第一篇:植物细胞大规模培养生产次生物质的最新研究进展和产业化现状
植物细胞大规模培养生产次生物质的最新研究进展和
产业化现状
摘要:本文将对植物的大规模培养生产次生物质的最新研究进展及产业化现状进行简要介绍。
关键词:植物细胞培养;次生物质;研究进展;产业化现状
1.引言
植物组织细胞培养技术是应用生物工程研究成果,在细胞水平上生产植物生物制品的技术。自从TalⅪta M.由紫草细胞培养提取出紫草宁成为第一个植物细胞培养技术商品至今,国内外动、植物细胞大规模培养研究很快遍布各个医药领域。植物的次级代谢产物是药物和一些工业原料的重要资源,其中许多是难以人工合成但具有显著药用或经济价值的特殊物质。该技术尤其适合于资源短缺、采集困难、种植要求高的名贵药材。运用植物细胞培养技术研制与开发现代天然产物是当今国际细胞培养技术产业化的热点问题和主要发展方向之一,也是我国实现中药现代化,开创低成本、高产出、无污染的工业化生产天然植物药的新路子。
2、植物次生代谢产物植物次生代谢产物是植物对环境的一种适应,是在长期进化过程中植物与生物和非生物因素相互作用的结果。在对环境胁迫的适应、植物与植物之间的相互竞争和协同进化、植物对昆虫的危害、草食性动物的采食及病原微生物的侵袭等过程的防御中起着重要作用。
次生代谢过程被认为是植物在长期进化中对生态环境适应的结果,它在处理植物与生态环境的关系中充当着重要的角色。许多植物在受到病原微生物的侵染后,产生并大量积累次生代谢产物,以增强自身的免疫力和抵抗力。植物次生代谢途径是高度分支的途径,这些途径在植物体内或细胞中并不全部开放,而是定位于某一器官、组织、细胞或细胞器中并受到独立的调控。
它们是细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子化合物,其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。3.通过植物细胞培养获取次生代谢产物的研究历史
4自1902 年Haberlant 预言高等植物细胞具有全能性以来, 植物细胞培养开
始被用于研究植物的生物合成。用细胞悬浮培养来研究植物代谢物的合成和生产, 是50 年代末期才开展起来的工作。1956 年Routie 让和Nickel l首次提出用植物
细胞培养技术生产有用的次生物质。steward 和shantzv 1956 年进行胡萝卜根愈
伤组织的液体培养, 发现其游离组织和小细胞团的悬浮液可以进行长期继代培
养, 并于1958 年以胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整的小植株。日本人借助
于他们在发酵技术上的优势, 曾努力把这一技术应用于植物次生代谢物质的商
业性生产。1982 年, 在日本召开的第五届国际植物组织和细胞培养会议上, 372
篇论文中大约有70 篇是关于植物细胞培养生产次生物质方面的报告, 有几篇是
关于它们在商业上应用的可行性研究报告.1975-1985年间用于促进细胞生长和产
物形成的方法开始有所进展。1985 年T abata和Fujita 将提高产量的多种方法相
结合实现了第一次商业性的植物细胞培养。随后, 人们在植物细胞培养次生代榭
物的产生动力学和复抗的累积杖式方面做了大量研究。Heike Dor nen bu g 和
Dietrich Knor : 等人在1997 年设计出了适用于植物细胞培的特殊加工方法, 它
包括固定化, 体内产物分离提取和连续操作。目前, 植物细胞培养生产植物次生
代谢产物已发展到全自动控制的大容积发酵罐大规模工业生产的连续培养。4.植物细胞培养生产次生产物的研究进展
植物细胞培养始于本世纪初, 并不可争议地具有工业化潜力。目前植物细胞
培养生产的化合物很多, 包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物
碱等初生和次生代谢产物, 植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面: 有用物
质(次生代谢产物)的生产;植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选;植物细胞
遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产, 迫切需要进一步研究和发
展细胞培养条件的优化控制及其工艺。目前, 世界上众多研究工作集中在优化细
胞培养环境、改变细胞特性、选用高产细胞系、改善生物反应器、提高目标产物的产率并保证其生产稳定性上。
4.1、植物细胞培养的特性
(1)植物细胞较微生物细胞大得多,有纤维素细胞壁.细胞耐拉不耐扭,抵抗
剪切力差;(2)培养过程生长速度缓慢,易受微生物污染,需用抗生素;(3)
细胞生长的中期及对数期.易凝聚为直径达350JJm一400Pm的团块,悬浮培
养较难;(4)培养时需供氧,培养液粘度大:(5)具有群体效应;(6)因
为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内,产量较低;(7)细胞培养过程有结
构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内浓度;(8)悬
浮培养中要求有一定的细胞浓度,否则不生长(25000~50000个/ML)。
4.2、高产细胞系筛选
近几十年来, 利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究取得了飞速发
