入正己烷 1 mL，先将残留物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入 2 mL 原倍萃取/清洗液，振荡 1 min。

5）将玻璃试管置于 80℃～100℃热水浴中约 3min，以减少水相与有机相间的乳化现象。6）离心 10 min（3 000 r/min），吸去上层液（正己烷），弃掉，再吸取下层液（水层）备用。

1.4.3测定

1）将 AOZ 试剂盒从冰箱中拿出，回温至室温。

2）取出相应数量的微孔，各个标准液和待测样品各做 2 个平行样，做好记录。

3）于适当的微孔中分别加入 50 μL 标准溶液（0，0.05，0.15，0.45，1.35，4.05 ng/mL）。

4）于另外微孔中加入 50 μL 已完成前处理的样品溶液。

5）再于每一微孔中另再加入 100 μL 已稀释的酶标记物。

6）轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温（25 ℃）下避光静置温育 50 min。

7）微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗 3 次。

8）最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

9）于每一微孔中加入底物溶液 100 μL 后，轻敲盘子四周，使其充分混合。

10）于室温（25 ℃）下避光静置温育 30 min。

11）于每一微孔中加入 100 μL 反应终止液。

12）用酶标仪于波长 450 nm 下判读。

1.5

数据处理

1）计算（B/B0）×100 值。用样品和标准溶液吸光度值（B）除以零标准吸光度值（B0）再乘以 100。

2）以（B/B0）×100 值为纵坐标，以样品浓度的对数值为横坐标，做标准对数曲线。

3）根据每个样品的 B/B0值就可以从曲线上读出相对应样品的浓度

2结果

2.1

标准曲线的绘制

AOZ 标准品的 ELISA 检测结果见表 1。

2.4

试验过程中的注意事项

1）A回温试剂（20℃-24℃）。B恒温孵育，避免光线照射。

2）、将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。

3）加入50ul标准或处理好的样品液到各自的微孔中，每个孔加入样品或标准时注意更换移液器的吸头。

4)加入50ul酶标记物溶液（红帽）到每一个微孔底部，充分混合。

5)加入50ul抗体溶液（黑帽）到每一个微孔底部充分混合，在室温孵育1小时，覆盖上薄膜。

6)倒出孔中的流体将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250ul样品洗涤缓冲液充入孔中，重复两次。

7)加入100ul基质/发色剂到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15分钟。

8）加入100ul反应终止液到每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光值以空气为空白，必须在加入停止液后60分钟内读取吸光值。

9）试剂盒内容物要完全回稳后再进行操作，否则，会出现吸光值偏低或没有吸光值。

10）温浴时若室温太低或太高，请适当延长或缩短温浴时间，或直接在恒温培养箱中进行。

11）加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

12）加样和洗板过程中，要避免微孔间的相互污染。

13）整个试验过程中，勿使微孔干燥。

结论

本试验用酶联免疫法检测了海利水产有限公司中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留状况，结果表明绝大多数的水产品符合规定，只有极少数部分有残留。用酶联免疫法对虾肉呋喃唑酮代谢物 AOZ 残留进行测定，操作简易，不需要复杂的仪器设备，样品预处理简单，作为一种快速筛选手段，在食品工业中有着广阔的推广应用前景，尤其在水产品出口企业中，但酶联免疫试剂盒的价格将是最大的制约因素。

参考文献：

[1] 景立新,孙武平,杨钦德,等.分光光度法快速测定海虾中呋喃唑酮残留量[J].光谱实验室，2006(5)：547-549

[2] 周新,张欣祥,王磊,等.UPLC-MS/MS 测定鱼干中的呋喃唑酮代谢物[J].分析测试学报,2007,26(9):262-263

[3]许蓓,徐志祥,王凤侠,等.动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究[J].食品研究与开发,2007,28(12):145-148

[4]罗杰,李健.呋喃唑酮间接竞争 ELISA(ciELISA)检测法的建立[J].中国海洋大学学报,2005,3,35(20):213-218

[5]许春兰,院榕生,刘小根,等.酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的检测中的应用

[J].食品研究与开发,2007,28(5):124-126

[6]吴富忠, 欧阳立群.水产品中呋喃唑酮、呋喃西林药物残留的HPLC 法测定[J].中国卫生检验杂志,2006,16(7):812-813

[7]艾晓辉，刘长征，罗玉霜，等.水产品中呋喃唑酮含量的高效液相色谱检测法[J].淡水渔业，2003，33(1)：8-10

[8]于慧娟，蔡友穷，毕士川，等.高效液相色谱法测定水产品中呋喃唑酮的残留量[J].色谱，2005，23(1)：114

[9] 沈美罗,宋红波,耿雪冰，等.酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物 AOZ 的残留[J].水产学报，2006，30(4)：520-524

[10] 焦更生，曹会兰.原子吸收法间接测定呋喃唑酮[J].分析试验室,2006,25(8):88-90

第五篇：食品中玉米赤霉烯酮的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201913）

附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速检测

胶体金免疫层析法

(KJ201913)

1.范围

本标准规定了食品中玉米赤霉烯酮快速检测胶体金免疫层析法。

本标准适用玉米、小麦及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速筛选测定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（T线）与控制线（C线）颜色深浅的比较，对样品中玉米赤霉烯酮进行结果判定。

3.试剂及材料

除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T

6682规定的二级水。

3.1.试剂

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，体积比）。

3.1.3.稀释缓冲液（胶体金免疫层析检测试剂盒专用提取液或根据产品使用说明书配置）。

3.2.参考物质

玉米赤霉烯酮的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称

英文名称

CAS登录号

分子式

相对分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物质。

3.3.标准溶液的配制

3.3.1.标准储备液：称取适量标准品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成浓度为100

μg/mL的标准储备液。﹣18

℃避光保存，有效期6个月。

3.3.2.标准工作液：准确量取标准储备液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1个月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为玉米、小麦及其碾磨加工品。