展, 人们已经对1 000多种植物进行过细胞培养方面的研究, 从培养细胞中分离
得到600多种次生代谢产物, 有的已经成为药品投放市场.利用植物细胞培养技
术生产次生代谢产物的关键步骤就是高产稳定细胞系的获得, 因此, 利用植物
细胞的变异性, 采取各种手段反复不断地筛选出高产稳定的细胞系, 对通过细
胞培养生产次生代谢产物具有重要意义.一个具有高产性能的细胞系的从头筛
选, 除了整个过程培养条件的优化之外, 还应满足下列条件:
1)有足够的变异源细胞群;2)可成功进行单细胞克隆;3)有简单、快捷、灵
敏的产物分析方法;4)能进行细胞系稳定性试验[ 2].高产细胞系的筛选有很
多不同的方法, 如目视法、单细胞克隆法、小细胞团法、抗性筛选法、负筛选法
以及原生质培养法等.到目前为止, 已在很多植物培养细胞中筛选到具有高产
次生代谢产物特性的细胞系.高产细胞系筛选一般遵循以下思路进行
外植体
↓
愈伤组织小细胞团法
↙↘↑悬浮培养平板培养 → 小细胞团
↓
单细胞诱变处理抗性筛选法
↓
原生质体原生质体培养
筛选植物高产细胞系常用的方法有目视法、放射免疫法(R IA)、酶联免疫
法(EL IA)、高效液相色谱法(HPLC)等。目前国外还采用一种突变种筛选法, 其
原理是把一些细胞毒性抑制剂如p-氟苯丙氨酸(PFP)、5-甲基色氨酸、草苷磷、维生素H 等加入到要筛选的细胞培养体系中, 那些耐药性强且经过一段时间培
养生长正常的细胞系就可能是所要求的高产细胞系。例如从观赏辣椒提取辣椒素
和牛舌草提取迷迭香酸的细胞系筛选就应用了PFP并获得成功。
4.3、生物反应器
自从1960 年Tuleche 和Nickel 首次报道在134 L 生物反应器中成功培养
不同植物种类以来, 利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产
提供了有效生产途径和生产方法。近几年在这方面也取得了较大的发展,如日本的三井石油化学公司采用750 L 搅拌式反应器二步法培养紫草细胞, 实现了紫
草宁的工业化生产(Noguchi et al , 1977);Ulbrich 等(1985)分别用气升
式及搅拌式反应器二步法大量生产迷迭香酸(rosmarinic acid);而Schiel 等
(1984)利用批式进料技术生产显著提高了肉桂酰丁二胺(cinnamoyl
putrescines)在细胞中的积累。用于植物细胞培养的生物反应器是从培养微生物细胞反应器改进、发展而来的, 具有独特的特点。
细胞自由培养:当前使用的反应器主要有搅拌式(STR)、气升式(air_lift)、鼓泡式(bubble colum)、转鼓式(rotating drum)
细胞固定化培养:根据载体的不同, 可将反应器类型主要分为胶粒固定反应器(gel_entrapped cell reactor)和膜反应器(membranereactor)
植物细胞培养技术生产次生代谢物的增产策略。
5.植物细胞培养生产次生产物工业化现状
目前利用植物细胞大规模培养生产次生代谢产物的工作已经取得很大进展。经过对多种植物细胞培养的验证试验,植物组织或细胞培养物经过筛选,就有可能生产几倍于其完整植株所产生的次生代谢产物,而且可以减少占用土地,不受季节、地域等环境的限制,还可排除病虫害的干扰。但目前仍存在一些需要进一步研究和解决的问题:
5.1植物细胞培养需要解决的问题
(1)氧和二氧化碳的控制,过多氧过少氧均不利于生长;(2)营养物的供应;(3)细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化(4)培养过程中细胞的分化的防止,(5)细胞取得中微生物的去除;(6)细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小;
5.2.植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题
(1).悬浮培养系统必须适应植物细胞特性(2).植物细胞培养液的流变特性(3).植物细胞培养过程中的气体调节(4).泡沫和表面粘附性(5)、剪切力对植物细胞的影响
6.展望
植物细胞培养中次生代谢物的产生被认为是生化水平上的分化过程, 而且取决于环境条件和培养材料的基因型。利用细胞培养技术商业化生产次生产物将主要取决于增加产物产量和缩短发酵时间的策略。目前提高产物含量的方法多是经验性的, 今后应重视以下几方面的研究:
(1)、生产培养基的开发, 目前使用的培养基多为培养物生长而设计的, 对次生代谢物的合成不一定合适。通过调节培养基组分,可以开发出适于次生代谢物合戌的生产培养基。
(2)、发展高产细胞株的选择技术, 以缩短选择高产细胞株的时间。Cocking等提出采用荧光激活细胞分选术选择植物细胞, 以获得高产细胞株。
(3)、植物细胞或关键酶的固相化。利用固相化植物细胞或酶进行次生代谢物的生物合成和生物转化, 以提高生产率。
(4)、代谢途径的调节。通过操作培养植物细胞次生代谢的表达, 可以提高产量, 促进产物释放到培养基中, 通过代谢途径的修饰进行新化合物的合成和转化。
(5)、利用真菌诱发因子诱导或刺激植物细胞培养物次生代谢物的合成。
(6)、利用悬浮培养细胞产生的中间代谢物, 经过化学或酶学方法处理获得所需的最终产物, 以缩短生产时间。
随着对培养植物细胞的生理、生化和遗传特性的深入了解, 以及提高产物产量方法的发展, 利用植物细胞培养技术商业化生产天然产物必将在工业中得到广泛的应用, 并获得巨大的经济效益。