4.仪器和设备

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋涡混合器。

4.3.离心机。

4.4.电子天平：感量为0.01

g。

5.环境条件

环境温度：20

℃～30

℃。

空气相对湿度：最佳测定湿度45

%～65

%。若湿度低于45

%，相应延长待测液-试纸条反应时间，以质控实验为准；若湿度为65

%～80

%，微孔与试纸条拆开后立即使用，避免微孔与试纸条长时间暴露在空气中受潮；避免在湿度80

%以上湿度进行实验。

6.分析步骤

6.1.试样制备

按GB

5491扦取的样品充分碾磨或粉碎混匀，过40目筛。

6.2.提取

准确称取试样5.0

g（精确至0.01

g）于50

mL离心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3

min，离心分层或静置分层，上清液备用。

准确移取0.8

mL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5

mL离心管中，加入25

μL上清液，混匀，待检。

6.3.测定步骤

依检验所需，取相应数量的金标微孔和试纸条，做好标记。吸取待检液200

μL于金标微孔中，抽吸至孔底的紫红色颗粒完全溶解，孵育10

min。将试纸条插入金标微孔中，反应3

min～5

min。

从金标微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。（若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。）

7.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。

7.1.空白试验

7.1.1.试剂空白试验：除不称取试样外，均按6.2和6.3所述步骤操作。

7.1.2.基质空白试验：准确称取空白试样，按6.2和6.3所述步骤操作。

7.2.阳性质控试验

准确称取玉米赤霉烯酮含量为60

μg/kg的质控样，按6.2和6.3步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60

μg/kg，按6.2和6.3步骤操作。

8.结果判定

通过对比控制C线和检测T线的颜色深浅进行结果判定。

8.1.无效结果

无论样品中有无玉米赤霉烯酮存在，控制C线均会出现一条紫红色条带。若C线未显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效（见图1）。

无效

图1

试纸条目视判定图

8.2.阳性结果

控制C线显色，检测T线显色比C线浅或者没有颜色，判定为阳性（见图2）。

8.3.阴性结果

控制C线显色，检测T线显色比C线深或者一致，判定为阴性（见图2）。

比色法

图2

试纸条目视判定图

8.4.质控试验要求

空白试验结果应为阴性，阳性质控试验结果应为阳性。

第二法

消线法

9.原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的玉米赤霉烯酮经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上的抗原结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过T线显色与否进行结果判定。

10.试剂及材料

同3。

11.仪器和设备

同4。

12.环境条件

环境温度：10

℃～40

℃。

空气相对湿度：同5。

13.分析步骤

13.1.试样制备

同6.1。

13.2.提取

准确称取试样5.0

g（精确至0.01

g）于50

mL离心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋涡混合器振荡3

min，离心分层或静置分层，上清液备用。

准确移取400

μL稀释缓冲液（3.1.3）于1.5

mL离心管中，加入上清液(小麦50

μL，玉米80

μL），混匀，待测。

13.3.测定步骤

同6.3。

14.质控试验

每批样品应同时进行空白试验和阳性质控试验，可根据检测样品量制定适宜频次的质控试验。

14.1.空白试验

14.1.1.试剂空白试验：除不称取试样外，均按13.2和13.3所述步骤操作。

14.1.2.基质空白试验：准确称取空白试样，按13.2和13.3所述步骤操作。

14.2.阳性质控试验

准确称取玉米赤霉烯酮含量为60

μg/kg的质控样，按13.2和13.3步骤操作。或准确称取空白试样，加入一定体积的玉米赤霉烯酮标准工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量为60

μg/kg，按13.2和13.3步骤操作。

15.结果判定

通过观察检测T线显色与否进行结果判定。

15.1.无效

同8.1

15.2.阳性结果

控制C线显色，检测T线不显色，判定为阳性（见图3）。

15.3.阴性结果

控制C线显色，检测T线显色，判定为阴性（见图3）。

消线法

图3

试纸条目视判定图

16.质控试验要求

同8.4

第三法

读数仪法

17.具体检测步骤及结果判定可参考相应的说明书操作，质控试验参照第一法与第二法。

18.结论

本方法筛查出的阳性样品进行确认时，应按GB

2761指定方法标准检测并判定。

19.性能指标

19.1.检出限

μg/kg。

19.2.灵敏度

灵敏度≥95%。

19.3.特异性

特异性≥90%。

19.4.假阴性

假阴性≤5%。

19.5.假阳性

假阳性≤10%。

注：性能指标计算方法见附录A。

20.其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。

本方法参比标准为GB

5009.209-2016

食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定。

附录A

快速检测方法性能指标计算表

样品情况a

检测结果b

总数

阳性

阴性

阳性

N11

N12

N1.=N11+N12

阴性

N21

N22

N2.=N21+N22

总数

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

显著性差异（c2）

c2=（½N12-N21½-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

灵敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特异性（p-，%）

p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a样品中实际的公议值结果；

b由玉米赤霉烯酮胶体金试纸条检验方法得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法起草单位：成都市食品药品检验研究院。

本方法参与单位：江南大学、国家粮食局科学研究院、广东省食品检验所、山东省食品药品检验研究院、浙江省食品药品检验研究院。

本方法主要起草人：肖全伟、姚蕾珺、王昕、张敏、胥传来、田洪芸、沈泓、周露